CN113061538A - 一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用 - Google Patents

一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用，属于基因工程领域。本发明所述的表达系统时基于硝酸盐还原酶启动子受硝酸盐诱导铵盐抑制的特性。在此基础上表征了其自诱导的特征。各实验结果充分说明基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导构巢曲霉表达系统能够进行自诱导表达，丰富了构巢曲霉的表达系统形式，培养方式操作简单，在构建蛋白表达系统方面有巨大的应用空间。

Description

一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用
技术领域
本发明涉及一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
目前微生物表达系统主要有细菌，酵母，丝状真菌表达系统。细菌表达系统具有生长快，背景清晰等优势，但是，细菌中不存在翻译后修饰系统，表达真核来源的蛋白容易产生无活性的包涵体；酵母表达系统是一种真核表达系统，有翻译后修饰系统，但是不完善，容易发生过度糖基化；丝状真菌表达系统具有完善蛋白质修饰系统，其更接近高等生物。
构巢曲霉作为一种丝状真菌模式菌株，主要有两种表达方式，组成型和诱导型表达，经常使用组成型强启动子PgpdA，乙醇诱导型启动子PalcA进行异源蛋白的表达。由于构巢曲霉属于食品安全菌株，其作为一种重要的目的蛋白表达系统，在工业生产中得到广泛应用。
但是，目前在构建构巢曲霉表达系统进行目的基因的表达时，往往需要通过更换培养基或者其他方式，在菌株的生长过程中额外的添加诱导剂或者其他生长因子，导致该表达系统无法实现自诱导，在工业生产中的应用受阻。
例如公开于Resistance Gene-Guided Genome Mining:Serial PromoterExchanges in Aspergillus nidulans Reveal the Biosynthetic Pathway forFellutamide B,a Proteasome Inhibitor和An Efficient System for HeterologousExpression of Secondary Metabolite Genes in Aspergillus nidulan文章中的采用构巢曲霉表达系统诱导生产次级代谢物时，都是直接进行诱导表达，而未实现自诱导表达。
又如，公开号为CN108795970A的中国发明专利申请文件中，采用其构建的构巢曲霉表达系统进行漆酶的生产时，培养周期为4天，并且在培养48小时后需要添加终浓度为0.2-0.5mM的CuSO4进行诱导；可见目前所构建的构巢曲霉表达系统不仅周期长，在生产过程中，需要额外的添加诱导剂，这使得生产工艺复杂，增加了生产成本，不利于大规模的工业应用。
近年来，自诱导表达模式的研究已经在细菌表达体系中展开。利用甘露糖操纵子上的启动子构建了前期受葡萄糖抑制后期受甘露糖诱导的高密度自诱导表达系统，提高了蛋白的表达量。这为我们在构建智能型构巢曲霉表达系统提供了思路。
虽然构巢曲霉培养简单，生长快，基因操作方法容易，具有完善的蛋白质修饰系统。但是，与细菌和酵母表达系统相比，曲霉表达系统研究起步较晚，还存在很大的差距。例如，曲霉表达系统中存在可选择的表达载体较少，表达模式单一，质粒不能稳定遗传等缺陷，无法满足更高的蛋白表达的需求。因此，开发一种低培养成本，操作简单的新型构巢曲霉自诱导表达体系是非常必要的。
发明内容
技术问题
本发明要解决的技术问题是：构建一种无需在培养中间阶段额外添加诱导剂或更换培养基，即可实现目的基因的表达的自诱导型构巢曲霉表达系统，即：构建一种生产周期短、生产成本低并且生产工艺简单的构巢曲霉表达系统，以实现构巢曲霉在工业上大规模的应用。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明课题组基于以下的原理：由于构巢曲霉氮代谢调控中主要有三个基因，分别是硝酸盐转运蛋白(crnA)，硝酸盐还原酶(niaD)，亚硝酸盐还原酶(niiA)。三种基因转录均受硝酸盐诱导，铵盐抑制的正负调控。在NH4 +存在时，通过抑制转录调控因子AreA的活性，使转录激活因子NirA不能发挥功能，基因转录被抑制；在只存在NO3 -时，转录激活因子NirA被激活并与转录调控因子Are相互作用激活基因转录；因此，在同时存在NH4 +/NO3 -时，构巢曲霉首先利用NH4 +，NH4 +进入细胞后激活调控因子NmrA，NmrA抑制AreA的活性，无活性的AreA不能起始基因转录；随着发酵时间延长，NH4 +被消耗到一定程度，构巢曲霉开始利用NO3 -，NO3 -进入细胞后激活转录调控因子NirA，与有活性的AreA相互作用，激活基因转录，开始诱导蛋白表达(如图1所示)。
发明人课题组以niaD基因的启动子为调控元件构建高效且严密响应NO3 -/NH4 +信号的智能型表达系统。该系统在培养前期利用NH4 +进行菌体生长，随着NH4 +的消耗自动转换为利用NO3 -生长并诱导蛋白表达。该系统以无机氮硝酸盐为诱导剂，价格低廉且无毒，降低了培养成本，而且可以实现自诱导，不用中间添加诱导剂，减少操作步骤。该系统氮源的切换相对与碳源的改变对于菌体的表型改变影响较小。
本发明提供了一种构巢曲霉自诱导表达系统，所述表达系统包括表达载体和宿主细胞；所述表达载体为：过表达了鸟氨酸氨甲酰基转移酶argB的pUC19质粒，所述表达载体还含有PniaD启动子过表达目的基因，所述PniaD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述宿主细胞为构巢曲霉。
在本发明的一种实施方式中，所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为构巢曲霉ABPU1。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于：葡萄糖醛缩酶、过氧化氢酶、β-1，4-内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述葡萄糖醛缩酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述过氧化氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述β-内切葡聚糖酶的Gene bank登录号为：AB009402.1。
