CN113046433B - 细胞因子il1f9在制备检测、预防和治疗肿瘤的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞因子IL1F9在制备检测、预防和/或治疗肿瘤产品中的应用，其对IL1F9对于肿瘤尤其是肺癌和结肠癌的影响深入研究，实验结果表明，一方面，IL1F9可作为肿瘤抑制的一个新靶点，有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能的物质例如以鼠源的G12‑S191氨基酸片段做为抗原免疫兔子产生的抗IL1F9的多克隆抗体可以应用于制备抗肺癌、结直肠癌等的药物；另一方面，IL1F9可以应用于在制备肿瘤的检测试剂、检测肿瘤的芯片或试剂盒中，检测试剂、检测肿瘤的芯片或试剂盒以IL1F9作为是否患肿瘤的标记物。

Description

细胞因子IL1F9在制备检测、预防和治疗肿瘤的产品中的应用
技术领域
本发明专利属于生物技术和医学领域，具体涉及细胞因子IL1F9在制备检测、预防和治疗肿瘤的产品中的应用。
背景技术
癌症是人类面临的头号健康威胁，也是导致人类死亡的主要原因。肺癌和结直肠癌是发病率和死亡率较高的癌症之一，并呈现出增速加快的趋势，已成为对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。吸烟、长期暴露于污染的空气中与所在工作场所暴露于致癌原是患肺癌风险增加的主要原因。饮食习惯、卫生习惯以及炎症性肠病是患结直肠癌的主要风险因子。基于肺癌的生物学特征、治疗和预后，世界卫生组织(WHO)将其分为两大类：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC占所有肺癌病例的85％以上，主要包括腺癌和鳞癌。根据结直肠癌的病理特征可将结直肠癌分为肿块型、溃疡型和浸润型。根据组织学分类则可以分为状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、未分化癌、腺鳞癌和小细胞癌。
细胞因子(Cytokine)是由多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。细胞因子通过与其特异性的受体结合，会引发靶细胞内的信号级联反应，例如调节细胞发育、参与细胞的命运决定、启动细胞的死亡程序、促进血管生成等。并且在肿瘤的发生、发展、复发和转移过程中，细胞因子也同样发挥着重要的作用，细胞因子可以通过与靶细胞上的特异性受体结合，改变肿瘤微环境中的细胞分布，激活或抑制某些免疫细胞的功能，也可以改变肿瘤微环境细胞的代谢组学、转录组学、表观组学特征，来发挥促进或者抑制肿瘤发生的功能。自1957年Lssac发现干扰素以来，迄今已经发现了200多种细胞因子。根据其功能可将细胞因子分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、造血因子、生长因子、趋化因子。IL1F9属于白细胞介素1家族成员，其细胞特异性受体为IL36R(又名IL1RL2,interleukin-1 receptor like 2)。需要指出的是，在IL1F9-IL36R信号通路中还存在着一个受体拮抗蛋白IL1F5(又名IL36RA,interleukin-36 receptor antagonist),它可以与IL1RAcP(interleukin-1 Receptor accessory protein)竞争性地结合IL36R来阻碍IL36R-IL36R-IL1RAcP复合体的形成进而阻断IL1F9下游信号通路。
发明内容
因为细胞因子具有细胞类型特异性的表达模式，我们实验室前期进行了非小细胞肺癌小鼠模型肿瘤组织的单细胞测序研究。基于我们在小鼠肺癌模型中的研究，我们发现，Il1f9主要表达于嗜中性细胞(Neutrophils)，少量表达于树突状细胞(Dendritic cells)和表皮细胞(Epithelial cells)。Il36r主要表达于嗜中性细胞(Neutrophils)、表皮细胞(Epithelial cells)和内皮细胞(Endothelial cells)。目前关于IL1F9的研究主要集中在银屑病、T细胞发育方面，主要功能为促进炎症反应和T细胞发育活化方面，目前关于IL1F9在肿瘤方面的研究较少，而且具体机制未知。
