CN113061254A - 一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法 - Google Patents

一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法，所述阳离子聚合物基因载体为改性修饰的聚缩水甘油胺，改性修饰剂为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚、羧基封端聚乙二醇单甲醚、低聚糖、有机疏水性物质或两性离子，低聚糖为麦芽糖、葡萄糖、甘露糖中的至少一种，有机疏水性物质为月桂酸、月桂醛、聚乳酸、聚己内酯、乳酸羟基乙酸共聚物、胆固醇中的至少一种，两性离子为丙内酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、1,3‑丙烷磺酸内酯、1,4‑丁烷磺酸内酯、1,5‑戊烷磺酸内酯中的至少一种；其中，改性修饰剂在聚缩水甘油胺上的接枝率为5%~50%。本发明提供的改性修饰的聚缩水甘油胺，作为非病毒基因转染载体，具有很高的生物兼容性和基因转染能力以及较低的细胞毒性。

Description

一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及聚合物的合成领域，具体涉及一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是一种随着现代分子生物学技术的发展而诞生，对多种人类疾病特别是遗传性疾病和恶性肿瘤很有前景的治疗方法。该方法通过将正常基因或有治疗作用的基因导入特定的组织或靶细胞，以纠正基因的缺陷或者异常表达，从而达到治疗疾病的目的。目前，基因的有效体内递送和目标组织或细胞内的转染存在诸多困难。例如，裸露的基因在体内转运的时候容易被核酸降解酶降解，基因过大的体积和高负电性使其很难通过细胞膜进入细胞内部。
一个安全有效的递送系统是基因治疗不可或缺的组成部分。目前，主要的基因递送载体分为病毒和非病毒基因载体。病毒载体的基因递送效率较高，但由于相关的致突变性或致癌性、宿主免疫反应和高生产成本，其使用受到了很大的限制。相比于病毒载体，非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高和化学结构可控等优点，引起了研究人员的广泛关注。其中，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是非病毒基因载体的代表之一，具有转染效率高，易于从溶酶体中逃逸，易于化学修饰等优点。然而聚乙烯亚胺，尤其是高分子量聚乙烯亚胺对细胞的毒性较大，严重制约其在基因治疗领域中的应用。根据大量的研究结论，聚乙烯亚胺细胞毒性大的主要原因是其表面较高的正电荷密度，导致其与细胞表面的膜结构形成了强相互作用，从而造成膜损伤。
本申请使用的材料聚缩水甘油胺(Poly(glycidyl azide)，PGAm)与现有的聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)结构相似，具有制备成本低，易于化学修饰等一系列优点。通过选择合适的化学修饰试剂和修饰方法，包括聚乙二醇修饰、糖分子修饰、两性离子修饰、疏水修饰等，本申请制备了多个系列的新型多功能聚缩水甘油胺衍生物材料。本申请的聚缩水甘油胺(Poly(glycidylazide)，PGAm)与现有的聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)结构如下式所示：
Figure BDA0002982168730000021
但是，聚缩水甘油胺的细胞毒性、生物兼容性以及基因转染能力等性能仍需进一步地改进。
发明内容
为了克服现有基因载体材料的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法，本发明的阳离子聚合物基因载体为改性修饰的聚缩水甘油胺，该接枝的阳离子聚合物，作为非病毒基因转染载体，具有很高的生物兼容性和基因转染能力以及较低的细胞毒性。
所述的一种阳离子聚合物基因载体，其特征在于所述阳离子聚合物基因载体为改性修饰的聚缩水甘油胺，改性修饰剂为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚、羧基封端聚乙二醇单甲醚、低聚糖、有机疏水性物质或两性离子，低聚糖为麦芽糖、葡萄糖、甘露糖中的至少一种，有机疏水性物质为月桂酸、月桂醛、聚乳酸、聚己内酯、乳酸羟基乙酸共聚物、胆固醇中的至少一种，两性离子为丙内酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、1,3-丙烷磺酸内酯、1,4-丁烷磺酸内酯、1,5-戊烷磺酸内酯中的至少一种；其中，改性修饰剂在聚缩水甘油胺上的接枝率为5％～50％；进一步地，改性修饰剂在聚缩水甘油胺上的接枝率为10％～30％。
本发明使用的对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚或羧基封端聚乙二醇单甲醚的分子量均在2000-20000范围内。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚、月桂酸或聚乳酸时，修饰方法如下：
1)将改性修饰剂溶解于有机溶剂中；