在本发明的一种实施方式中，所述纤维二糖水解酶的Gene bank登录号为：AF420019.1。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体中的目的基因和N-乙酰谷氨酸激酶之间连接有终止子TtrpC。
本发明还提供了一种采用构巢曲霉生产目的基因的方法，所述方法为，将连接了目的基因的上述构巢曲霉自诱导表达系统划线至种子培养基中进行培养，制备得到种子液，将种子液添加至含有诱导剂的发酵培养基中，发酵生产目的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂为NH4 +和或NO3 -。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂为NO3 -。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂为NO3 -和NH4 +按照20：3～10的比例添加至发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中需同时添加0.6g/L尿苷，0.4mg/L吡哆醇，0.4mg/L生物素。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液的制备方法为：将所述构巢曲霉自诱导表达系统划线至种子培养基中进行培养，制备得到孢子，采用孢悬液清洗孢子，静置，取上层游离孢子，制备得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基：20g/L葡萄糖，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶。
种子培养基：20g/L葡萄糖，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶，0.52g/L酒石酸铵，2％琼脂粉。
微量元素：50g/L乙二胺四乙酸二钠，22g/L七水硫酸锌，11.4g/L硼酸，5.06g/L四水氯化锰，4.99g/L七水硫酸亚铁，1.61g/L六水氯化钴，1.57g/L无水硫酸铜，1.1g/L钼酸铵。
本发明还提供了上述构巢曲霉自诱导表达系统，或上述方法在制备含有目的基因的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明构建了基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导型构巢曲霉表达系统，该系统能够前期受NH4 +抑制，后期受NO3 -激活的自诱导表达。该系统灵活、智能能够实现氮源的自动切换，无需在培养过程中更换诱导培养基和额外添加诱导剂，减少操作步骤，减少染菌概率。构巢曲霉生长速度快，发酵周期短，因此在高效表达蛋白研究中具有广泛的应用前景。
(2)采用本发明构建的构巢曲霉自诱导表达系统，以GUS蛋白为例，在纯NO3 -培养基中，在6h时被诱导表达，随着时间延长酶活逐渐升高32h时酶活不再增加；在NH4 +/NO3 -培养时，在8h之后GUS蛋白被诱导表达，比纯NO3 -培养是诱导时间晚2h，之后随着时间延长酶活逐渐增加；可见GUS蛋白被自诱导表达，并且在36h以内即可达到酶活的最高值。
(3)采用本发明构建的构巢曲霉自诱导表达系统，以过氧化氢酶catB作为目的基因时，在纯NO3 -培养基中，在8h时被诱导表达，随着时间延长酶活逐渐升高；在NO3 -/NH4 +培养时，在12h时catB有明显酶活，之后随着时间延长酶活逐渐增加。所有培养条件按对重组CatB菌株的生长没有明显的影响。构建的基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导表达系统可以用作蛋白的自诱导表达，并且在48小时以内即可达到酶活的最高值。
附图说明
图1：构巢曲霉自诱导表达系统自诱导示意图。
图2：构巢曲霉自诱导表达系统自诱导表征，a：三种培养条件下GUS蛋白酶活图；b：三种培养条件下菌体生长图。
图3：CatB酶在构巢曲霉自诱导表达系统过表达，a：五种培养条件下CatB蛋白酶活图；b：五种培养条件下菌体生长图；c：12h聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4：mCherry在构巢曲霉自诱导表达系统表达，a：硝酸盐条件下荧光；b：铵盐条件下荧光。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的构巢曲霉ABPU1菌株为构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)的鸟氨酸氨甲酰转移酶基因缺损株ABPU1，公开于“The Aspergillus nidulansgenes chsA and chsD encode chitin synthases which have redundant functions inconidia formation”文章中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
GMM培养基：10g/L葡萄糖，6g/L硝酸钠，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶，固体加2％琼脂粉。
上层培养基：342.3g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，6g/L硝酸钠，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶，固体加0.75％琼脂粉。
下层培养基：342.3g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，6g/L硝酸钠，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶，固体加1.5％琼脂粉。
微量元素：50g/L乙二胺四乙酸二钠，22g/L七水硫酸锌，11.4g/L硼酸，5.06g/L四水氯化锰，4.99g/L七水硫酸亚铁，1.61g/L六水氯化钴，1.57g/L无水硫酸铜，1.1g/L钼酸铵。
