CN113045588B - 氮硫杂环化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氮硫杂环化合物及其制备方法和应用，该氮硫杂环化合物的制备方法包括：将N‑(N‑L‑γ‑谷氨酰基‑L‑半胱氨酰基)甘氨酸(Glutathione，还原型谷胱甘肽，简写为GSH)与柠檬酸(Citric acid，简写为CA)通过热解法制备碳点荧光团；将所述碳点荧光团通过色谱分离，以得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物，
Figure DDA0002985764790000011
Figure DDA0002985764790000012
利用特定的分离手段从N‑(N‑L‑γ‑谷氨酰基‑L‑半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸制备的CDs中成功分离2个新化合物(能发出蓝绿色的荧光团)。有利于对CDs形成过程和荧光机理进行研究，且分离得到的2个新化合物荧光性能优异，具有很好的生物相容性。

Description

氮硫杂环化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光材料技术领域，具体而言，涉及一种氮硫杂环化合物及其制备方法和应用。
背景技术
碳量子点(carbon dots，CDs)是一种碳基零维材料。碳量子点具有优秀的光学性质，良好的水溶性、低毒性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点。自从碳量子点被首次发现以来，人们开发出了许多合成方法，包括电弧放电法、激光销蚀法、电化学合成法、化学氧化法、燃烧法、水热合成法、微波合成法、模板法等。碳量子点的应用广泛，在医学成像技术、环境监测、化学分析、催化剂制备、能源开发等许多的领域都有较好的应用前景。
然而，由于合成CDs的方法是多样且复杂的，再加上监控CDs形成过程方法的不完善，因此，CDs的形成过程仍然是一个开放性的话题，荧光机理研究仍然需要被深入。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氮硫杂环化合物及其制备方法和应用，以改善上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种氮硫杂环化合物，其化学结构如式(Ⅰ) 或式(Ⅱ)所示：
Figure GDA0003542654590000021
第二方面，本发明还提供了一种上述氮硫杂环化合物的制备方法，其包括：
将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸(Glutathione，还原型谷胱甘肽，简写为GSH)与柠檬酸(Citric acid，简写为CA)通过热解法制备碳点荧光团；
将所述碳点荧光团通过色谱分离，以得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
可选地，热解法制备碳点荧光团包括：将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的混合水溶液在65～75℃的温度下进行干燥，再将干燥混合物在160～220℃的温度下热解。
可选地，在65～75℃的温度下的干燥时间为10～14h，优选12h；在 180～220℃的温度下热解的时间为0.5～2.5h，优选2.5h。
可选地，N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的摩尔比 1～2：2～3，优选3～4：4～5，更优选4：5。
可选地，将所述碳点荧光团进行色谱分离包括：以正相硅胶柱为色谱柱，通过二氯甲烷和石油醚作为流动相对所述碳点荧光团进行洗脱，洗脱体积为4BV，其中，二氯甲烷和石油醚的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选 1：1；再调整流动相为二氯甲烷和甲醇对所述碳点荧光团进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为90～110：1、25～35：1，对应的洗脱体积依次为10BV、5BV，以得到三种组分Fr.1～Fr.3；然后将Fr.2进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为400～550：1、90～110：1、25～35：1，得到组分Fr.2-1～Fr.2-3；对应的洗脱体积依次为4BV、4BV、5BV；将Fr.2-2 过制备型液相色谱分离得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