2)将聚缩水甘油胺充分溶解于有机溶剂后，加入步骤1)配制的混合液在30～50℃下反应，反应完全后，透析冻干即得到改性修饰的聚缩水甘油胺。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为月桂醛时，修饰方法如下：将改性修饰剂溶解于有机溶剂中，加入聚缩水甘油胺，在室温下搅拌反应10～15h后，加入氰基硼氢化钠继续搅拌反应10～15h，最后透析冻干即得到改性修饰的聚缩水甘油胺；其中，改性修饰剂、聚缩水甘油胺以及氰基硼氢化钠的质量比为1:1.4～1.8:0.6～0.8。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为胆固醇时，修饰方法如下：
S1：以胆固醇与对甲基苯磺酰氯为原料反应，得到胆固醇的对甲基苯磺酸盐；
S2：将步骤S1所得胆固醇的对甲基苯磺酸盐加入有机溶剂中；
S3：将聚缩水甘油胺充分溶解于有机溶剂后，加入步骤S2配制的混合液，在60-70℃下冷凝回流反应20～30h；反应结束后，将反应溶剂抽干，加入二氯甲烷，用质量浓度5％～10％的氢氧化钠溶液和水分别洗1～3遍，然后经无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，即制得改性修饰的聚缩水甘油胺。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为低聚糖时，修饰方法如下：在浓度为0.05～0.2M的硼酸钠溶液中加入聚缩水甘油胺，然后加入低聚糖和硼烷吡啶络合物，反应混合液在45～55℃下反应6～8天；反应结束后，透析纯化即得到改性修饰的聚缩水甘油胺；其中，硼酸钠、聚缩水甘油胺、低聚糖和硼烷吡啶络合物的质量比为1:0.2～0.3～0.2～0.3：0.12～0.2。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为为甲醇﹑乙醇﹑甲苯﹑二甲基亚砜中的至少一种。
所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于所述聚缩水甘油胺的分子量为3000～30000。
在本发明中，改性修饰的聚缩水甘油胺的结构式如式1所示：
Figure BDA0002982168730000041
在式1中，取代基R为
Figure BDA0002982168730000051
或为
Figure BDA0002982168730000052
或为
Figure BDA0002982168730000053
或为
Figure BDA0002982168730000055
或为
Figure BDA0002982168730000056
或为
Figure BDA0002982168730000057
或为
Figure BDA0002982168730000058
或为
Figure BDA0002982168730000059
或为
Figure BDA00029821687300000510
或为
Figure BDA00029821687300000511
或为
Figure BDA00029821687300000512
或为
Figure BDA00029821687300000513
或为
Figure BDA00029821687300000514
或为
Figure BDA00029821687300000515
或为
Figure BDA00029821687300000516
或为
Figure BDA00029821687300000517
或为
Figure BDA00029821687300000518
或为
Figure BDA0002982168730000054
其中n,m均为聚合度，n为1～3000，m为1～450。
在亲水性修饰方面，本申请分别采用低聚糖和聚乙二醇进行修饰。其中聚乙二醇具有良好的水溶性、润湿性、润滑性、生理惰性、对人体无刺激、温和。在化妆品和制药工业中应用广泛。本申请采用了一系列聚乙二醇化单甲醚衍生物，包括聚乙二醇化单甲醚羧酸、对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚等，对聚缩水甘油胺进行亲水性修饰，有效调控材料的阳离子密度。低聚糖分子为天然高亲水性小分子，具有良好的水溶性和稳定性，来源广泛，成本低廉，在食品工业和医药工业均有应用。本申请分别采用麦芽糖、葡萄糖和甘露糖等对聚缩水甘油胺进行亲水性修饰。
在疏水修饰方面，本申请分别采用天然的月桂酸、月桂醛、胆固醇、聚乳酸、聚己内酯、乳酸羟基乙酸共聚物等，对聚缩水甘油胺进行修饰，有效调控材料的亲水性性和阳离子密度。
此外，本申请还对聚缩水甘油胺进行两性离子修饰，包括包括丙内酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、1,3-丙烷磺酸内酯、1,4-丁烷磺酸内酯、1,5-戊烷磺酸内酯等，有效调控材料的电荷密度。
本发明制得的改性修饰的聚缩水甘油胺，能有效降低聚缩水甘油胺的细胞毒性，提高聚缩水甘油胺的生物兼容性和基因转染能力，并且能形成稳定性高的纳米胶束。
附图说明
图1为空白例1所得聚环氧氯丙烷的1HNMR谱图；
图2为空白例1所得聚环氧氯丙烷的13C-NMR谱图；
图3为空白例1所得聚缩水甘油叠氮的1HNMR谱图；
图4为空白例1所得聚缩水甘油叠氮的13C-NMR谱图；
图5为空白例1所得聚缩水甘油胺的1HNMR谱图；
图6为空白例1所得聚缩水甘油胺的13C-NMR谱图；
