CN113045760A - 一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料的技术领域，公开了一种基于透明质酸和α‑D‑半乳糖的聚合物刷及其制备方法和应用。所述聚合物刷的结构为式I，其中，n为25～60的整数，x为280～427的整数，y为90～150的整数。本发明还公开了基于透明质酸和α‑D‑半乳糖的聚合物刷的制备方法。本发明的基于透明质酸和α‑D‑半乳糖的聚合物刷能为软骨细胞提供营养物质，增强软骨细胞在软骨组织工程支架中的粘附，促进软骨细胞的增殖，还能改善软骨摩擦性能，达到更佳的修复效果。本发明的聚合物刷用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架，作为软骨细胞营养物；并且本发明的聚合物刷还可用来制备改善软骨修复材料摩擦的仿生润滑剂。

Description

一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种基于透明质酸和α-D-半乳糖聚合物刷及其制备方法和在生物医药领域中的应用。所述基于透明质酸的α-D-半乳糖聚合物刷特别适合用于软骨组织工程，在负载了软骨细胞的工程支架中为软骨细胞提供营养，促进软骨细胞分泌软骨基质，并有潜力与软骨修复材料结合改善摩擦性能。
背景技术
目前临床上对于中后期的关节软骨损伤修复策略主要有自体软骨细胞移植术和微骨折术。整合现有临床研究的数据发现，自体软骨细胞移植相比于微骨折手术能带来更加稳定长久的临床功能，并且在一定程度上能达到缓解疼痛、提高功能的目的。此外，对于局灶性软骨缺损的患者来说，基于支架的治疗方案变得更加容易，为了保持软骨细胞表型稳定性和促进软骨再生，需要设计一种优化细胞微环境的仿生支架。软骨是一种无血管、淋巴管、神经的致密组织，软骨细胞主要通过关节滑液的扩散渗透得到营养物质。在软骨组织工程设计的支架中负载细胞，仍面临营养递送效率较低的问题。
在软骨组织工程中，如何提高营养递送效率、增强软骨细胞在软骨组织工程支架中的粘附，促进软骨细胞的增殖，同时改善软骨修复材料的摩擦性能，成为人们需要解决的问题之一。
本发明以高分子量的透明质酸为主链，聚半乳糖为侧链，由简单的化学接枝制备仿生刷状糖分子，通过物理缠结负载于软骨组织工程支架中，既可为软骨细胞提供良好的粘附点，又能在软骨细胞周围直接提供大量分泌基质时所需的营养物质，在优化细胞微环境方面具有很大应用潜力，同时该分子具有良好的水溶性，与软骨修复材料结合改善摩擦性能。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷。
本发明另一目的在于提供一种上述基于透明质酸和α-D-半乳糖聚合物刷的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的应用。所述基于透明质酸和α-D-半乳糖聚合物刷在生物医药领域中的应用，特别用于软骨组织工程，将基于透明质酸和α-D-半乳糖聚合物刷与软骨组织工程支架复合，在负载软骨细胞的复合软骨组织工程支架中刺激软骨细胞进行合成代谢，为软骨细胞提供营养物质，增强软骨细胞在软骨组织工程支架中的粘附，促进软骨细胞的增殖。本发明的基于透明质酸和α-D-半乳糖聚合物刷还用作软骨细胞营养物，同时还可用来制备改善软骨修复材料摩擦的仿生润滑剂。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷，其结构为式I：
Figure BDA0003016377870000021
其中，n为25～60的整数，x为280～427的整数，y为90～150的整数。
上述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，包括以下步骤：
(1)将透明质酸和己二酸二酰肼混合反应，得到氨基改性透明质酸；
(2)以6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖为聚合单体，在引发剂和链转移剂作用下，经可逆加成断裂链转移自由基聚合，然后脱去吡喃环上羟基保护基团异亚丙基，获得末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)；
(3)将氨基改性透明质酸、末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)和活化剂混合，并在溶液体系中反应，得到基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷。
步骤(1)中所述反应的温度为25～35℃。所述透明质酸和己二酸二酰肼的质量比为1∶4～1∶17.4。