在研究肿瘤发生机制与肿瘤微环境方法中，常常使用动物模型来模拟肿瘤在机体内的生长状况。其中由带Cre重组酶的腺病毒(以下简称Ade-Cre)诱导的Krasfl/+Trp53fl/fl(以下简称KP)和Krasfl/+Lkb13fl/fl(以下简称KL)小鼠模型是研究非小细胞肺癌的主要经典模型之一。正常kras基因可以抑制肿瘤细胞生长，一旦发生突变，例如第十二位甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，会持续刺激细胞生长。Trp53是研究最为广泛的也是最重要的肿瘤抑制基因，p53缺失突变也会导致肿瘤的发生。Lkb1(又名STK11,serine/threoninekinase 11)，是一种丝氨酸/络氨酸激酶，其确实可以导致细胞内的氧化还原失衡和脂肪酸氧化的积累，进而导致肿瘤的发生。Kras、Trp53和LKB1突变常见于非小细胞肺癌中，在小鼠模型中，将Kras突变和p53/LKB1缺失是理想的非小细胞肺腺癌的研究模型。但由于Kras与Trp53/LKB1在小鼠生长发育早期发挥重要作用，突变或者缺失都会致死，固需要使用借助Cre-Loxp系统的条件性敲除小鼠来实现在小鼠肺部原发癌的发生。
对于结直肠癌的研究我们同样使用小鼠模型来进行。在我们前期的研究中，主要利用DSS(Dextran Sulfate Sodium Salt，葡聚糖硫酸钠盐)来诱导溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。利用AOM(azoxymethane,氧化偶氮甲烷)/DSS来诱导炎症引起的结肠癌。利用AOM处理的VillincreTrp53fl/fl(VP)小鼠来诱导原发性的结肠癌。利用APCmin /+小鼠来诱导消化道自发的结直肠癌。
本发明发现了细胞因子IL1F9在预防，诊断和治疗肿瘤的作用。并由此提供了可用于预防，诊断和治疗肿瘤的新途径、方法和产品。
本发明发现了IL1F9在肿瘤生长方面的功能机制，该机制是建立于经典的非小细胞肺癌模型(Krasfl/+Trp53fl/fl和Krasfl/+Lkb1fl/fl)以及经典的结肠炎/结直肠癌模型(DSS-induced UC、AOM/DSS、VP和APCmin/+)。
具体地，在肺癌疾病模型中，通过临床标本以及小鼠造模实验，我们发现IL1F9在人肺癌组织中比癌旁正常组织表达水平高，包括mRNA和蛋白质水平。在小鼠实验中，荷瘤小鼠相比于正常小鼠，IL1F9在mRNA和蛋白质水平均上调表达，并且随着小鼠荷瘤时间的增长，呈现出随时间增长的升高趋势，故其可以作为肿瘤预防诊断的新指标。
另外，在小鼠肺癌模型中发现，IL1F9的缺失小鼠肺部肿瘤生长更加缓慢，延缓了小鼠的死亡，而在Ad-cre诱导四周后的小鼠腹腔注射我们实验室前期纯化的特异性中和IL1F9的多克隆抗体，并用同型IgG作为对照，我们发现多克隆抗体处理组相较于IgG组，可以抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间。
由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种细胞因子IL1F9在制备检测、预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
本发明还提供细胞因子IL1F9在制备肿瘤的检测试剂中的应用。
根据本发明的实施例，所述检测试剂以细胞因子IL1F9作为是否患肿瘤的标记物。
本发明还提供细胞因子IL1F9在制备检测肿瘤的芯片或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能的物质在制备抗肿瘤药物中的应用。
根据本发明的实施例，有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能物质为抗IL1F9的多克隆抗体，优选地，为鼠源的G12-S191氨基酸片段做为抗原免疫兔子产生的抗IL1F9的多克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括但不限于：肝癌、肺癌、鳞癌、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、腺癌。
优选地，所述肿瘤为肺癌或结直肠癌。
根据本发明的实施例，所述IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的另一方面，本发明还提供一种试剂盒，包括细胞因子IL1F9。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种细胞因子IL1F9在制备检测、预防和/或治疗肿瘤产品中的应用，其对IL1F9对于肿瘤尤其是肺癌和结肠癌的影响深入研究，实验结果提示，一方面，IL1F9可作为抑制肿瘤发生发展的一个新靶点，有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能的物质例如以鼠源的G12-S191氨基酸片段做为抗原免疫兔子产生的抗IL1F9的多克隆抗体可以应用于制备抗肺癌、结直肠癌等的药物；另一方面，IL1F9可以应用于在制备肿瘤的检测试剂、检测肿瘤的芯片或试剂盒中，检测试剂、检测肿瘤的芯片或试剂盒以IL1F9作为是否患肿瘤的标记物。