图7为实施例1所得对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs的1H-NMR谱图；
图8为实施例1所得对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs修饰的聚缩水甘油胺的1H-NMR谱图；
图9为实施例2所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH进行表征1H-NMR谱图；
图10为实施例2所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图；
图11为实施例3所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH进行表征1H-NMR谱图；
图12为实施例3所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图；
图13为实施例4所得十二醛修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图；
图14为实施例5所得十二酸修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图；
图15为实施例6所得麦芽糖修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
空白例1聚缩水甘油胺的制备方法包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，在50mL两口烧瓶中，加入四辛基溴化铵(20.6mg，0.072mmol)、环氧氯丙烷(0.466g，5.040mmol)和甲苯(0.500mL),在0℃下，加入0.77mmol三异丁基铝，然后继续搅拌反应12h。用1HNMR谱测定单体转化率。聚合完全后(环氧氯丙烷单体完全转化)，在减压下蒸馏除去溶剂甲苯，得到无色聚合物。无色聚合物溶于四氢呋喃中，在质量浓度5％的氢氧化钠水溶液中沉淀2次，在甲醇中沉淀1次，最后真空干燥24h后得到无色油状液体即为聚环氧氯丙烷，收率为97.2％。聚环氧氯丙烷的1HNMR谱图和13C-NMR谱图分别如图1和图2所示。
(2)氮气保护下，在50mL两口烧瓶中，加入步骤(1)所得聚环氧氯丙烷(0.925g)、N,N-二甲基甲酰胺(20.000mL)和叠氮化钠(0.780g，0.120mmol)，反应混合物在110℃搅拌反应12h。反应完成后，反应液冷却至室温，在水中沉淀。反应生成的聚合物用水洗涤，最后真空干燥24h得到淡黄色油状液体即为聚缩水甘油叠氮，收率97.6％。聚缩水甘油叠氮的1HNMR谱图和13C-NMR谱图分别如图3和图4所示。
(3)氮气保护下，在50mL两口烧瓶中，加入步骤(2)所得聚缩水甘油叠氮(0.990g)和N,N-二甲基甲酰胺(22mL)，加入三苯基膦(2.885g，0.110mmol)，反应混合物在室温下搅拌2h，然后加入水0.5mL，继续搅拌0.5h。反应结束后在减压下蒸馏除去溶剂，反应生成的聚合物溶于水后过滤，最后用甲苯洗涤聚合物。将溶液冻干得到淡黄色油状液体即为聚缩水甘油胺，收率96.9％。聚缩水甘油胺的1HNMR谱图和13C-NMR谱图分别如图5和图6所示。对空白例1制备的聚缩水甘油胺采用凝胶渗透色谱仪(GPC)进行分子量测定，其平均分子量约为5000。
实施例1：
对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs修饰聚缩水甘油胺，其制备方法包括以下步骤：
(1)对甲苯磺酰氯(2.478g,13.000mmol)用吡啶(25.000mL)溶解，配制得到对甲苯磺酰氯的吡啶溶液。氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入聚乙二醇单甲醚mPEG2k(4.000g,平均分子量2000)和无水二氯甲烷(50.000mL)，35℃搅拌溶解后，滴加上述配制的对甲苯磺酰氯的吡啶溶液，滴加完毕后，35℃反应24h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，用水和质量浓度为5％的稀盐酸分别萃取3次，萃取后的有机相用无水Na2SO4干燥，经过滤，减压旋蒸得到浓缩液。浓缩液用10倍体积的冰正己烷沉淀纯化，真空干燥24h后得到白色疏松块状物，即为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs。
上述制备的对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs的1H-NMR谱图如图7所示，图谱表征结果为：以聚乙二醇单甲醚mPEG2k重复单元结构中-CH2-为基准，δ＝3.40-3.90ppm(δ表示化学位移)，聚乙二醇单甲醚mPEG2k其峰面积相应于181个H原子；δ＝2.65ppm为苯环-CH3上的H原子，其峰面积为3个氢，δ＝7.30-7.90ppm为苯环上的氢原子，其峰面积为4个氢。
