CN113045768A - 一种乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳清分离蛋白‑多酚复合物稳定油‑水界面乳液及其制备方法和应用，以乳清分离蛋白和多酚为原料，加入过氧化氢和抗坏血酸作为自由基引发剂，制备乳清分离蛋白‑多酚自由基接枝物溶液，样品经透析后真空冷冻干燥、研磨过筛，作为乳化剂，均匀分散在缓冲液中，经磁力搅拌后加入油相剪切分散形成粗乳液，高压均质处理后形成稳定均匀的纳米乳液。本发明所述方法操作简单，条件温和，制备得到的乳清分离蛋白‑多酚复合物的抗氧化性与原蛋白相比显著提高，并且由其形成的乳液具有明显改善的界面特性，形成了更厚的蛋白吸附膜，具有更强的界面稳定性，在构建稳定乳液及活性物质载运体系领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品科学与工程技术领域，具体涉及一种乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液及其制备方法和应用。
背景技术
在食品，化妆品和制药行业中，许多产品和工艺在基于乳化的基础上，使用合成类的小分子量表面活性剂(如聚山梨酯-80)制备得到稳定的乳液。因为小分子表面活性剂能显著降低油水间的界面张力，可以制备界面稳定性更好的乳液。但是，随着消费者对合成表面活性剂对身体健康不利影响的深入了解和担忧，寻求健康天然、具有更好抗氧化性和界面特性的乳化剂成为消费者和行业的共同目标。
在食品工业生产中，乳清分离蛋白作为工业上制作干酪的副产品，来源广泛，价格低廉，营养价值高，富含多种必需氨基酸且比例合理。因此，作为天然，安全性高且具有两亲性的大分子物质，乳清分离蛋白常常被应用于功能活性物质的载运和输送体系中。但采用单一蛋白质作为乳化剂制备的乳液形成的界面蛋白层较薄，导致所构建乳液载运体系长期稳定性不好；并且由于蛋白质较差的化学稳定性，所载运的活性物质在食品加工和储藏过程易受氧气，光，温度的影响而氧化降解。茶叶中的茶多酚类物质具有强抗氧化性，是目前研究最受关注的一类天然抗氧化剂。因此，为了改善和提高单独使用蛋白质乳化剂的不足，可采用自由基接枝聚合手段对乳清分离蛋白进行可控的多酚改性处理。通过自由基接枝方法在乳清分离蛋白上接枝上小分子的茶多酚，形成复合物，在乳清分离蛋白良好的乳化性基础上赋予其茶多酚的抗氧化性。此方法操作条件温和，无副反应及有害产物产生，可进一步拓宽乳清分离蛋白在食品领域中的应用。
目前，大部分对乳清分离蛋白的化学改性是进行糖基化改性形成蛋白质-多糖复合物，而采用自由基接枝方法，以抗坏血酸和过氧化氢体系为自由基引发剂在乳清分离蛋白改性领域中的研究较少,现有的研究更多关注于与多酚接枝后的蛋白质抗氧化性的改善，而对接枝后蛋白质界面稳定性的改善也鲜见报道。因此，通过自由基接枝聚合技术对乳清分离蛋白进行改性，得到乳清分离蛋白-多酚复合物，赋予乳清分离蛋白强的抗氧化能力，这对于开发一种具有良好界面稳定性及抗氧化性的天然乳化剂，具有重要的价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液的制备方法。本发明方法操作简单，绿色且无有毒害产物产生，采用的原料为乳清分离蛋白，原料来源广泛，价格低廉，制备成的复合物同时具备良好抗氧化性和界面特性，可作为抗氧化型乳化剂使用，在活性物质载运体系及构建稳定乳液方面具有广阔的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1:将乳清分离蛋白溶于水，制成乳清分离蛋白溶液，加入自由基引发剂，室温下水浴震荡进行反应，然后添加多酚形成乳清分离蛋白-多酚自由基接枝物溶液；
S2:利用得到的自由基接枝物溶液进行透析，之后将样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体粉末，经研磨过筛得到颗粒均匀的乳清分离蛋白-多酚接枝物固体粉末；
S3:以所述乳清分离蛋白-多酚接枝物作为乳化剂，均匀分散在缓冲液中，经磁力搅拌，作为水相，加入油相剪切分散形成粗乳液，之后对所述粗乳液进行高压均质处理，形成稳定均匀的纳米乳液。
根据本发明，水通常采用本领域技术人员常规采用的实验用水，包括但不限于去离子水。