所述反应以水为反应介质；反应前，调节反应体系pH为4～6。所述反应的体系还包括EDC；EDC与己二酸二酰肼的质量比为(0.05～0.11)∶1。所述反应的时间以反应至体系pH不变为准。反应的时间大概为4-6h。
步骤(2)中所述链转移剂为4-氰基-4-[丁基磺酰硫羰基磺酰]戊酸(CTA)；所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖与CTA的摩尔比为25∶1～180∶1，优选为40∶1～165∶1。
步骤(2)中所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖的结构为
Figure BDA0003016377870000031
步骤(2)中所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖是将双丙酮-D-半乳糖与甲基丙烯酸酐进行反应获得；
所述双丙酮-D-半乳糖与甲基丙烯酸酐进行反应是指在有机溶剂中，双丙酮-D-半乳糖与甲基丙烯酸酐加热反应，加水继续搅拌1～2h，冷却，后续处理。
双丙酮-D-半乳糖和甲基丙烯酸酐的质量体积比为15g∶(15-25)mL。所述加热反应的条件为60-70℃反应4-6h。
步骤(2)中所述自由基聚合以有机溶剂为反应介质，所述有机溶剂为1，4-二氧六环、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中一种以上。
步骤(2)所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)、偶氮二异庚腈、过氧化二苯甲酰中一种以上；所述引发剂与链转移剂的摩尔比优选为1∶3-1∶5。
步骤(2)中所述自由基聚合的条件为65～75℃下反应12～48h，更优选为在75℃下反应16h。
所述自由基聚合反应完后，进行后续处理；所述后续处理是指淬灭反应后，采用甲醇进行醇沉，采用有机溶剂溶解，真空干燥。
所述脱去吡喃环上羟基保护基团异亚丙基是指采用三氟乙酸溶液脱除聚合产物中吡喃环上羟基保护基团异亚丙基。
步骤(3)所述反应指在25～35℃下反应18～24h，更优选为在30℃下反应24h。
步骤(3)中所述氨基改性透明质酸和末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)的量可为任意比例，或根据结构设计所需进行调整，以氨基与羧基的摩尔比为准，优选为3∶1～1∶2。
步骤(3)中反应前，调节反应体系的pH为4.5～5.5。
步骤(3)所述溶液体系优选为水溶液。
步骤(3)中所述活化剂指1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS体系)或者二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(DCC/DMAP体系)。
EDC/NHS的摩尔比为1∶1。活化剂用量5-50mM。
本发明的基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷与软骨组织工程支架复合，模拟天然软骨中软骨细胞微环境，为支架中的软骨细胞直接提供大量合成基质所需的营养原料，并与细胞膜表面蛋白受体作用利于细胞粘附。因此可应用于生物医药领域中，特别适用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架，并有潜力与软骨修复材料相结合以改善其摩擦性能。
软骨细胞通过莱洛伊尔途径(Leloir Pathway)在高尔基体内以半乳糖为原料分泌一系列蛋白聚糖的前体，在生成硫酸软骨素、硫酸角质素等糖胺聚糖，蛋白质与碳水化合物、脂类分子和蛋白质糖基化中起重要作用。成骨细胞也可利用半乳糖合成蛋白聚糖。其次，半乳糖是蛋白质-糖类分子链间连接桥的主要组成单糖，在细胞表面的长链半乳糖基转移酶(β1，4-GalT-I异构体)，可结合细胞外基质中N-乙酰氨基葡萄糖的寡糖底物或配体——即半乳糖，在各细胞相互作用中起细胞粘附细胞、细胞粘附基质的作用。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的制备方法具有线路简单，操作方便，提纯容易，收率较高等优点；
(2)本发明的聚合物刷用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架时，增强软骨细胞基质分泌并促进软骨再生，或改善软骨摩擦性能，达到更佳的修复效果；
(3)本发明的聚合物刷用于制备软骨细胞营养物；
(4)本发明的聚合物刷作为改善软骨修复材料摩擦的仿生润滑剂。
附图说明
图1为本发明的聚合物刷的合成路线示意图，其中，a为己二酸二酰肼改性透明质酸反应示意图；b为基于α-D-半乳糖的聚合反应示意图；c为瓶刷状聚合物制备反应示意图；
图2为实施例1所得聚合物刷状分子的核磁谱图；