(2)氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入步骤(1)所得对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs(0.239g)，二甲基亚砜(35.000mL)，在30℃下搅拌均匀后，加入聚缩水甘油胺(0.050g,平均分子量5000)的二甲基亚砜(10.000mL)溶液。滴加完毕后，继续搅拌反应24h。反应结束后用5000kda透析袋透析3天，然后冻干得到对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs修饰的聚缩水甘油胺。
上述制备的对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs修饰的聚缩水甘油胺，其1H-NMR谱图如图8所示，图谱表征结果为：δ＝3.00-3.30ppm为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2-上的氢原子，其峰面积为140个氢。δ＝3.30-3.40ppm为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs与聚缩水甘油胺反应后对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-OTs上-CH3的氢原子，其峰面积为33个氢。根据化学位移已经归属的氢个数结果，能够计算得到目标产品的反应接枝率为15.3％。
实施例2：
羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH修饰聚缩水甘油胺，其制备方法包括以下步骤：
(1)氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入聚乙二醇单甲醚mPEG2k(1.440g,平均分子量2000)、4-二甲氨基吡啶(0.890g,7.200mmol)、三乙胺(0.200mL,1.440mmol)、无水二氯甲烷(20.000mL)，在25℃下搅拌均匀后，滴加丁二酸酐(0.730g,7.200mmol)的二氯甲烷(20.000mL)溶液。滴加完毕后，继续搅拌反应24h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，用水和质量浓度5％的稀盐酸分别萃取3次，萃取后的有机相用无水Na2SO4干燥，经过滤，减压旋蒸得到浓缩液。浓缩液用10倍体积的冰正己烷沉淀纯化，真空干燥24h后得到白色疏松块状物，即羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH。
对上述制备的羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH进行表征1H-NMR谱图，如图9所示。图谱表征结果为：以聚乙二醇单甲醚mPEG2k重复单元结构中-CH2-为基准，δ＝3.40-3.90ppm，聚乙二醇单甲醚mPEG2k其峰面积相应于181个H原子，δ＝2.65ppm为丁二酸酐与聚乙二醇单甲醚mPEG2k反应后丁二酸上-CH2-上的H原子，其峰面积为4个氢。
(2)氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入步骤(1)所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH(0.461g)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCl(0.210g,1.100mmol)、N-羟基丁二酰亚胺NHS(0.126g,1.100mmol)、去离子水(35.000mL)，在30℃下活化2h。然后滴加聚缩水甘油胺(0.100g,平均分子量5000)的水(10.000mL)溶液，滴加完毕后，继续搅拌反应24h。反应结束后用5000kda透析袋透析3天，然后冻干得到羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH修饰聚缩水甘油胺。
上述制备的羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图，如图10所示。图谱表征结果为：δ＝3.00-3.30ppm为羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2-上的氢原子，其峰面积为140个氢。δ＝3.30-3.40ppm为羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH与聚缩水甘油胺反应后羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG2k-COOH上-CH3的氢原子，其峰面积为30个氢。反应接枝率为14.5％。
实施例3：
羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH修饰聚缩水甘油胺，其制备方法包括以下步骤：
(1)氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入聚乙二醇单甲醚mPEG4k(2.880g,平均分子量4000)，4-二甲氨基吡啶(0.890g,7.200mmol)，三乙胺(0.200mL,1.440mmol)、无水二氯甲烷(80.000mL)，在25℃下搅拌均匀后，滴加丁二酸酐(0.730g,7.200mmol)的二氯甲烷(20.000mL)溶液。滴加完毕后，继续搅拌反应24h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，用水和质量浓度5％的稀盐酸分别萃取3次。有机相用无水Na2SO4干燥，经过滤，减压旋蒸得到浓缩液。浓缩液用10倍体积的冰正己烷沉淀纯化，真空干燥24h后得到白色疏松块状物，即羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH。