发酵培养基：20g/L葡萄糖，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶。
种子培养基为：20g/L葡萄糖，0.52g/L氯化钾，0.52g/L七水硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，2mL微量元素，0.5g/L尿嘧啶，0.52g/L酒石酸铵，2％琼脂粉。
下述实施例中所涉及的溶液配制方法如下：
1M Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100mL水中。
1M NaH2PO4溶液：15.601g NaH2PO4溶于100mL水中。
0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)：取1M Na2HPO4 5.77mL，1M NaH2PO4 4.23mL，定容止100mL。
10％SDS溶液：将90mL水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，然后加水至100mL。
0.5M EDTA(pH 8.0)：在80mL水中加入18.61g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0,溶解后定容止100mL。
蛋白提取液：0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)取50mL；10％SDS取1mL；0.5M EDTA(pH8.0)取2mL；TritonX-100取100μL，β-巯基乙醇100μL；用水定容至100mL。
4-MUG底物：称8.8mg MUG，溶于蛋白提取液中，配制成2mM的工作浓度。
孢悬液：0.85％NaCL，0.02％Tween 80。
原生质体缓冲液：10mM NaH2PO4，0.8M NaCL，调节PH为6.0。
S3：0.4M硫酸铵，1％蔗糖，50mM柠檬酸一水。
S4：25％PEG8000，100mM氯化钙，0.6M氯化钾，10mM Tris，盐酸调PH为7.5。
S5：0.6M氯化钾，50mM氯化钙，10mM MoPs，氢氧化钾调PH为6.0。
下述实施例中所涉及的酶活检测方法如下：
葡萄糖醛酸酶(gus)酶活测定方法：真空抽滤收集菌丝体，称取0.1菌体于2mL离心管中，加入3颗研磨珠，1mL蛋白提取液，冷冻研磨破碎，离心，取上清，上清即为粗酶液。在96孔酶标板小孔内反应，加100μL的4-MUG底物，99μL缓冲液在37℃放置5min，然后加1μL合适稀释倍数的粗酶液，迅速放入酶标仪中，设置条件37℃，激发波长365nm，发射波长455nm，每隔5min读数一次，总计60min。
酶活定义为：37℃，2mM的4-MUG底物条件下，每分钟每毫克蛋白产生1pm的4-MU所需的酶量为1mU。
过氧化氢酶(catB)酶活测定方法：粗酶液提取方法同GUS蛋白。在96孔酶标板小孔内反应，加100μL的0.1％H2O2，90μL缓冲液在30℃放置5min，然后加10μL合适稀释倍数的粗酶液，迅速放入酶标仪中，设置条件30℃，检测波长240nm，每隔30s读数一次，总计10min。
酶活定义为：30℃，0.1％H2O2底物条件下，每秒钟读数降低0.01所需的酶量为1U。
实施例1：重组质粒的构建
具体步骤如下：
(1)启动子PniaD序列的获得
以构巢曲霉基因组为模板用KOD聚合酶进行PCR获得PniaD序列(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)，PCR程序为：预变性94℃3min，循环为变性98℃15s，退火55℃30s，延伸68℃1kb/min，共32个循环，最后68℃延伸10min。
(2)PnrtA-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒的获得
PnrtA-gusA-TtrpC-argB2-pUC19来自文献“Characterization of the promoterof the nitrate transporter-encoding gene nrtA in Aspergillus nidulans”，本发明的PnrtA-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒同论文当中的PnrtA-uidA-TtrpC-argB2-pUC19质粒是完全相同的，其中，葡萄糖醛酸酶可以缩写为uidA或本文的gusA，两者是完全相同的。
后续本发明以gusA表述。
(3)PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒的获得
利用反向PCR的方法以PnrtA-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒为模板获得质粒骨架，之后通过DpnI消化、纯化和组装、转化等一系列手段构建出PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒，所用引物列于表1，具体步骤如下：
以PnrtA-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒为模板，用Prime STAR MAX DNA聚合酶进行全质粒PCR，获得质粒骨架，PCR程序为：预变性98℃1min，循环为变性98℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1.5min，共34个循环，最后72℃延伸10min。之后用限制性内切酶DpnI消化去除质粒模板，将PCR产物纯化。之后用Infusion重组方法将PniaD片段和骨架组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过提取，测序，验证正确之后，即为制备得到的PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒。
(4)PniaD-catB-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒的构建
从构巢曲霉基因组中扩增获得catB编码区序列，利用反向PCR的方法以PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒为模板获得质粒骨架，之后通过DpnI消化、纯化和组装、转化等一系列手段构建出PniaD-catB-TtrpC-argB2-pUC19，所用引物列于表1，具体步骤如下：
