CN113046290A - 一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，所述方法为取处于指数生长期的饵料硅藻接种于灭菌的f/2培养基中，置于二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养箱CO2浓度为1000μatm，控制培养基pH变化范围为7.9±0.2，控制硅藻细胞密度小于50万cell·ml‑1；当硅藻特异生长率连续两次接种藻细胞特异生长率统计学差异不显著，即获得长期酸化适应性饵料微藻；在酸化适应性培养过程中测定培养基中硝酸盐、磷酸盐浓度变化，控制4天培养时间内氮磷移除效率小于40％。本发明方法不仅降低了饵料硅藻铜积累效率，同时提高了饵料硅藻生长速度，缩短饵料硅藻培养周期，节省劳动成本。

Description

一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法
技术领域
本发明属于藻类生理生态学领域，具体地涉及一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法。
背景技术
铜离子是海洋藻类生命代谢的重要微量元素，是藻类细胞光合、呼吸代谢通路核心功能蛋白的组成部分，是细胞色素c氧化酶、铜/锌超氧化物歧化酶、氧化酶和脱氢酶等多种酶中的氧化还原辅助因子。然而，铜离子过量则会引起藻体重金属中毒，抑制生长、降低光合效率，并导致氧化损伤。海洋藻类具有较强的重金属富集特性，可以积累高于海水近万倍浓度的铜离子。藻类被滤食性动物摄食后，近一步沿食物链传递，最终威胁人类健康。
近年来，随着社会经济发展，人类活动和地球活动产生的重金属对水环境的污染已成为一个全球性问题，在许多沿海和河口系统的水域和沉积物中发现了高浓度的重金属。海洋硅藻占海洋初级生产力30％以上，具有重要固碳和重金属富集能力。此外，海洋硅藻经常作为水产养殖业的开口饵料，被广泛应用于贝虾育苗企业。硅藻细胞高浓度的重金属离子导致养殖贝虾体组织重金属超标，严重影响了水产养殖企业的发展和食品安全。因此，有效降低饵料硅藻重金属积累水平，对水产动物苗种繁育及规模化养殖意义重大。目前为降低饵料硅藻重金属积累效率，育苗企业主要通过采集低浓度铜洁净海水作为培养基扩配饵料硅藻。然而，对于重金属铜污染严重地区，难以有效降低海水中铜离子水平，致使饵料硅藻及投喂贝类重金属超标。亟需发明一种有效的降低饵料硅藻重金属积累水平的方法。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是建立一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法。本发明通过控制饵料硅藻培养条件，建立了一种有效的降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，利用该系统实现了饵料硅藻重金属铜积累效率下降50％以上。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，它包括饵料硅藻长期酸化适应性培养和培养基氮磷营养水平控制；
所述饵料硅藻长期酸化适应性培养：取处于指数生长期的饵料硅藻接种于灭菌的f/2培养基中，初始接种密度为1万cell ml-1，置于二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养箱CO2浓度为1000μatm，控制培养基pH变化范围为7.9±0.2，控制硅藻细胞密度小于50万cellml-1；充气培养160天后，计算硅藻细胞特异生长率(μ，day-1)，当硅藻特异生长率连续两次接种藻细胞特异生长率统计学差异不显著，即获得长期酸化适应性饵料微藻；
所述培养基氮磷营养水平控制：在酸化适应性培养过程中测定培养基中硝酸盐、磷酸盐浓度变化，控制4天培养时间内氮磷移除效率(NRE)小于40％。进一步，所述硅藻细胞特异生长率(μ，day-1)的计算方法为μ＝(lnN4day-lnN0day)/4。其中，N4day代表培养第4天时藻细胞密度，N0day代表初始接种藻细胞密度。
进一步，所述营养盐移除效率的计算方法为NRE＝100％*(C0day-C4day)/C0day。其中，C4day代表培养第4天时硝酸盐或者磷酸盐浓度，N0day代表初始接种时硝酸盐或磷酸盐浓度。
所述控制4天培养时间内氮磷移除效率(NRE)小于40％的目的是保证培养过程中氮磷营养盐充足。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过饵料硅藻长期酸化适应性培养、营养盐加富培养建立一种降低饵料硅藻重金属铜积累的方法，相比传统采集低铜洁净海水培养饵料硅藻的方法，突破了必须采集洁净环境海水的限制；相比正常空气培养方法，本方法采用二氧化碳充气和营养盐加富培养不仅降低了饵料硅藻铜积累效率，同时提高了饵料硅藻生长速度，缩短饵料硅藻培养周期，节省劳动成本。
附图说明：
图1长期酸化适应性硅藻特异生长率；
图2长期酸化适应性培养过程中培养基中碳酸盐体系变化；
图3牟氏角毛藻酸化培养基中氮磷营养盐浓度变化；
图4二氧化碳充气培养与正常空气充气培养藻细胞生长曲线；
图5二氧化碳充气培养与正常空气充气培养藻细胞铜含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
利用本培养方法进行饵料硅藻牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)的长期酸化培养及重金属铜积累实验。