图3为实施例1所得聚合物刷状分子与软骨细胞共培养的细胞毒性测试结果图；
图4为实施例1所得聚合物刷状分子与软骨细胞共培养的活死染色结果图；
图5为实施例3所得聚合物刷状分子的摩擦性能测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中的试剂均可从市场购买得到。
实施例中6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖通过以下制备步骤得到：15g双丙酮-D-半乳糖和20mL甲基丙烯酸酐溶于35mL无水吡啶，65℃反应5h后，加入与该体系等体积的去离子水于反应温度下继续搅拌2h，随后冷却至室温搅拌过夜。由等体积的石油醚萃取三次后，有机相逐步用100mL 5％氢氧化钠水溶液、100mL去离子水各洗涤2-3次，有机相用无水硫酸镁/无水硫酸钠干燥，由旋蒸仪浓缩后柱层析法纯化，洗脱液∶石油醚/乙酸乙酯＝3∶1-6∶1。
图1为本发明的聚合物刷的合成路线示意图，其中，a为己二酸二酰肼改性透明质酸反应示意图；b为基于α-D-半乳糖的聚合反应示意图；c为瓶刷状聚合物制备反应示意图。
实施例1
(1)将100mg分子量为100～150万透明质酸溶于20mL去离子水，搅拌溶解后加入1.736g己二酸二酰肼与透明质酸溶液混合，己二酸二酰肼与透明质酸的质量比为17.36∶1，用1mol/L盐酸将溶液pH值调节为4.7，以固体形式加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)0.191g，继续将溶液pH值调节至4.75，在30℃下反应至pH值不变，透析冻干，得到氨基改性透明质酸；1g氨基改性透明质酸约1.7mmol氨基；
(2)将3.28g 6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖溶于10mL 1，4-二氧六环，得到单体溶液；称取85mg 4-氰基-4-[丁基磺酰硫羰基磺酰]戊酸(CTA)为链转移剂，称取9.7mg偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将引发剂和链转移剂溶于100μL溶剂(1，4-二氧六环)，后加入单体溶液，除氧后在75℃下反应16h，液氮猝灭反应，用20倍体积甲醇沉淀产物，然后用四氢呋喃重溶产物，重复3次真空干燥后，用三氟乙酸∶水＝4∶1(体积比)溶液脱保护(溶解搅拌3h)，透析冻干，得到末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)(PMAgala)；1g聚半乳糖约0.15mmol羧基；
(3)取步骤(1)产物50mg(50mg的产物中氨基的摩尔量为0.085mmol氨基)和步骤(2)中产物200mg(200mg的产物中羧基的摩尔量为0.03mmol羧基)溶于去离子水，调节pH值为5.5，加入EDC/NHS 60mg(1∶1，n/n)于30℃，在pH＝5.5下反应24h，反应结束后调节pH为7.0左右，透析冻干，得到基于透明质酸和α-D-半乳糖的糖分子聚合物刷；产率约为64.7％。氨基改性透明质酸的接枝率可由核磁氢谱特征峰比例计算，由透明质酸双糖单元数量计算出氨基接枝量，通过凝胶渗透色谱计算聚(α-D-半乳糖)分子量，可推算出聚合度。
对本实施例的聚合物刷进行核磁测试，结果见图2。
实施例2
(1)将100mg分子量为100～150万透明质酸溶于20mL去离子水，搅拌溶解后加入435.4mg己二酸二酰肼与透明质酸溶液混合，己二酸二酰肼与透明质酸的质量比为4.35∶1，用1mol/L盐酸将溶液pH值调节为4.7，以固体形式加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)30mg，继续将溶液pH值调节至4.8，在30℃下反应至pH值不变，透析冻干，得到氨基改性透明质酸；1g氨基改性透明质酸0.47mmol氨基；
(2)将3.28g 6-0-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖溶于10mL 1，4-二氧六环，称取33mg4-氰基-4-[丁基磺酰硫羰基磺酰]戊酸(CTA)为链转移剂，称取3.8mg偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将引发剂和链转移剂溶于100μL 1，4-二氧六环，后加入单体溶液，除氧后在75℃下反应14h，液氮猝灭反应，用20倍体积甲醇沉淀产物，然后用四氢呋喃重溶产物，重复3次真空干燥后，用三氟乙酸：水＝4∶1溶液脱保护(溶解搅拌3h)，透析冻干，得到末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)(PMAgala)；1g的末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)中含有0.095mmol；