PniaD-catB-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒在PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒基础上进行构建，以构巢曲霉基因组为模板用KOD聚合酶进行PCR获得catB基因序列，PCR程序为同上；以PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒为模板，用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶进行全质粒PCR，获得质粒骨架，PCR程序同上。之后用限制性内切酶DpnI消化去除质粒模板，将PCR产物纯化。之后用Infusion重组方法将catB片段和质粒骨架组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过提取，测序，验证正确之后，即为制备得到的PniaD-catB-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒。
(5)PniaD-mCherry-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒的构建
化学合成核苷酸序列核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的mCherry编码区序列，利用反向PCR的方法以PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19质粒为模板获得质粒骨架，之后通过DpnI消化、纯化和组装、转化等一系列手段构建出PniaD-mCherry-TtrpC-argB2-pUC19，所用引物列于表1；具体步骤如下：
PniaD-mCherry-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒在PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒基础上进行构建，从含有mCherry的质粒中，用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶扩增获得mCherry编码区序列，PCR程序为同上；以PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒为模板，用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶进行全质粒PCR，获得质粒骨架，PCR程序同上。之后用限制性内切酶DpnI消化去除质粒模板，将PCR产物纯化。之后用Infusion重组方法将mCherry片段和质粒骨架组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞经过提取，测序，验证正确之后，即为制备得到的PniaD-mCherry-TtrpC-argB2-pUC19表达质粒。
表1引物列表
Figure BDA0002988905300000071
Figure BDA0002988905300000081
实施例2：自诱导表达系统的构建
具体步骤如下：
(1)宿主的培养
平板划线构巢曲霉ABPU1，37℃培养2天孢悬液洗孢子到10mL离心管，静置5min，取上层游离孢子。取1mL孢子悬液加入培养基中，37℃，220rpm培养7h左右，镜检。7000rpm离心收集菌体。将所有发芽孢子加入过滤除菌的30mL的裂解酶液中(90mg Yatalase，9mglysing enzyme，48mg BSA，溶解于原生质体缓冲液中)。30℃裂解2h，先220rpm 30min，再180rpm 90min。6000rpm，4℃离心10min收集原生质体。弃上清，加40mL S3重悬。6000rpm，4℃离心10min收集原生质体。
重复步骤(弃上清，加40mL S3重悬。6000rpm，4℃离心10min收集原生质体)，弃上清。700μL S5重悬。
(2)重组菌的构建
分别将实施例1制备得到的质粒加入到步骤(1)新制的原生质体中，轻轻混匀，冰浴5min。加入50μL S 4，轻轻混匀，冰浴20min。加入1mL S4，轻轻混匀，室温20min，得到转化液；
将所有转化液加入到8mL上层培养基中，混匀，倒入含有下层培养基的平板上，37℃培养4天。
分别制备得到构巢曲霉重组菌株：ABPU1/PniaD-gusA-TtrpC-argB2-pUC19，ABPU1/PniaD-catB-TtrpC-argB2-pUC19，ABPU1/PniaD-mCherry-TtrpC-argB2-pUC19，分别命名为：A.n-GUS，A.n-CatB和A.n-mCherry。
实施例3：自诱导表达系统的表征
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的A.n-GUS划线至种子培养基中，在37℃条件下培养48h，孢悬液洗孢子到10mL离心管，静置5min，取上层游离孢子，获得种子液；
(2)将种子液按照5×106个孢子/mL添加至发酵培养基中，同时添加0.6g.L-1尿苷，0.4mg.L-1吡哆醇，0.4mg.L-1生物素，在NO3 -/NH4 +分别20mM/0mM，20mM/5mM，0mM/20mM的条件下37℃，220rpm进行发酵培养。
分别在4h，6h，8h，10h，12h，16h，20h，28h，32h，36h进行取样检测酶活以及干重；结果如表2和表3所示：
表2：重组菌在不同的诱导剂，及不同时间条件下的酶活
Figure BDA0002988905300000091
酶活检测结果显示，在纯NH4 +的培养中，GUS蛋白一直处于较低的水平，
纯NO3 -培养基中，在6h时被诱导表达，随着时间延长酶活逐渐升高32h时酶活不再增加，在NH4 +/NO3 -培养时，在8h之后GUS蛋白被诱导表达，比纯NO3 -培养是诱导时间晚2h，之后随着时间延长酶活逐渐增加。
证明采用本发明的技术方案，无需在发酵过程中额外添加诱导剂即可实现GUS蛋白的自诱导表达。
表3：重组菌在不同的诱导剂，及不同时间条件下的菌体干重