作为优选方案，步骤S1所述的乳清分离蛋白与多酚的质量比为40:1-10:1。
作为优选方案，步骤S1所述的自由基引发剂为过氧化氢和抗坏血酸。
作为优选方案，步骤S1所述的过氧化氢的最终浓度为0.05mol/L-0.25mol/L，抗坏血酸的最终浓度为5g/L-40g/L。
作为优选方案，步骤S1所述的多酚为儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯中的任意一种。
作为优选方案，步骤S1所述的乳清分离蛋白与自由基引发剂反应产生自由基的条件为25℃下水浴震荡2h，多酚与乳清分离蛋白溶液的反应条件为25℃水浴震荡24h。
作为优选方案，步骤S2所述的将得到的乳清分离蛋白-多酚复合物进行透析处理48-72h，透析温度为4-8℃，透析袋截留分子量为12000-14000道尔顿。
作为优选方案，步骤S2所述的经真空冷冻干燥后得到的乳清分离蛋白-多酚接枝物产物需经研磨后，得到粉碎至粒度为80-100目的固体粉末。
作为优选方案，步骤S3所述的将乳清分离蛋白-多酚固体粉末分散于pH7.0，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌3-6h。
作为优选方案，步骤S3所述的水相与油相的体积比例为9：1。
作为优选方案，步骤S3所述的油相可选自玉米油、中链脂肪酸甘油酯、甜橙油中的任意一种。
作为优选方案，步骤S3所述的剪切分散的转速为8000-10000rpm，时间为3-5min。
作为优选方案，步骤S3所述的高压均质的压力为90-110MPa，均质循环3-6次。
本发明还要求保护由所述方法制备得到的乳清分离蛋白-多酚接枝物，及其在食品领域中的应用。
本发明还要求保护由所述方法制备得到的乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液，及其在食品领域中的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用自由基接枝法应用于乳清分离蛋白的多酚接枝改性，所述方法以过氧化氢和抗坏血酸为氧化还原体系，相比于目前市场上乳状液产品所使用的合成或半合成小分子乳化剂，不仅原料成分安全天然，成本低廉，操作方法简单高效，而且在反应过程中无有机溶剂的使用及毒害副产物的产生，适用于工业上的大规模生产应用。
(2)本发明的乳清分离蛋白-多酚复合物相较于乳清分离蛋白，具有显著的强抗氧化性。
(3)与单一的乳清分离蛋白相比，本发明利用乳清分离蛋白-多酚复合物作为乳化剂构建的乳液体系具有更好的界面稳定性，乳液的界面稳定性与界面蛋白的吸附量和界面张力直接相关，同时自由基接枝反应使改性的乳清分离蛋白在油水界面上可以形成更致密和更厚的界面蛋白层。本发明所构建的乳液体系可形成油-水界面更为稳定的纳米乳液。
附图说明
图1为不同蛋白浓度对界面张力的影响。
图2为不同蛋白浓度对界面吸附膜厚度的影响。
图3为不同蛋白浓度对界面蛋白吸附量的影响。
图4(A)和(B)为乳液表观粘度随剪切速率变化的关系图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明所采用的方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1:
取50mL浓度为1％(w/v)的乳清分离蛋白溶液，加入1mL过氧化氢溶液(10M)和2g抗坏血酸，充分溶解后放置于25℃水浴摇床中震荡2h后，加入0.025g儿茶素，继续在摇床中25℃反应24h。之后将样品溶液装入截留分子量为12000-14000道尔顿的透析袋中，于4℃下进行透析处理48-72h，直至未接枝的儿茶素完全透析出去，然后将得到的样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体产品。最后将其研磨后粉碎，得到粒度为100目的乳清分离蛋白-儿茶素粉末。
实施例2:
取50mL浓度为1％(w/v)的乳清分离蛋白溶液，加入2mL过氧化氢溶液(10M)和1g抗坏血酸，充分溶解后放置于25℃水浴摇床中震荡2h后，加入0.025g儿茶素，继续在摇床中25℃反应24h。之后将样品溶液装入截留分子量为12000-14000道尔顿的透析袋中，于4℃下进行透析处理48-72h，直至未接枝的儿茶素完全透析出去，然后将得到的样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体产品。最后将其研磨后粉碎，得到粒度为90目的乳清分离蛋白-儿茶素粉末。