附图说明
图1为发现IL1F9在人肺癌组织中高表达的实验结果图，其中，图1A为IL1F9在新鲜肺癌样品肿瘤组织与其配对的正常组织的mRNA水平对比的结果图；图1B为IL1F9在新鲜肺癌样品肿瘤组织与其配对的正常组织中蛋白水平对比的结果图；图1C为IL1F9在TCGA数据库中肿瘤组织与配对的正常组织在转录组水平对比的结果图；图1D为IL1F9的mRNA水平在KL非小细胞肺癌模型小鼠肿瘤进展中的变化趋势图；图1E为IL1F9的蛋白质水平在KL非小细胞肺癌模型小鼠肿瘤进展中的变化趋势图；
图2为证明IL1F9的缺失能够抑制非小细胞肺癌小鼠模型肿瘤发生的实验结果图，其中，图2A左为KL模型构建过程示意图；图2A右为KL、KL9(IL1F9缺失组)小鼠在0天、50天、100天、150天、200天的生存比例结果对比图；图2B左为KP模型构建过程示意图；图2B右为KP、KP9(IL1F9缺失组)小鼠在0天、45天、90天、135天、180天的生存比例结果对比图；图2C为KL、KL9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周，小鼠肺部的HE染色结果图；图2D为KL、KL9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周，小鼠肺部肿瘤面积与小鼠肺部面积的比例结果图；图2E为KP、KP9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周，小鼠肺部的HE染色结果图；图2F为KP、KP9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周，小鼠肺部肿瘤面积与小鼠肺部面积的比例结果图；图2G中为TCGA数据库中高表达il1f9的患者与低表达Il1f9的患者之间的生存差异；
图3为证明Il1f9的缺失能够抑制结肠炎/结直肠癌模型小鼠的疾病发生的实验结果图，其中，图3A为DSS诱导的溃疡性结肠炎的造模方式示意图；图3B为将小鼠结直肠，盲肠和一小部分小肠拍照的图片及Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)结肠长度对比结果图；图3C为小鼠靠近肛门部分的结直肠通过苏木素-伊红染色(H&E)的实验结果图；图3D为由AOM/DSS诱导的炎症引起的结肠癌的造模方式示意图及Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)体重变化结果对比结果图；图3E为将小鼠结直肠，盲肠和一小部分小肠拍照的图片和Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图；图3F为VP小鼠模型的造模方式示意图；图3G为Il1f9缺失组(VP9)和野生组(VP)小鼠的结直肠的拍照图片及Il1f9缺失组(VP9)和野生组(VP)的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图；图3H为Apc模型中，Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠的结直肠和小肠平行摆放的拍照图片；图3I为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图；图3J为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)生存实验结果对比图；图3K为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠小肠通过苏木素-伊红染色(H&E)结果对比图；图3L为在ApcMin/+突变小鼠中Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)的结肠部位的肿瘤数目对比图；图3M为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠肿瘤发生率对比结果图；