Figure BDA0002988905300000092
Figure BDA0002988905300000101
三种培养条件下，NH4 +/NO3 -培养是菌生长相对较好(如图2所示)。
实施例4：过氧化氢酶自诱导表达
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的构巢曲霉A.n-CatB划线至种子培养基中，在37℃条件下培养48h，孢悬液洗孢子到10mL离心管，静置5min，取上层游离孢子，获得种子液；
(2)将种子液按照5×106个孢子/mL添加至发酵培养基中，同时添加0.6g.L-1尿苷，0.4mg.L-1吡哆醇，0.4mg.L-1生物素，在NO3 -/NH4 +分别20mM/0mM，20mM/3mM，20mM/5mM，20mM/10mM，0mM/20mM的条件下37℃，220rpm进行发酵培养。
分别在8h，12h，16h，24h，48h进行取样检测酶活以及干重；结果如表4和表5所示：
表4：重组菌在不同的诱导剂，及不同时间条件下的酶活及菌体干重
Figure BDA0002988905300000102
表5：重组菌在不同的诱导剂，及不同时间条件下的菌体干重
Figure BDA0002988905300000103
Figure BDA0002988905300000111
酶活测定结果显示，在纯20mM NH4 +的培养中，CatB蛋白一直处于较低的水平，20mMNO3 -培养基中，在8h时被诱导表达，随着时间延长酶活逐渐升高，在NO3 -/NH4 +培养时，在12h时catB有明显酶活，之后随着时间延长酶活逐渐增加。
NO3 -/NH4 +培养时蛋白诱导时间推迟，基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导表达系统能够使CatB蛋白进行自诱导表达。
所有培养条件按对重组CatB菌株的生长没有明显的影响。此外，将12h的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示在NO3 -以及NO3 -/NH4 +培养条件下，CatB有明显的表达，NH4 +培养条件下无明显表达。
综上，构建的基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导表达系统可以用作蛋白的自诱导表达(如图3所示)。
实施例5：红色荧光蛋白的表达
将实施例2制备得到的构巢曲霉A.n-mCherry分别划线至种子含10mM硝酸钠和5mM的酒石酸铵的GMM固体培养基中，在37℃条件下培养48h，牙签取适量孢子于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察荧光(图4)。
结果分析：在10mM硝酸盐的条件下，有明显的红色荧光，mCherry被诱导表达；在10mM铵盐条件下，无明显的红色荧光，mCherry被抑制表达。该表达系统受硝酸盐诱导和铵盐抑制的严密调控。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用
<130> BAA210167A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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acgccacgag aaacgggggt ttaggatctg gagtgtggct agagccgctt gacgataatg 300
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tggcttcgat gcactgcctg aatttccgcg gagttgggct ggagatcgaa tgatgatatt 420
tgggaagtct ggccacggct cagggcagcg ttctgattgg gcataatggt gccatgatct 480
accgccttct tcccaccaga gataagagat tccgaggctc tgattggaca gtgaatcaac 540
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agcgccggtg aaatcactta aatattacat cgactgtgag taatagccat tgatcatatt 660
ctggacagtt cccagttccc ggaacattca ggatcgcgta ggtggcagca gtgactgtac 720
actatgagcg gactcctacc cagatacgct cacgccataa ccctattgcc actagatgac 780
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aattactgta tatagtactg gtcagggcta gcacttgcag ccggttcgcg gcccgcggag 900
atggagccct gaagtggatc gtaggatcca gcatattgcc tgctgtcctt agaattagaa 960
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<212> PRT
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Pro Ser Glu Phe Ala Thr Leu Val Arg Asn Ala Ser Ser His Lys
85 90 95
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Leu Gly Lys Thr Val Ala Met Ile Phe Ser Lys Arg Ser Thr Arg Thr
115 120 125
Arg Val Ser Thr Glu Gly Ala Val Val Gln Met Gly Gly His Pro Met
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Phe Leu Gly Lys Asp Asp Ile Gln Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Tyr