牟氏角毛藻长期酸化适应性培养：取处于指数生长期的牟氏角毛藻接种于灭菌的f/2培养基中，培养基中硝酸盐和磷酸盐终浓度为880μmol L-1和32μmol L-1。初始接种密度为1万cell ml-1，置于HP-1000G型二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养温度为20℃，光照强度为120μmol photons m-2s-1，光暗周期为12h：12h，设置培养箱CO2浓度为1000μatm。充气培养4天后，采用血球计数板和显微镜观测记录牟氏角毛藻细胞密度变化，计算细胞特异生长率(μ，day-1)，所述硅藻细胞特异生长率(μ，day-1)的计算方法为μ＝(lnN4day-lnN0day)/4。其中，N4day代表培养第4天时藻细胞密度，N0day代表初始接种藻细胞密度。取上述培养4天后的牟氏角毛藻按照上述相同方法再次酸化培养。如此重复上述操作40次，共计160天，计算牟氏角毛藻特异生长率，获得长期酸化适应性牟氏角毛藻。实验期间，每天采用pH计检测培养基pH水平变化，控制培养基pH变化范围为7.9±0.2。采用血球计数板和显微镜观测记录硅藻细胞密度变化，控制细胞密度小于50万cell ml-1，目的是控制藻细胞生长速度和光合呼吸代谢效率，稳定培养基pH变化范围为7.9±0.2。
采用碱度滴定仪测定培养基碱度TA，采用二氧化碳计算软件计算培养基碳酸盐体系变化。实验期间，牟氏角毛藻特异生长率如图1所示，随着酸化培养时间延长，藻体经过160天转化培养，藻体特异生长率基本稳定，保持在0.94±0.01day-1。长期适应期间培养基碳酸盐体系变化如图2所示，其中pH为7.86±0.05，碱度为2378±62，总溶解无机碳为2292±62，碳酸氢根为2142±62，碳酸盐根为97±10，碳酸盐为32±4。
(2)牟氏角毛藻重金属铜积累实验：为对比分析酸化和营养盐加富对牟氏角毛藻铜积累效率的影响。在获取长期酸化适应性培养后的牟氏角毛藻后，采用f/2培养基接种与1L三角烧瓶中，初始接种密度为1万cell ml-1，置于HP-1000G型二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养箱CO2浓度为1000μatm，温度为20±1℃，光照强度为120μmol photons m-2s-1，光暗周期为12h：12h。定义该处理为二氧化碳酸化组(OA)。同步按照相同的培养方式接种正常培养条件下的牟氏角毛藻，并置于普通光照培养箱充空气培养，定义该处理为空气对照组(CK)。二氧化碳酸化组(OA)和空气对照组(CK)分别设置两组处理，即营养盐加富组(OA+N、CK+N)和营养盐非加富组(OA-N、CK-N)。采用pH计检测培养基pH水平变化，通过调整培养基充气速度，控制培养基OA+N组和OA-N组pH水平变化范围为7.9±0.2。此外，模拟近海海水重金属铜污染水平，所有处理组中均分别添加终浓度为0.5μmol L-1的CuSO4·5H2O溶液。
(3)培养基营养盐检测及补充。每天采集不同处理组培养藻液10ml，采用0.45μm孔径的醋酸纤维抽滤后，通过营养盐分析仪测定各自培养基中硝酸盐和磷酸盐浓度，并计算各自移除效率。控制4天培养时间内氮磷移除效率(NRE)小于40％。所述营养盐移除效率的计算方法为NRE＝100％*(C0day-C4day)/C0day。其中，C4day代表培养第4天时硝酸盐或者磷酸盐浓度，N0day代表初始接种时硝酸盐或磷酸盐浓度。所述控制4天培养时间内氮磷移除效率(NRE)小于40％的目的是保证培养过程中氮磷营养盐充足。如图3所示，分别第3天、6天补充硝酸盐、磷酸盐至初始浓度。
(4)牟氏角毛藻铜积累测定。每天采用血球计数板和显微镜观测记录硅藻细胞密度变化，如图4所示，培养第6天时，酸化营养盐加富组(OA+N)、酸化营养盐非加富组(OA-N)、正常营养盐加富组(CK+N)、正常营养盐非加富组(CK-N)中牟氏角毛藻细胞密度分别为202万cell ml-1，187万cell ml-1，87万cell ml-1，80万cell ml-1。分别取50ml藻液离心，而后采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定饵料牟氏角毛藻细胞铜离子含量(μg cell-1)。如图5所示，结果表明，相比正常充气培养，酸化培养显著提高牟氏角毛藻生长效率；酸化和营养盐加富均可显著降低藻体铜积累，相比其他组，酸化和营养盐加富组藻体铜离子水平最低。
实施例2
使用本发明方法对其它品种的硅藻(三角褐指藻、假微型海链藻)进行培养：
所述饵料硅藻长期酸化适应性培养：取处于指数生长期的饵料硅藻接种于灭菌的f/2培养基中，初始接种密度为1万cell ml-1，置于二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养箱CO2浓度为1000μatm，控制培养基pH变化范围为7.9±0.2，控制硅藻细胞密度小于50万cellml-1；充气培养160天后，计算硅藻细胞特异生长率(μ，day-1)，当硅藻特异生长率连续两次接种藻细胞特异生长率统计学差异不显著，即获得长期酸化适应性饵料微藻；
所述培养基氮磷营养水平控制：在酸化适应性培养过程中测定培养基中硝酸盐、磷酸盐浓度变化，控制4天培养时间内氮磷移除效率(NRE)小于40％；
经过相同实验操作，结果表明酸化和营养盐加富培养相比正常培养，均显著提高饵料硅藻生长率，并降低饵料硅藻重金属铜的积累效率。