实施例3：
取50mL浓度为1％(w/v)的乳清分离蛋白溶液，加入0.5mL过氧化氢溶液(10M)和0.25g抗坏血酸，充分溶解后放置于25℃水浴摇床中震荡2h后，加入0.025g表没食子儿茶素没食子酸酯，继续在摇床中25℃反应24h。之后将样品溶液装入截留分子量为12000-14000道尔顿的透析袋中，于4℃下进行透析处理48-72h，直至未接枝的儿茶素完全透析出去，然后将得到的样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体产品。最后将其研磨后粉碎，得到粒度为80目的乳清分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯粉末。
实施例4：
以实施例3得到的乳清分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物作为乳化剂，使用磷酸盐缓冲溶液(0.01mM，pH＝7.0)配制质量浓度为0.7％(w/w)的复合物溶液，并在室温(25℃)下磁力搅拌(100r/min)3h，磁力搅拌均匀后，以中链甘油三酸酯(MCT)为油相，将水相和油相以9:1的比例混合，在高速分散机的搅拌作用下将油相缓慢加入水相中，剪切转速9000rpm，分散3min制得粗乳液，再将制得的粗乳液通过高压均质机在100MPa下循环均质4次以形成O/W的乳液。
对照例1：
取50mL浓度为1％(w/v)的乳清分离蛋白溶液，充分溶解后放置于25℃水浴摇床中震荡2h后，继续在摇床中25℃震荡24h。之后将样品溶液装入截留分子量为12000-14000道尔顿的透析袋中，于4℃下进行透析处理48-72h，然后将得到的样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体产品。最后将其研磨后粉碎，得到粒度为100目的乳清分离蛋白粉末。
对照例2：
以对照例1得到的乳清分离蛋白作为乳化剂，使用磷酸盐缓冲溶液(0.01mM，pH＝7.0)配制质量浓度为0.7％(w/w)的复合物溶液，并在室温(25℃)下磁力搅拌(100r/min)4h，磁力搅拌均匀后，以中链甘油三酸酯(MCT)为油相，将水相和油相以9:1的比例混合，在高速分散机的搅拌作用下将油相缓慢加入水相中，剪切转速10000rpm，分散3min制得粗乳液，再将制得的粗乳液通过高压均质机在110MPa下循环均质3次以形成O/W的乳液
性能测试例
以实施例1-3和对照例1制备的样品为测试对象，进行抗氧化性测试，结果如表1所示：
表1乳清分离蛋白-多酚复合物抗氧化性测定
DPPH自由基清除能力和铁还原力的测试值代表样品的抗氧化能力，数值越大代表抗氧化性越强，由表1可以看出，经过接枝以后，与对照例相比，按照本发明制备的实施例1-3的抗氧化性均有显著提高。
以实施例3和对照例1为测试对象，将其溶于磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的蛋白溶液，进行界面张力的测试，结果如图1所示
界面张力越低，越有利于形成稳定的乳状液。由图1可以看出加入不同浓度的实施例3和对照例1都可以显著降低MCT油和水之间的界面张力，随着蛋白浓度的增大，界面张力呈现先降低后趋于平缓的趋势，原因可能是蛋白浓度增大到溶液趋于饱和时，界面张力降低的效果便不明显，而根据本发明制备的乳清分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物与乳清分离蛋白比，降低油水界面张力的能力更强。
以实施例3和对照例1为测试对象，将其溶于磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的蛋白溶液，进行吸附膜厚度的测试，结果如图2所示。
由图2可以看出，随着蛋白浓度的增大，吸附膜厚度增加，在同一浓度下，与对照例1相比，实施例3的界面吸附膜厚度都明显上升，说明按照本发明制备得到的乳清分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物在乳液中可形成更厚的界面蛋白吸附膜，从而形成界面更稳定的乳液。