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Val Gly Lys His Ala Glu Val Ala Asp Leu Ala Lys His Ser Ser Val
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Pro Val Ile Asn Ala Leu Cys Asp Ser Phe His Pro Leu Gln Ala Val
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Leu Ser Ser Leu Gly Leu Glu Gly Leu Lys Ile Ala Trp Val Gly Asp
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Met Leu Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gly Glu Gly Val Ser Lys Pro Gly
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Pro Arg His Pro Glu Glu Val Ser Asp Glu Val Phe Tyr Ser Asn Arg
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<212> DNA
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ccgggtgaag gttatctcta tgaactgtgc gtcacagcca aaagccagac agagtgtgat 840
atctacccgc ttcgcgtcgg catccggtca gtggcagtga agggcgaaca gttcctgatt 900
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Cys Pro Tyr Met Thr Gly Glu Leu Gly Arg Arg Asp Thr Asn Pro Asp
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Thr Asp Ser Tyr Leu Thr Thr Asp Val Gly Gly Pro Ile Glu Asp Gln
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Ser Thr Lys Leu Val Lys Phe His Trp Lys Thr Leu Gln Gly Leu Ala
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Ser Met Val Trp Glu Glu Ala Gln Gln Ile Ser Gly Lys Asn Pro Asp
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Tyr Met Arg Gln Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Ala Gly Arg Tyr Pro
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Glu Trp Glu Leu Asn Val Gln Ile Met Asp Glu Glu Asp Gln Leu Arg
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Phe Gly Phe Asp Leu Phe Asp Pro Thr Lys Ile Val Pro Glu Glu Tyr
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Val Pro Leu Thr Pro Leu Gly Lys Met Thr Leu Asn Arg Asn Pro Arg
340 345 350
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Asn Leu Val Arg Ala Lys Ser Ser Thr Phe Asp Asp Ala Trp Ser Gln
465 470 475 480
Pro Arg Leu Phe Trp Asn Ser Leu Leu Pro Ala Glu Lys Gln Phe Val
485 490 495
Val Asn Ala Ile Arg Phe Glu Asn Ala Asn Val Lys Ser Asp Val Val
500 505 510
Lys Asn Asn Val Ile Val Gln Leu Asn Arg Ile Ser Asn Asp Leu Ala
515 520 525
Thr Arg Val Ala Lys Ala Ile Gly Val Asp Ala Pro Glu Pro Asp Asn
530 535 540
Thr Tyr Tyr His Asp Asn Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ala Phe Gly His
545 550 555 560
Arg Leu Gln Ser Leu Ala Gly Leu Lys Ile Ala Val Leu Ala Ser Val
565 570 575
Asp Ala Glu Glu Ser Phe Ser Ala Ala Thr Ala Leu Lys Ala Glu Leu
580 585 590
Ser Asn Asp Asn Leu Asp Val Ile Val Val Ala Glu Arg Phe Ser Asn
595 600 605
Gly Val Asn Gln Thr Tyr Ser Ala Ser Asp Ala Ile Gln Phe Asp Ala
610 615 620
Val Val Val Ala Pro Gly Ala Glu Lys Leu Phe Gly Ala Lys Ser Ala
625 630 635 640
Ala Asn Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Pro Ala Gly Arg Pro Leu Glu Ile