第三方面，本发明还提供了一种碳点荧光团，其包括上述式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
第四方面，本发明还提供了一种碳量子点溶液，其包括上述碳点荧光团。
可选地，碳量子点溶液的浓度为31.25～500μg/mL，优选200μg/mL。
第五方面，本发明还提供了上述氮硫杂环化合物或上述碳点荧光团在细胞成像上的应用。
本发明技术方案具有以下有益效果：利用特定的分离手段从N-(N-L-γ- 谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸制备的CDs中成功分离2个新化合物(能发出蓝绿色的荧光团)。通过对比分离出荧光团的结构和两种CDs 反应过程的HPLC图谱，推测出CDs-GSH，为GSH与CA的反应，有利于对CDs形成过程和荧光机理进行研究，且分离得到的2个新化合物荧光性能优异，具有很好的生物相容性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的CDs-GSH和自CDs-GSH中分离出的B-BG-1、B-BG-2 的正相薄层层析图以及CDs-GSH和自CDs-GSH中分离出的B-BG-1、 B-BG-2的HPLC荧光谱图；
图2为实施例1的CDs-GSH与L02细胞孵育后于激光共聚焦显微镜下的细胞成像，其中，(d)、(e)和(f)分别为CDs-GSH与L02细胞孵育后于明场、λex/em＝408/515nm和λex/em＝488/590nm下拍摄图像；
图3为实施例1的CDs-GSH的细胞溶血实验折线图；
图4为实施例1的CDs-GSH荧光碳点紫外和荧光发射图；
图5为实施例1的B-BG-1荧光碳点紫外和荧光发射图；
图6为实施例1的B-BG-2荧光碳点紫外和荧光发射图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的一种氮硫杂环化合物及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明的一些实施方式提供了一种氮硫杂环化合物，其化学结构如式 (Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：
Figure GDA0003542654590000041
本发明的一些实施方式还提供了一种上述氮硫杂环化合物的制备方法，其包括：
将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸通过热解法制备碳点荧光团；
将碳点荧光团通过色谱分离，以得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物，如表1所示。
表1
Figure GDA0003542654590000051
发明人发现在CDs的合成过程中的生成的是多种化合物的混合物，CDs 的荧光来源于结合在CDs内外部能够直接发光的荧光团，但是在现有研究中很少从CDs中分离出单一荧光团。而本申请通过特定的合成方法和分离方法从直接制备的混合物CDs中分离出了绿颜色发光的荧光团，这些荧光团的出现是由于自身未参与CDs合成遗留下来或者长时间加热自CDs上脱落。通过分离得到的新的荧光化合物，能够有利于探究CDs合成过程和荧光机理，进而有利于CDs的可控合成。为疾病的诊断及其机理研究提供理论基础。
不同的反应原料、反应温度以及反应时间等都会导致生成的碳点荧光团的组分以及荧光效果等发生变化。一些实施方式中，热解法制备碳点荧光团包括：将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的混合水溶液在65～75℃的温度下进行干燥，再将干燥混合物在160～220℃的温度下热解。
具体地，将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸在水溶液中进行充分混合，以使得两者原料之间能够接触均匀，进而在热解反应过程中达到更佳的反应效果，其中，水可以选用超纯水，溶解过程可以通过超声溶解。同时，通过干燥除去水分后，能够有利于后期热解反应的顺利进行。干燥的温度可以是65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、 72℃、73℃或75℃等。热解的温度可以是180℃、185℃、190℃、195℃、 200℃、205℃或210℃等。
一些较佳的实施方式中，在65～75℃的温度下的干燥时间为10～14h，优选12h；在180～220℃的温度下热解的时间为0.5～2.5h，优选2.5h。
需要说明的是，在进行热解之前，可以将混合溶液干燥后得到固体通过醇溶解后，装入反应釜，再挥发干醇溶剂，其中，醇可以为甲醇。