(3)取步骤(1)产物50mg(50mg的产物中氨基的摩尔量为0.0235mmol)和步骤(2)中产物400mg(400mg的产物中羧基的摩尔量为0.038mmol)溶于去离子水，调节pH值为5.5，加入EDC/NHS 60mg(1∶1，n/n)于30℃，在pH＝5.5下反应24h，反应结束后调节pH为7.0左右，透析冻干，得到基于透明质酸和α-D-半乳糖的糖分子聚合物刷；产率约57.2％。
实施例3
1)将100mg分子量为100～150万透明质酸溶于20mL去离子水，搅拌溶解后加入868mg己二酸二酰肼与透明质酸溶液混合，己二酸二酰肼与透明质酸的质量比为8.68∶1，用1mol/L盐酸将溶液pH值调节为4.75，以固体形式加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)60mg，继续将溶液pH值调节至4.8，在30℃下反应至pH值不变，透析冻干，得到氨基改性透明质酸；1g改性透明质酸约有0.95mmol；
(2)将3.28g6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖溶于10mL 1，4-二氧六环，称取18.0mg4-氰基-4-[丁基磺酰硫羰基磺酰]戊酸(CTA)为链转移剂，称取2.1mg偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将引发剂和链转移剂溶于50μL溶剂，后加入单体溶液，除氧后在75℃下反应14h，液氮猝灭反应，用20倍体积甲醇沉淀产物，然后用四氢呋喃重溶产物，重复3次真空干燥后，用三氟乙酸∶水＝4∶1溶液脱保护3h，透析冻干，得到末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)(PMAgala)；1g的末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)中含有0.067mmol；
(3)取步骤(1)产物50mg(50mg的产物中氨基的摩尔量为0.0475mmol)和步骤(2)中产物400mg(400mg的产物中羧基的摩尔量为0.0268mmol)溶于去离子水，调节pH值为5.5，加入EDC/NHS 60mg(1∶1，n/n)于30℃，在pH＝5.5下反应24h，反应结束后调节pH为7.0左右，透析冻干(100w分子量透析袋透析4天，冻干程序梯度升温：-25℃，-10℃，0℃，10℃，20℃，30℃)，得到基于透明质酸和α-D-半乳糖的糖分子聚合物刷；产率约41.5％。
性能测试：
对实施例1制备得到的聚合物刷紫外光下直射12h灭菌后分别与原代兔软骨细胞共培养7天，分别配置0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2.5mg/mL，4mg/mL聚合物刷培养基，在第1、3、5、7天时通过CCK-8试剂盒在37℃下孵育4h，使用酶标仪测定450nm处吸光度测定其细胞毒性，结果见图3，该结果表明糖分子聚合物刷培养基浓度在2.5mg/mL以下对软骨细胞有促进增殖的作用。
对实施例1制备得到的聚合物刷和透明质酸紫外光下直射12h灭菌后分别与原代兔软骨细胞共培养7天，分别配置0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2.5mg/mL，4mg/mL聚合物刷培养基，在第1、3、5、7天时与Calcein-AM和PI活/死细胞染色剂工作液在37℃下孵育15min，通过Leica倒置荧光显微镜拍摄其在激发波长488nm和540nm处照片，结果见图4，该结果与细胞毒性结果相一致。
对实施例3制备得到的聚合物刷利用UMT-2摩擦仪对其润滑性能进行检测，具体方法如下：
以浸没在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的健康猪软骨为空白对照组，配置浓度1mg/mL的聚合物刷溶液，将猪软骨(1cm×2cm×0.5mm)固定于加载片下方，于1mg/mL聚合物刷溶液中测量其摩擦系数，每组均重复3次取平均值，结果见图5。该结果表明实施例3所得糖分子聚合物刷摩擦系数比空白对照组小，有潜力起到润滑作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷，其特征在于：其结构为式I：
Figure FDA0003016377860000011
其中，n为25～60的整数，x为280～427的整数，y为90～150的整数。