645 650 655
Leu Val Asp Ala Phe Arg Phe Gly Lys Pro Val Ala Ala Leu Gly Ser
660 665 670
Gly Ser Thr Ala Phe Asp Asn Ala Gly Ile Asn Thr Ala Val Glu Gly
675 680 685
Val Tyr Val Ala Asp Ala Val Asp Glu Ser Phe Ala Asn Asn Leu Glu
690 695 700
Glu Gly Leu Thr Val Phe Lys Phe Leu Asp Arg Phe Ala Leu Asp Ser
705 710 715 720
Asp Glu
<210> 7
<211> 2389
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgcgagctc tcggcctggt cggccttgtt ggcgtcgcca atgccgtctg tccgtatatg 60
acaggcgagc tcggccgtcg cgataccaac cccgatgcta ccgaggccac tgaggaattt 120
ctgtccgagt actaccttga cgacacggac tcgtacctga cgactgacgt cggcggccca 180
attgaggacc agcagagtct caaggccggt gcgcgcgggt ctaccctgct ggaagacttt 240
atcttccgtc agaagatcca gcgattcgac cacgagcggg tgagtgactg aggactcttc 300
aattgtcgat tgaaacgttg gatgctgact gcgcaggtcc ccgagcgtgc cgtccatgct 360
cggggtgcag gtgcccacgg tgtcttcacc tcgtacggcg acttctccaa catcaccgcc 420
gcctccttcc tctctgctga gggtaaggag acccccgtct tcgtccggtt ctcgaccgtc 480
gccggcagtc gtggcagttc tgacctcgcc cgcgatgtcc acggtttcgc cacccgcttt 540
tacactgacg agggcaactt tgatatcgtc ggtaacaaca ttcccgtctt tttcatccag 600
gatgccatcc agttccccga cctgatccac gccgtcaagc ccaagggcga tcgtgaaatc 660
ccgcaggctg ccacggccca tgacgccgcc tgggatttct tcagccagca gccctcgact 720
cttcacaccc tgctctgggc catggccggt cacggtatcc cgcgttcgtt ccgccacgtc 780
gatgggttcg gtgtgcacac tttccggctc gtcacggagg atggctccac caagctcgtc 840
aagttccact ggaagaccct gcaaggtttg gcaagtatgg tctgggagga agctcagcaa 900
atttctggca agaaccccga ctacatgcgc caggatctgt tcgagtcgat tgaggctggc 960
cggtaccctg agtgggaggt atggtacccc ttatttctac tacatagcga agatgtttac 1020
tgaccggaca gcttaacgtg caaatcatgg acgaggagga ccagttgcgc tttggcttcg 1080
accttttcga ccctaccaag attgtccctg aggaatacgt cccattgacc ccgctgggca 1140
agatgaccct caaccgcaac ccccgcaact actttgccga gactgagcag gtcatggtag 1200
gcttcctcct cccccttctg tatccctctc tttgccgttt ctaacagtaa cagttccaac 1260
ccggccacgt cgtgcgtggt gttgacttca ccgaggatcc ccttcttcag gtaggcggcg 1320
agcgacaaac ttttttgtct tttttaccta agctgactcg aagcagggac gtcttttcag 1380
ctaccttgac acccagctca accgcaatgg tggcccgaac tttgagcagt tgcccatcaa 1440
ccagccgcgc gttgctattc acaacaacaa ccgtgacggt gctggccaga tgttcattcc 1500
gctgaacccc gatgcgtaca gccccaacac gctgaaggga tcaaccctca aacaggccaa 1560
ccagactgcg ggtcgcggat tctttactgc tcctgaccgt actgccaacg gcaatcttgt 1620
gcgtgccaag agctccacct tcgatgatgc ttggtcgcag ccccggcttt tctggaactc 1680
tcttcttccc gccgagaagc agttcgtggt caacgccatt cgcttcgaaa acgccaatgt 1740
gaagagcgat gtcgtgaaga acaacgtcat cgttcagctt aatcgaatct cgaacgacct 1800
tgccacccgc gttgccaagg ccatcggtgt tgatgctccc gagcccgaca acacttacta 1860
ccacgacaac acgacctcca acatcggtgc gtttggccac cgactccaga gcttggctgg 1920
cctgaagatt gccgtacttg cttctgttga cgcagaggaa tccttcagcg cggctactgc 1980
tctgaaggcc gagctctcca acgacaacct ggacgtcatt gtcgtcgctg aacgcttctc 2040