图4为IL1F9缺失的非小细胞肺癌模型小鼠能够通过ROS的积累来抑制肿瘤生长的实验结果图；图4A为对肿瘤诱导10周后的KL和KL9小鼠肺部组织切片进行8-oxo-dGuo(显示DNA被ROS氧化的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KL和KL9小鼠中，8-oxo-dGuo的染色结果统计图(图右)；图4B为对肿瘤诱导10周后的KP和KP9小鼠肺部组织切片进行8-oxo-dGuo(显示DNA被ROS氧化的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KP和KP9小鼠中，8-oxo-dGuo的染色结果统计图(图右)；图4C为对肿瘤诱导10周后的KL和KL9小鼠肺部组织切片进行Ki-67(细胞增殖的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KL和KL9小鼠中，Ki-67的染色结果统计图(图右)；图4D为对肿瘤诱导10周后的KP和KP9小鼠肺部组织切片进行Ki-67(细胞增殖的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KP和KP9小鼠中，Ki-67的染色结果统计图(图右)；图4E为利用流式细胞术检测来源于KL和KL9小鼠肺部肿瘤中的ROS含量(H2DCFDA为检测胞质中ROS的探针)。
图5为针对IL1F9的中和性抗体能延缓非小细胞肺癌和结肠炎/结直肠癌模型小鼠的疾病发生的实验结果图；图5A为对非小细胞肺癌模型小鼠进行anti-IL36多克隆抗体治疗的给药示意图；图5B为KL小鼠经药物处理或同型IgG处理6周后肺部组织的HE染色结果图(图左)，以及肺部肿瘤占全肺面积的比例(图右)；图5C为KP小鼠经药物处理(PAb)或同型IgG处理6周后肺部组织的HE染色结果图(图左)，以及肺部肿瘤占全肺面积的比例(图右)；图5D为给药方式及给药过程中实验组(PAB)与对照组(IgG)体重变化结果对比图；图5E为实验组(PAB)与对照组(IgG)小鼠结直肠，盲肠和一小部分小肠拍照图片及实验组(PAB)与对照组(IgG)结肠长度对比图；图5F为截取如图5E所描述的两组小鼠靠近肛门部分的结直肠通过苏木素-伊红染色(H&E)的实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。以下实施例中，IL1F9来源于构建在pET-30c-6×His-TEV载体上，在Rosetta2菌株中纯化表达，IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；IL1F9的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。纯化的宿主菌进一步通过本领域常规方法如IPTG诱导、收菌、超声、洗脱等步骤可以得到纯化蛋白。
实施例1：IL1F9在人肺癌组织中高表达
本实施例通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)实验检测在43位非小细胞肺癌患者的新鲜肺癌样品和配对的同一片肺的正常组织样品中细胞因子的mRNA水平，筛选到IL1F9在肺癌组织中mRNA水平明显高于正常组织，结果如图1A所示。另外病人的肿瘤和正常组织进行固定包埋，制成组织芯片，通过免疫组织化学实验(IHC)发现IL1F9的蛋白水平在肿瘤组织中明显高于正常组织，部分结果如图1B所示。同样，公共数据库TCGA的数据也表明在非小细胞肺癌的两种主要亚型，肺腺癌和肺鳞癌标本中，IL1F9的转录水平明显高于配对的正常组织，结果如图1C所示。图1D-E为IL1F9的mRNA水平(图1D)和蛋白质水平(图1E)在KL非小细胞肺癌模型小鼠肿瘤进展中的变化趋势。肺癌的小鼠模型实验也表明，IL1F9在mRNA和蛋白质水平上会随着肿瘤的进展上调其表达水平。
实施例2：IL1F9的缺失能够抑制非小细胞肺癌模型小鼠肿瘤的发生
本实施例通过构建KP/KL小鼠非小细胞肺癌模型来确定IL1F9对于肿瘤生长的影响。本实施例先将IL1F9敲除小鼠与Krasfl/+Trp53fl/fl/Krasfl/+Lkb1fl/fl小鼠进行杂交，得到Krasfl/+Trp53fl/flIl1f9-/-(图中KP9)和Krasfl/+Lkb1fl/flIl1f9-/-(图中KL9)小鼠。KL模型构建过程如图2A所示。KP模型构建过程如图2E所示。在小鼠生长至8周龄时，通过将小鼠麻醉滴鼻加入带Cre基因的腺病毒(每只小鼠2×106pfu病毒溶于60ml PBS)，可以实现对小鼠肺部肿瘤的诱导，然后通过观察小鼠的生存期，并在不同时间点(6周、8周、10周)对小鼠肺部进行病理学检测，如通过苏木素-伊红染色(H&E)来检测上述时间点小鼠肺部肿瘤生长情况。
KL、KL9小鼠在0天、50天、100天、150天、200天的生存比例结果如图2A所示，KP、KP9小鼠在0天、45天、90天、135天、180天的生存比例结果如图2B所示，由图可知，在诱导了肿瘤的小鼠中，Il1f9的缺失的小鼠对于肿瘤生长更加耐受，生存期更长，说明的Il1f9的存在具有缩短肺癌小鼠的生存期的作用。