2.根据权利要求1所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将透明质酸和己二酸二酰肼混合反应，得到氨基改性透明质酸；
(2)以6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖为聚合单体，在引发剂和链转移剂作用下，经可逆加成断裂链转移自由基聚合，然后脱去吡喃环上羟基保护基团异亚丙基，获得末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)；
(3)将氨基改性透明质酸、末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)和活化剂混合，并在溶液体系中反应，得到基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷；
步骤(2)中所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖的结构为
Figure FDA0003016377860000012
步骤(2)中所述链转移剂为4-氰基-4-[丁基磺酰硫羰基磺酰]戊酸。
3.根据权利要求2所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述透明质酸和己二酸二酰肼的质量比为1∶4～1∶17；
步骤(2)中所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖与链转移剂的摩尔比为25∶1～180∶1；
步骤(3)中所述氨基改性透明质酸和末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)的用量：氨基改性透明质酸中氨基与末端带有羧基的聚(α-D-半乳糖)中羧基的摩尔比3∶1～1∶2。
4.根据权利要求2所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述反应以水为反应介质；反应前，调节反应体系pH为4～6；所述反应的体系还包括EDC；
步骤(3)中反应前，调节反应体系的pH为4.5～5.5；
步骤(3)所述溶液体系为水溶液。
5.根据权利要求2所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述反应的时间以反应至体系pH不变为准；
步骤(1)中所述反应的温度为25～35℃；
步骤(2)中所述自由基聚合的条件为65～75℃下反应12～48h；
步骤(2)中所述脱去吡喃环上羟基保护基团异亚丙基是指采用三氟乙酸溶液脱除聚合产物中吡喃环上羟基保护基团异亚丙基；
步骤(3)所述反应指在25～35℃下反应18～24h；
步骤(3)中所述活化剂为EDC/NHS体系或者DCC/DMAP体系。
6.根据权利要求2所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述自由基聚合反应完后，进行后续处理；
步骤(2)中所述自由基聚合以有机溶剂为反应介质；
步骤(2)所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异庚腈、过氧化二苯甲酰中一种以上；
所述引发剂与链转移剂的摩尔比为1∶3-1∶5。
7.根据权利要求6所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述后续处理是指淬灭反应后，采用甲醇进行醇沉，采用有机溶剂溶解，真空干燥；
步骤(2)中所述有机溶剂为1，4-二氧六环、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中一种以上。
8.根据权利要求1所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述6-O-甲基丙烯酰-双丙酮半乳糖是将双丙酮-D-半乳糖与甲基丙烯酸酐进行反应获得；
双丙酮-D-半乳糖和甲基丙烯酸酐的质量体积比为15g∶(15-25)mL；所述加热反应的条件为60-70℃反应4-6h。
9.根据权利要求1所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的应用，其特征在于：所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架。
10.根据权利要求1所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷的应用，其特征在于：所述基于透明质酸和α-D-半乳糖的聚合物刷用于制备软骨细胞营养物或制备改善软骨修复材料摩擦的仿生润滑剂。
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