进一步地，热解过程具体为在挥发完醇溶剂的反应釜中充入惰性气体，在热解温度下反应进行反应。惰性气体可选择氮气、氩气等，以避免空气中的氧气等对反应过程造成影响。
进一步地，为了获得特定的碳点荧光团成分，一些实施方式中，对原料比例进行一定的要求，即N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的摩尔比可为1～2：2～3，优选3～4：4～5，更优选4：5。
一些实施方式中，将碳点荧光团进行色谱分离包括：以正相硅胶柱为色谱柱，通过二氯甲烷和石油醚作为流动相对所述碳点荧光团进行洗脱，洗脱体积为4BV，其中，二氯甲烷和石油醚的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选1：1；再调整流动相为二氯甲烷和甲醇对所述碳点荧光团进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为90～110：1、25～35：1，对应的洗脱体积依次为10BV、5BV，以得到三种组分Fr.1～Fr.3；然后将Fr.2进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为400～550：1、90～110：1、25～35：1，得到组分Fr.2-1～Fr.2-3；对应的洗脱体积依次为4BV、4BV、5BV；将Fr.2-2 过制备型液相色谱分离，以10mm×250mm的C18半制备柱进行分离，选用甲醇-水洗脱，洗脱条件为0-60min，5～95％甲醇，流速3mL/min，吸收波长280nm，得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
本发明的一些实施方式还提供了一种碳点荧光团，其包括上述式(Ⅰ) 和式(Ⅱ)所示的化合物。
本发明的一些实施方式还提供了一种碳量子点溶液，其包括上述碳点荧光团。
一些实施方式中，碳量子点溶液的浓度为31.25～500μg/mL，优选200 μg/mL。
本发明的一些实施方式还提供了上述氮硫杂环化合物或上述碳点荧光团在细胞成像上的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的一种氮硫杂环化合物的制备方法具体包括：
105.1mg CA(含1个结晶水)与122.9mg GSH于2mL水中超声溶解(CA与GSH的摩尔比为CA:GSH＝5:4)，溶液转移至蒸发皿中并于70℃烘箱中反应12h。将产物在甲醇中溶解，并将甲醇溶解产物装至反应釜中。挥干甲醇并充入氮气密封后，于200℃烘箱反应2.5h，得到CDs-GSH。
将20.0g CDs-GSH制备样品干法拌样以正相硅胶柱色谱分离。通过二氯甲烷和石油醚作为流动相对所述碳点荧光团进行洗脱，洗脱体积为5BV，其中，二氯甲烷和石油醚的质量比为1：1；再调整流动相为二氯甲烷和甲醇对所述碳点荧光团进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为100： 1、30：1，对应的洗脱体积依次为10BV、5BV，以得到三种组分Fr.1～Fr.3；然后将Fr.2进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为500：1、100： 1、30：1，得到组分Fr.2-1～Fr.2-3；对应的洗脱体积依次为4BV、4BV、5 BV；将Fr.2-2过制备型液相色谱分离，以10mm×250mm的C18半制备柱进行分离，选用甲醇-水洗脱，洗脱条件为0-60min，5～95％甲醇，流速3 mL/min，吸收波长280nm，得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物即B-BG-1 (1.5mg)，B-BG-2(1.0mg)。
实施例2-3
本实施例2-3不同于实施例1之处仅在于，依次在200℃烘箱反应1.5h、 2h。
对比例1-3
本对比例和实施例不同之处仅在于，依次在200℃烘箱反应0h、0.5h、 1h。
实施例4
本实施例与实施例1不同之处仅在于，干燥温度72℃，反应温度205℃。
试验例1
对实施例1得到的CDs-GSH和分离出的B-BG-1和B-BG-2在同一正相薄层板(图1)并以二氯甲烷-甲醇(50:1)为展开剂进行洗脱。可以明显看到经TLC展开的蓝色发光色块和与之对应CDs-GSH上的荧光团色块具有一致性，而蓝绿色和绿色荧光色块由于微量存在于CDs-GSH中导致荧光色块不能被清晰看见。这一现象与CDs-GSH整体呈蓝色发光相一致。