KL、KL9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周的时间点上取样，小鼠肺部肿瘤面积大小如图2C所示，KP、KP9在小鼠诱导了肿瘤后的第8、10、12周的时间点上取样，小鼠肺部肿瘤面积大小如图2E所示，KL、KL9小鼠肺部肿瘤面积与小鼠肺部面积的比例如图2D所示，KP、KP9小鼠肺部肿瘤面积与小鼠肺部面积的比例如图2F所示，由图中结果可以发现，Il1f9缺失的小鼠肿瘤生长明显小于Il1f9野生型小鼠，说明了Il1f9能够在肿瘤发生和生长过程中起到促进肿瘤生长的作用。
根据TCGA数据库中的随访数据，我们也发现，IL1F9高表达的病人预后明显差于IL1F9低表达的病人，结果如图2G所示。说明IL1F9在人肺癌的发生发展中有与其在小鼠肺癌模型中相同的表型特征。
实施例3：IL1F9的缺失可以抑制结肠炎/结直肠癌模型小鼠的疾病发生
本实施例使用了DSS-induced UC、AOM/DSS、VP和APCmin/+结直肠癌小鼠模型中，在DSS-induced UC、AOM/DSS实验中使用的是IL1F9-/-和野生型小鼠，在VP和APCmin/+模型中，先将il1f9-/-小鼠与VP和APCmin/+小鼠进行杂交，得到VP-il1f9-/-和APCmin/+-il1f9-/-小鼠。
对于DSS诱导的溃疡性结肠炎，造模方式如图3A所示。此外，造模成功后，将小鼠结直肠，盲肠和一小部分小肠取出，Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)体重变化结果对比结果如图3A所示，平行摆放在标尺旁测量长度并拍照，拍照图片及Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)结肠长度对比结果如图3B所示，我们由实验结果发现，Il1f9缺失后，小鼠体重减轻得更为缓慢，结肠长度更长。随后截取小鼠靠近肛门部分的结直肠用PBS冲洗干净后进行固定、包埋、切片，通过苏木素-伊红染色(H&E)，实验结果如图3C所示，由实验结果可知，发现Il1f9缺失后结肠部位炎症更轻。
对于AOM/DSS诱导的炎症引起的结肠癌，造模方式如图3D所示。造模成功后，将小鼠的阿结直肠取出并沿中线剪开，用PBS冲洗干净后平行摆放，Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)体重变化结果对比结果如图3D所示，IL1F9缺失后，小鼠体重减少得更为缓慢，另外，Il1f9表达组(Il1f9+/+)与Il1f9缺失组(Il1f9-/-)的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图如图3E所示，由实验结果可知，Il1f9缺失后，结肠部位的肿瘤数目显著减少，肿瘤大小显著减少。
对于VP小鼠模型，造模方式如图3F所示。造模成功后，将Il1f9缺失组和野生组小鼠的结直肠取出并沿中线剪开，用PBS冲洗干净后平行摆放，图片及Il1f9缺失组和野生组的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图如图3G所示，由实验结果可知，Il1f9缺失后，结肠部位肿瘤的发生率显著减少，肿瘤数量明显少于野生型组，肿瘤大小显著减少。
对于自发性消化道肿瘤的Apc小鼠模型。在小鼠第20周大时处死小鼠，观察小肠和结肠，将小鼠的结直肠和小肠分别取出并沿中线剪开，结肠用PBS冲洗干净后平行摆放，图3H为Apc模型中，Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠的结直肠和小肠平行摆放的拍照图片；图3I为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)的结肠部位的肿瘤数目和肿瘤大小对比结果图；图3L为在ApcMin/+突变小鼠中Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)的结肠部位的肿瘤数目对比图；图3M为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠肿瘤发生率对比结果图；我们发现如图3H,I,K,L,M所示，由实验结果可知，Il1f9缺失后，直肠和小肠部位的肿瘤数量较野生型组显著减少，肿瘤体积普遍小于野生型组，小鼠小肠用PBS冲洗干净后进行“瑞士卷样”固定、包埋、切片，通过苏木素-伊红染色(H&E)结果表明，图3K为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)小鼠小肠通过苏木素-伊红染色(H&E)结果对比图；由图可知，小肠的远-近-中段的肿瘤数量和严重程度较野生型组明显减少，肿瘤发生率明显低于野生型组，图3J为Il1f9缺失组(ApcMin/+Il1f9-/-)与野生组(ApcMin/+)生存实验结果对比图；由图可知，Il1f9缺失可以显著延长小鼠的生存期。