Claims (3)

1.一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，其特征在于所述方法包括饵料硅藻长期酸化适应性培养和培养基氮磷营养水平控制；
所述饵料硅藻长期酸化适应性培养：取处于指数生长期的饵料硅藻接种于灭菌的f/2培养基中，初始接种密度为1万cell·ml-1，置于二氧化碳培养箱中充气培养，设置培养箱CO2浓度为1000μatm，控制培养基pH变化范围为7.9±0.2，控制硅藻细胞密度小于50万cell·ml-1；充气培养160天后，计算硅藻细胞特异生长率，单位为μ·day-1，当硅藻特异生长率连续两次接种藻细胞特异生长率统计学差异不显著，即获得长期酸化适应性饵料微藻；
所述培养基氮磷营养水平控制：在酸化适应性培养过程中测定培养基中硝酸盐、磷酸盐浓度变化，控制4天培养时间内氮磷移除效率小于40％。
2.根据权利要求1所述的一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，其特征在于所述硅藻细胞特异生长率的计算方法为μ＝(lnN4day-lnN0day)/4，其中，N4day代表培养第4天时藻细胞密度，N0day代表初始接种藻细胞密度。
3.根据权利要求1所述的一种降低海洋硅藻细胞重金属铜积累水平的培养方法，其特征在于所述营养盐移除效率的计算方法为NRE＝100％*(C0day-C4day)/C0day，其中，C4day代表培养第4天时硝酸盐或者磷酸盐浓度，N0day代表初始接种时硝酸盐或磷酸盐浓度。
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Assignor: YELLOW SEA FISHERIES Research Institute CHINESE ACADEMY OF FISHERY SCIENCES

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Denomination of invention: A culture method to reduce the accumulation level of heavy metal copper in marine diatom cells

Granted publication date: 20220517

License type: Common License

Record date: 20221125