所有样品均在相同液相条件下被操作。实验用到了BDS HYPERSIL-C18的色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-水(含0.3％的TFA)(B)。洗脱条件为0-40min,15％-55％A；柱温为25℃；流速为1.0mL/min；荧光检测波长被确定为365nm/440nm；进样量为10uL。荧光团B-BG-1能在CDs-GSH中找到相同保留时间下的峰，B-BG-2由于极微量存在于CDs-GSH中，故相同保留时间下的峰难以在CDs-GSH中被发现。
试验例2
对实施例1获得的化合物B-BG-1和B-BG-2进行分析，化合物B-BG-1 为蓝绿色无定型粉末，HRMS(ESI)显示[M+H]+[C10H10NO2S2]+calcd 240.0148,found 240.0147。结合氢碳谱确定其分子式：C10H9NO2S2。1H-NMR (600MHz,CDCL3-d):δ6.42(1H,s),4.77(1H,q,J＝7.2Hz),4.50(2H,m),3.48 (2H,t,J＝7.2Hz),1.78(3H,d,J＝7.2Hz)；13C-NMR(150MHz,CDCl3-d):δ 196.1(C-9),159.1(C-5),150.1(C-12),145.8(C-10),138.5(C-6).93.5(C-11), 50.7(C-3),44.9(C-7),29.4(C-2),19.8(C-13)。
结合以上数据信息，故推断化合物A-BG(B-BG-1)为 7-methyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]-7H-thieno[3,4-d]pyridine-5,9-dione。
化合物B-BG-2为淡蓝色无定型粉末，HR-MS(ESI)显示[M+H]+ [C11H12NO2S2]+calcd254.0304,found 254.0303。结合氢碳谱确定其分子式： C11H11NO2S2。1H-NMR(600MHz,CDCl3-d):δ6.42(1H,s),4.74(1H,d,J＝9.0 Hz),4.51(2H,m),3.48(2H,t,J＝7.2Hz),2.59,1.82(2H,m),1.00(3H,d,J＝7.2 Hz)；13C-NMR(150MHz,CDCl3-d):δ196.4(C-9),159.1(C-5),150.0(C-12), 146.2(C-10),137.3(C-6).93.6(C-11),52.5(C-3),50.7(C-7),29.3(C-2),26.3 (C-13)12.1(C-14)。结合以上数据信息，故推断化合物B-BG-2为 7-ethyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]-7H-thieno[3,4-d]pyridine-5,9-dione。
试验例3
设置CDs-GSH浓度为高浓度(500μg/mL)和不同细胞孵育初步判断毒性。实验分为4个实验组和4个空白组，每组平行操作5次，结果取平均值。具体分组见表3.1。100uL培养至对数生长的细胞转移至96孔板中，使每个孔细胞数量达0.8×104～1.6×105。置于二氧化碳培养箱中培养12h后吸掉上清液，实验组加入200μL 500μg/mL的供试液，空白组加入200μL仅含双抗的基础培养基，孵育24h。弃掉上清液，加入PBS润洗3次。已配置好的MTT母液用PBS稀释10倍后，加100μL于96孔板中，孵育4h，弃掉上清液，100uL DMSO加入96孔板中，轻微摇晃充分溶解蓝紫色甲瓒结晶，于492nm下测定吸光度。除了针对每种细胞用对应培养基外，两种 CDs对所有细胞的毒性实验均按上述操作进行。细胞存活率按以下公式计算。初筛结束后选择与空白组具有显著性差异的组别进一步设置5个浓度梯度，按上述相同操作测定吸光度，计算半抑制浓度(IC50)。
存活率(％)＝(实验组吸光度/正常组吸光度)×100％
表2实验分组与给药剂量(μL)
Figure GDA0003542654590000101
数据统计分析：所有计量资料均以均值±标准差
Figure GDA0003542654590000102
表示，采用 SPSS 17.0统计软件分析。组间差异显著性检验采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
实验结果如表3所示。
表3实验组细胞存活率比较(n＝3)
Figure GDA0003542654590000111
注：n＝3，空白组存活率为100％，“*”表示与空白组相比具有显著性差异(P＜0.05)
从表3可以看出，实验组与空白组均不具有显著性差异(P＞0.05)，表明CDs-GSH在500ug/mL对RAW264.7细胞、L02细胞和A549细胞无毒性。
试验例4