以实施例4和对照例2为测试对象，将其溶于磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的蛋白溶液，进行界面蛋白吸附量的测试，结果如图3所示。
由图3可以看出，对照例2的界面蛋白吸附量随着蛋白浓度的增大呈现先增大后减少的趋势，原因可能是随着蛋白浓度的增加，形成乳液后，乳液界面上的蛋白逐渐趋于饱和状态，乳清分离蛋白形成的乳液液滴不够稳定，进而析出，而实施例4的界面蛋白吸附量则随着蛋白浓度的增大呈现增长的趋势。
以实施例4和对照例2为测试对象，将其溶于磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的蛋白溶液，进行粘度的测试，结果如图4所示。
乳液的粘度是评价乳液的重要理化指标，乳状液的粘度越大，其液滴沉降或上浮速率就越小，乳状液表现出更强的物理稳定性。图4的(A)与(B)分别表示对照例2和实施例4的乳液表观粘度与剪切速率的关系图，对照例2和实施例4的表观粘度均随剪切速率的增加而下降，一开始表现出剪切稀释行为，即假塑性流体特征，且实施例4的表观粘度大于对照例2的表观粘度，后面随着剪切速率的增加，二者均表现出牛顿型流体特征。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将乳清分离蛋白溶于水，制成乳清分离蛋白溶液，加入自由基引发剂，室温下水浴震荡进行反应，然后添加多酚形成乳清分离蛋白-多酚自由基接枝物溶液；
S2:将得到的自由基接枝物溶液进行透析，透析后的样品溶液进行真空冷冻干燥得到固体粉末，经研磨过筛得到颗粒均匀的乳清分离蛋白-多酚接枝物固体粉末；
S3:以所述乳清分离蛋白-多酚接枝物作为乳化剂，均匀分散在缓冲液中，经磁力搅拌，作为水相，加入油相剪切分散形成粗乳液，对所述粗乳液进行高压均质处理，形成稳定均匀的纳米乳液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述的自由基引发剂为过氧化氢和抗坏血酸，其中过氧化氢的最终浓度为0.05mol/L-0.25mol/L，抗坏血酸的最终浓度为5g/L-40g/L，所述的多酚为儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯中的任意一种，乳清分离蛋白与多酚的质量比为40:1-10:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述的自由基引发剂和乳清分离蛋白溶液的反应条件为25℃水浴震荡2h，多酚与乳清分离蛋白溶液的反应条件为25℃水浴震荡24h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述透析条件为透析温度4-8℃，透析时间48-72h，透析袋截留分子量为12000-14000道尔顿；所述的乳清分离蛋白-多酚接枝物的固体粉末研磨后，粉碎至粒度80-100目。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述的缓冲液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.0；所述油相可选自玉米油、中链脂肪酸甘油酯、甜橙油中的任意一种，所述的水相与油相的比例为9:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述磁力搅拌时间为3-6h，剪切分散的转速为8000-10000rpm，时间为3-5min，高压均质的压力为90-110MPa，均质循环3-6次。
7.一种复合物，其特征在于，为权利要求1-8任一项所述的方法得到的乳清分离蛋白-多酚接枝物。
8.一种稳定的纳米乳液，其特征在于，为权利要求1-8任一项中所述的方法制备得到的乳清分离蛋白-多酚复合物稳定油-水界面乳液。
9.权利要求7所述的复合物在食品领域中的应用。
10.权利要求8所述的纳米乳液在食品领域中的应用。
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