综合以上实验结果，我们发现了il1f9缺失后可以显著减少小鼠肠道的炎症和肠道肿瘤的发生，并为临床药物开发提供了潜在的药物靶点。
实施例4：IL1F9缺失的非小细胞肺癌模型小鼠能够通过ROS的积累来抑制肿瘤生长的实验结果图。
本实验在KP/KL肺癌模型诱导的第10周，处死小鼠，对小鼠肺部进行固定、包埋、切片，然后对肺部切片进行免疫组织化学(IHC)染色，通过8-oxo-dGuo(8-羟基脱氧鸟苷，DNA被ROS氧化的标记物)和Ki67(反应细胞增殖水平)染色，图4A为对肿瘤诱导10周后的KL和KL9小鼠肺部组织切片进行8-oxo-dGuo(显示DNA被ROS氧化的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KL和KL9小鼠中，8-oxo-dGuo的染色结果统计图(图右)；图4B为对肿瘤诱导10周后的KP和KP9小鼠肺部组织切片进行8-oxo-dGuo(显示DNA被ROS氧化的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KP和KP9小鼠中，8-oxo-dGuo的染色结果统计图(图右)；图4C为对肿瘤诱导10周后的KL和KL9小鼠肺部组织切片进行Ki-67(细胞增殖的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KL和KL9小鼠中，Ki-67的染色结果统计图(图右)；图4D为对肿瘤诱导10周后的KP和KP9小鼠肺部组织切片进行Ki-67(细胞增殖的标记物)免疫组织化学染色的结果图(图左)，在KP和KP9小鼠中，Ki-67的染色结果统计图(图右)；由此可见，IL1F9缺失的小鼠肺癌模型相较于野生型，其体内的ROS水平更高，而增殖水平更低，表明IL1F9缺陷后可导致体内ROS累积，使细胞处于过氧胁迫环境下，抑制肿瘤细胞的生长。同样地，通过相同的造模方式，制备了荷瘤小鼠的单细胞悬液进行H2DCFDA(可以反应细胞质中ROS的含量)流式染色分析细胞质中的ROS水平，得到了和上述实验一致的结论,结果如图4E。
实施例5：IL1F9的中和性抗体可以治疗肺癌小鼠和DSS处理的结肠炎小鼠
本实验在KP/KL肺癌模型小鼠经Ad-Cre诱导后的第4周，分别将KL和KP小鼠分为两组，一组通过腹腔注射上述纯化蛋白经免疫兔子后产生的抗IL1F9的多克隆抗体，作为实验组；另一组用同型IgG作为对照组，小鼠每隔一天进行腹腔注射给药，每只小鼠每次注射50.0μg中和性抗体或者对照IgG溶于200ul PBS)，给药示意图如图5A所示，注射6周后分析小鼠肺部的肿瘤占全肺面积的比例，图5B为KL小鼠经药物处理或同型IgG处理6周后肺部组织的HE染色结果图(图左)，以及肺部肿瘤占全肺面积的比例(图右)；图5C为KP小鼠经药物处理(PAb)或同型IgG处理6周后肺部组织的HE染色结果图(图左)，以及肺部肿瘤占全肺面积的比例(图右)；(肿瘤诱导方式与实施例2相同)，实验结果表明，对诱导了肺癌的KP/KL小鼠进行抗IL1F9的多克隆抗体治疗可以显著减少小鼠肺部的肿瘤发生，说明可以设计靶向IL1F9的药物来达到治疗肺部肿瘤的目的。
在DSS诱导的结肠炎模型中，用2.5％DSS的drinking water处理饲喂小鼠5天，并在第一天诱导的同时即对小鼠进行腹腔注射抗IL1F9的多克隆抗体，并用同型IgG作为对照，小鼠每天进行腹腔注射给药，直至换水后第三天停止药物处理，每只小鼠每次注射50.0g中和性抗体或者对照IgG溶于200ul PBS)，造模及给药示意图如图5D所示。图5D为给药方式及给药过程中实验组(PAB)与对照组(IgG)体重变化结果对比图；图5E为实验组(PAB)与对照组(IgG)小鼠结直肠，盲肠和一小部分小肠拍照图片及实验组(PAB)与对照组(IgG)结肠长度对比图；图5F为截取如图5E所描述的两组小鼠靠近肛门部分的结直肠通过苏木素-伊红染色(H&E)的实验结果图实验结果表明，对DSS诱导的小鼠结肠炎模型进行抗IL1F9的多克隆抗体治疗可以显著减少小鼠结肠部位的炎症，减缓小鼠的体重损失，提高小鼠结肠的完整性。说明可以设计靶向IL1F9的药物来达到治疗结肠炎的目的，并有可能治疗结直肠癌。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 细胞因子IL1F9在制备检测、预防和治疗肿瘤的产品中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Asp Val Glu Met Glu His Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Ser Ala Met Phe Ser Lys His Pro Phe Ser Thr His Ile Ser Gly Arg