对上述制备的羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH进行表征1H-NMR谱图，如图11所示。图谱表征结果，以聚乙二醇单甲醚mPEG4k重复单元结构中-CH2-为基准，δ＝3.40-3.90ppm为聚乙二醇单甲醚mPEG4k其峰面积相应于361个H原子，δ＝2.65ppm为丁二酸酐与聚乙二醇单甲醚mPEG4k反应后丁二酸上-CH2-上的H原子，其峰面积为4个氢。
(2)氮气保护下，在100mL两口圆底烧瓶中，加入步骤(1)所得羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH(0.901g)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCl(0.210g,1.100mmol),N-羟基丁二酰亚胺NHS(0.126g,1.100mmol)、去离子水(70.000mL)，在30℃下活化2h。然后滴加聚缩水甘油胺(0.100g,平均分子量5000)的水(10.000mL)溶液，滴加完毕后，继续搅拌反应48h。反应结束后用5000kda透析袋透析3天，然后冻干得到羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH修饰聚缩水甘油胺。
上述制备的羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图，如图12所示。图谱表征结果，δ＝3.00-3.30ppm为羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2-上的氢原子，其峰面积为140个氢。δ＝3.30-3.40ppm为羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH与聚缩水甘油胺反应后羧基封端聚乙二醇单甲醚mPEG4k-COOH上-CH3的氢原子，其峰面积为33个氢。反应接枝率为15.7％。
实施例4十二醛修饰聚缩水甘油胺的制备：
在100mL两口圆底烧瓶中，加入十二醛(0.066g,0.360mmol)，无水乙醇(20.000mL)，加入聚缩水甘油胺(0.100g,平均分子量5000)，在25℃下搅拌12h，然后加入氰基硼氢化钠(0.045g,0.720mmol)，继续搅拌反应12h。反应结束后用2000kda透析袋透析3天，然后冻干，即得到十二醛修饰聚缩水甘油胺。
对上述制备的十二醛修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图，如图13所示。图谱表征结果，δ＝0.89ppm为十二醛与聚缩水甘油按反应后十二醛上-CH3上的氢原子，其峰面积为54个氢。δ＝2.25-4.25ppm为十二醛与聚缩水甘油按反应后聚缩水甘油胺上-CH2CHO-以及-CH2-的氢原子，其峰面积为350个氢。反应接枝率为23.3％。
实施例5十二酸修饰聚缩水甘油胺的制备：
在100mL两口圆底烧瓶中，加入十二酸(0.072g,0.360mmol)，无水乙醇(20.000mL)，加入聚缩水甘油胺(0.100g,平均分子量5000)，在45℃下搅拌12h。反应结束后用2000kda透析袋透析3天，然后冻干，即得到十二酸修饰聚缩水甘油胺。
对上述制备的十二酸修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图，如图14所示。图谱表征结果，δ＝0.89ppm为十二酸与聚缩水甘油胺反应后十二酸上-CH3上的氢原子，其峰面积为54个氢。δ＝2.40ppm为十二酸与聚缩水甘油胺反应后十二酸上-CH2COOH的氢原子，其峰面积为36个氢。δ＝2.25-4.25ppm为十二酸与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2CHO-以及-CH2-的氢原子，其峰面积为350个氢。反应接枝率为25.0％。
实施例6麦芽糖修饰聚缩水甘油胺的制备：
在氮气保护下，往20mL浓度为0.1M硼酸钠溶液中加入聚缩水甘油胺(0.100g,平均分子量5000),然后加入麦芽糖(0.123g,0.360mmol)和硼烷吡啶络合物(0.067g,0.720mmol)，在50℃下反应7天。反应结束后，用3000Kda透析袋透析纯化3天，即得到麦芽糖修饰聚缩水甘油胺。
对上述制备的麦芽糖修饰聚缩水甘油胺进行表征1H-NMR谱图，结果如图15所示。图谱表征结果为，δ＝2.50-3.30ppm为麦芽糖与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2-上的氢原子，其峰面积为140个氢。δ＝3.40-4.50ppm为麦芽糖与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺上-CH2CHO-以及麦芽糖上的氢原子，其峰面积为440个氢。δ＝5.00-5.50ppm为麦芽糖与聚缩水甘油胺反应后聚缩水甘油胺与麦芽糖连接处的-CH2-上的氢原子，其峰面积为13个氢。反应接枝率为24.7％。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims (7)