caacggcgtg aaccagacct actctgcctc tgacgccatt cagtttgacg ccgtcgttgt 2100
tgcccctgga gcggagaagc tcttcggtgc caagtccgcg gccaactcca gctcaaccct 2160
ctaccctgcc ggccgtcccc tcgaaatcct cgttgatgct ttccgcttcg gtaagccagt 2220
cgctgctctt ggcagcggct ccactgcttt cgacaacgct ggtatcaaca ccgccgtcga 2280
gggcgtgtac gttgccgatg ccgtggacga gagctttgcc aacaacctcg aggagggtct 2340
gaccgtgttc aagttcttgg atcgctttgc cctggactcg gatgaatag 2389
<210> 8
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

Claims (10)

1.一种构巢曲霉自诱导表达系统，其特征在于，所述表达系统包括表达载体和宿主细胞；所述表达载体为过表达了鸟氨酸氨甲酰基转移酶的pUC19质粒，所述表达载体还含有PniaD启动子过表达目的基因，所述PniaD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的构巢曲霉自诱导表达系统，其特征在于，所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的构巢曲霉自诱导表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为构巢曲霉ABPU1。
4.如权利要求1～3任一所述的构巢曲霉自诱导表达系统，其特征在于，所述目的基因包括但不限于：葡萄糖醛缩酶、过氧化氢酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶。
5.如权利要求1～4任一所述的构巢曲霉自诱导表达系统，其特征在于，所述表达载体中的目的基因和鸟氨酸氨甲酰基转移酶之间连接有终止子TtrpC。
6.一种采用构巢曲霉生产目标蛋白的方法，其特征在于，将连接了目标蛋白的权利要求1～5任一所述的构巢曲霉自诱导表达系统划线至种子培养基中进行培养，制备得到种子液，将种子液添加至含有诱导剂的发酵培养基中，发酵生产目标蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导剂为NH4 +和或NO3 -。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中需同时添加尿苷、L吡哆醇及生物素。
9.如权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法为：将所述构巢曲霉自诱导表达系统划线至种子培养基中进行培养，制备得到孢子，采用孢悬液清洗孢子，静置，取上层游离孢子，制备得到种子液。
10.权利要求1～5任一所述的构巢曲霉自诱导表达系统，或权利要求6～9任一所述的方法在蛋白表达中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017513A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Novo Nordisk A/S Retransformation of filamentous fungi
US20150197760A1 (en) * 2012-06-19 2015-07-16 Dsm Ip Assets B.V. Promoters for expressing a gene in a cell
US20160237443A1 (en) * 2015-02-16 2016-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and systems for producing fungal secondary metabolites

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017513A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Novo Nordisk A/S Retransformation of filamentous fungi
US20150197760A1 (en) * 2012-06-19 2015-07-16 Dsm Ip Assets B.V. Promoters for expressing a gene in a cell
US20160237443A1 (en) * 2015-02-16 2016-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and systems for producing fungal secondary metabolites

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRAPPMANN,S.等: "GenBank：DQ023272.1", 《NCBI》 *
PHILIPP WIEMANN等: "CoIN: co-inducible nitrate expression system for secondary metabolites in Aspergillus nidulans", 《FUNGAL BIOL BIOTECHNOL》 *
YANGYI LIU等: "Characterization of the promoter of the nitrate transporter‑encoding gene nrtA in Aspergillus nidulans", 《MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS 》 *
刘杨奕: "响应无机氮源信号且适于自诱导的曲霉表达体系启动子的筛选与改造", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

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