20 25 30
Glu Thr Pro Asp Phe Gly Glu Val Phe Asp Leu Asp Gln Gln Val Trp
35 40 45
Ile Phe Arg Asn Gln Ala Leu Val Thr Val Pro Arg Ser His Arg Val
50 55 60
Thr Pro Val Ser Val Thr Ile Leu Pro Cys Lys Tyr Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Glu Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gln Asn Pro Asp
85 90 95
Lys Cys Leu Phe Cys Lys Glu Val Asn Gly His Pro Thr Leu Leu Leu
100 105 110
Lys Glu Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr His His Pro Glu Pro Met Lys
115 120 125
Pro Phe Leu Phe Tyr His Thr Arg Thr Gly Gly Thr Ser Thr Phe Glu
130 135 140
Ser Val Ala Phe Pro Gly His Tyr Ile Ala Ser Ser Lys Thr Gly Asn
145 150 155 160
Pro Ile Phe Leu Thr Ser Lys Lys Gly Glu Tyr Tyr Asn Ile Asn Phe
165 170 175
Asn Leu Asp Ile Lys Ser
180
<210> 2
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaagagaaa ctcctgactt tggggaggtt tttgacttgg accagcaggt gtggatcttt 60
cgtaatcagg cccttgtgac agttccacga agccacagag taaccccagt cagcgtgact 120
atcctcccat gcaagtaccc agagtctctt gaacaggaca aagggattgc catttatttg 180
ggaattcaga atccagataa atgcctgttt tgtaaggaag ttaatggaca ccctactttg 240
ctgctaaagg aagagaagat tttggatttg taccaccacc ctgagccaat gaagccattc 300
ctgttttacc acacccggac aggtggaaca tccacctttg aatcagtggc tttccctggc 360
cactatattg cctcctccaa gactggcaac cccatcttcc tcacatcaaa aaagggagaa 420
tattacaaca ttaacttcaa tttagatata aagtct 456

Claims (5)

1.检测IL1F9的试剂在制备检测肿瘤产品中的应用，所述肿瘤为结直肠癌，所述IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述检测试剂以IL1F9作为是否患肿瘤的标记物，所述肿瘤为结直肠癌，所述IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.检测IL1F9的试剂在制备检测肿瘤的芯片或试剂盒中的应用，所述肿瘤为结直肠癌，所述IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能的物质在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为结直肠癌，所述IL1F9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，有抑制IL1F9表达、降低和/或中和IL1F9的活性的功能的物质为抗IL1F9的多克隆抗体。
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