1.一种阳离子聚合物基因载体，其特征在于所述阳离子聚合物基因载体为改性修饰的聚缩水甘油胺，改性修饰剂为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚、羧基封端聚乙二醇单甲醚、低聚糖、有机疏水性物质或两性离子，低聚糖为麦芽糖、葡萄糖、甘露糖中的至少一种，有机疏水性物质为月桂酸、月桂醛、聚乳酸、聚己内酯、乳酸羟基乙酸共聚物、胆固醇中的至少一种，两性离子为丙内酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、1,3-丙烷磺酸内酯、1,4-丁烷磺酸内酯、1,5-戊烷磺酸内酯中的至少一种；其中，改性修饰剂在聚缩水甘油胺上的接枝率为5%~50%。
2.如权利要求1所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为对甲基苯磺酰基封端聚乙二醇单甲醚、月桂酸或聚乳酸时，修饰方法如下：
1）将改性修饰剂溶解于有机溶剂中；
2）将聚缩水甘油胺充分溶解于有机溶剂后，加入步骤1）配制的混合液在30~50℃下反应，反应完全后，透析冻干即得到改性修饰的聚缩水甘油胺。
3.如权利要求1所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为月桂醛时，修饰方法如下：将改性修饰剂溶解于有机溶剂中，加入聚缩水甘油胺，在室温下搅拌反应10~15h后，加入氰基硼氢化钠继续搅拌反应10~15h，最后透析冻干即得到改性修饰的聚缩水甘油胺；其中，改性修饰剂、聚缩水甘油胺以及氰基硼氢化钠的质量比为1:1.4~1.8:0.6~0.8。
4.如权利要求1所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为胆固醇时，修饰方法如下：
S1：以胆固醇与对甲基苯磺酰氯为原料反应，得到胆固醇的对甲基苯磺酸盐；
S2：将步骤S1所得胆固醇的对甲基苯磺酸盐加入有机溶剂中；
S3：将聚缩水甘油胺充分溶解于有机溶剂后，加入步骤S2配制的混合液，在60-70℃下冷凝回流反应20~30h；反应结束后，将反应溶剂抽干，加入二氯甲烷，用质量浓度5%~10%的氢氧化钠溶液和水分别洗1~3遍，然后经无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，即制得改性修饰的聚缩水甘油胺。
5.如权利要求1所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于当改性修饰剂为低聚糖时，修饰方法如下：在浓度为0.05~0.2M的硼酸钠溶液中加入聚缩水甘油胺，然后加入低聚糖和硼烷吡啶络合物，反应混合液在45~55℃下反应6~8天；反应结束后，透析纯化即得到改性修饰的聚缩水甘油胺；其中，硼酸钠、聚缩水甘油胺、低聚糖和硼烷吡啶络合物的质量比为1:0.2~0.3~0.2~0.3：0.12~0.2。
6.如权利要求2、3或4所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为为甲醇﹑乙醇﹑甲苯﹑二甲基亚砜中的至少一种。
7.如权利要求2~5任一所述的一种阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于所述聚缩水甘油胺的分子量为3000~30000。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024168711A1 (zh) * 2023-02-16 2024-08-22 林桂孜 一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1617710A (zh) * 2001-12-12 2005-05-18 阿尔扎公司 递送核酸的脂质体组合物
CN102702407A (zh) * 2012-06-21 2012-10-03 萨恩化学技术（上海）有限公司 Atrp法构建以pgma为骨架的阳离子基因载体
WO2013118100A2 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Process for the treatment of a polymer
US20140050670A1 (en) * 2010-12-07 2014-02-20 The University Of Western Australia Multifunctional nanoparticles
CN104592523A (zh) * 2014-12-24 2015-05-06 天津大学 一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用
CN106349437A (zh) * 2015-07-14 2017-01-25 中国科学院上海药物研究所 一种三嵌段聚合物、其制备方法及用途
US20170218219A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-03 Ennis Paint, Inc Linear polyglycidyl amine additives for controlled crosslinking of latex polymers
WO2017135925A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Ennis Paint, Inc. Linear polyglycidyl amine additives for controlled crosslinking of latex polymers
US20190160007A1 (en) * 2017-11-30 2019-05-30 Jiangnan University Integrated Nano System for Liver-Targeting Co-Delivery of Genes/Drugs and Preparation Method
US20210024694A1 (en) * 2018-02-01 2021-01-28 The University Of Tokyo Polymer compound for nucleic acid delivery

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1617710A (zh) * 2001-12-12 2005-05-18 阿尔扎公司 递送核酸的脂质体组合物
US20140050670A1 (en) * 2010-12-07 2014-02-20 The University Of Western Australia Multifunctional nanoparticles
WO2013118100A2 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Process for the treatment of a polymer
CN102702407A (zh) * 2012-06-21 2012-10-03 萨恩化学技术（上海）有限公司 Atrp法构建以pgma为骨架的阳离子基因载体
CN104592523A (zh) * 2014-12-24 2015-05-06 天津大学 一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用
CN106349437A (zh) * 2015-07-14 2017-01-25 中国科学院上海药物研究所 一种三嵌段聚合物、其制备方法及用途
US20170218219A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-03 Ennis Paint, Inc Linear polyglycidyl amine additives for controlled crosslinking of latex polymers
WO2017135925A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Ennis Paint, Inc. Linear polyglycidyl amine additives for controlled crosslinking of latex polymers
US20190160007A1 (en) * 2017-11-30 2019-05-30 Jiangnan University Integrated Nano System for Liver-Targeting Co-Delivery of Genes/Drugs and Preparation Method
US20210024694A1 (en) * 2018-02-01 2021-01-28 The University Of Tokyo Polymer compound for nucleic acid delivery

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JORG MEYER，等: ""Poly(glycidyl amine) and Copolymers with Glycidol and Glycidyl Amine Repeating Units: Synthesis and Characterization"", 《MACROMOLECULES》 *
SENTHIL K. BOOPATHI，等: ""Direct access to poly(glycidyl azide) and its copolymers through anionic (co-)polymerization of glycidyl azide"", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
赵广阔: ""新型多功能可生物降解PEG-PLA/PLGA/PCL 聚合物纳米抗肿瘤药物载体的研究进展"", 《中国现代应用药学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024168711A1 (zh) * 2023-02-16 2024-08-22 林桂孜 一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用

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