10mL D-PBS加入5mL兔血中，轻微涡旋混匀后于8000g离心力下离心5min，弃掉上清液，下层沉淀红细胞加入10mL D-PBS充分上述操作至离心后上清液基本澄清无血色。回收下层沉淀红细胞加入50mL D-PBS，稀释红细胞浓度至10％左右。CDs-GSH分别用D-PBS溶解配置一系列浓度药液(39.0625ug/mL，78.125μg/mL，156.25μg/mL，312.5μg/mL和 625μg/mL)。0.2mL 10％红细胞与0.8mL上述浓度梯度的药液混合，轻微涡旋后得最终浓度分别为31.25μg/mL，62.5μg/mL，125μg/mL，250μg/mL， 500ug/mL的CDs-GSH实验组。0.2mL 10％红细胞与0.8mL D-PBS混合得阴性组，0.2mL 10％红细胞与0.8mL与蒸馏水混合得阳性组。所有组均置于25℃恒温箱中孵育4h。孵育结束后轻微涡旋，于8000g离心力下离心 5min。小心移取100μL上清液至96孔板中，577nm下测定各组吸光度。溶血率按以下公式计算。
溶血率(％)＝[(实验组-阴性组)/(阳性组-阴性组)]×100％
体外溶血实验分为5个实验组，1个阴性组和1个阳性组，每组平行操作3次，结果取平均值。具体分组见表4。
表4实验分组与给药浓度(μg/mL)
Figure GDA0003542654590000121
结果如表5和图3所示。
表5.细胞溶血实验表
Figure GDA0003542654590000122
CDs-GSH所设5个浓度下，溶血情况完全一致，即下层有沉淀红细胞，上层清液接近溶液原来颜色，初步判定无溶血发生。进一步计算溶血率后，随着药物浓度的增加CDs-GSH溶血率在1％上下波动现象。因判定标准溶血率大于5％才能被判定为溶血，所以，在31.25～500ug/mL浓度范围内 CDs-GSH均无溶血现象。
试验例5
MEM完全培养基：FBS：双抗：用谷氨酸：中等非必需氨基酸溶液： 1％丙酮酸钠溶液：MEM培养液(体积比)＝10:1:1:1:1:86混合。用MEM 完全培养基培养L02细胞，取处于对数生长时期的细胞用于实验。转移一定量的细胞于2个共聚焦培养皿中，于二氧化碳恒温箱中培养12h，待细胞贴壁后弃掉上层原始培养液，分别加入一定量浓度为200μg/mL的 CDs-GSH供试液，于二氧化碳恒温箱中孵育3h，之后弃掉上层药液，PBS 反复清洗3次，于激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况，结果如图2所示。
通过图2可以发现，200μg/mL CDs-GSH与L02细胞孵育3h后，在λex/em＝408/515nm和λex/em＝488/590nm下能发出绿色荧光。其中，CDs-GSH 在蓝色荧光下成像更为清晰。这说明CDs-GSH可作为染色细胞的蓝色荧光试剂。
试验例6
制备的CDs-GSH碳点溶液在日光灯照射下，呈浅黄色透明状，水溶性好，在365nm的紫外灯照射下发出蓝绿色荧光。紫外-可见吸收光谱扫描显示，碳量子点在284nm波长处有一个强的吸收峰肩为CDs-GSH碳点sp2区域的π—π＊跃迁，352nm波长显示羰基的n—π＊跃迁。化合物B-BG-1和B-BG-2 羰基的n—π＊跃迁吸收波长分别是385nm和361nm。显示羰基特征吸收波长较CDs-GSH混合物碳点红移，B-BG-1和B-BG-2保存6个月后仍呈浅黄色透明状，未产生聚集现象，说明其具有较高的稳定性和发光强度。如图4-图6 所示。
B-BG-1和B-BG-2在不同激发波长下，随着激发波长的增大，比较 CDs-GSH混合物发射荧光发生红移，发射峰强度也逐渐减弱。产生这种现象的原因有可能是粒子尺寸对光的选择性存在差异，或是由于CDs表面的发射空穴不同引起的，利用这个性质可以有效控制荧光发射。
综上所述，CDs-GSH对RAW264.7细胞、L02细胞和A549细胞均无细胞毒性，但对HepG2细胞表现出一定细胞毒性。虽然CDs-GSH与Hep G2 细胞孵育的IC 50较高(1499±104(±SD))，但考虑到CDs-GSH是混合物，可以通过对CDs-GSH有效成分的分离进一步提高抗肝癌(抑制Hep G2细胞增值)活性，即分离得到的两种化合物也至少具有CDs-GSH的生物性能。体外溶血实验结果显示在31.25～500ug/mL浓度下的CDs-GSH无溶血效应。综合上述，CDs-GSH具有良好的生物相容性，同时CDs-GSH可作为抗肝癌药物进一步研究。
CDs-GSH在L02细胞成像上的应用，在浓度为200μg/mL CDs-GSH均能进入L02细胞中并发出绿色荧光。根据CDs进入L02细胞后在绿色发光强度上，可将CDs-GSH选做染色细胞的蓝色荧光试剂，进而也进一步说明两种新化合物业可以作为染色细胞的蓝色荧光试剂。该实验结果为L02细胞荧光染色剂的选材提供了更多选择。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种氮硫杂环化合物，其特征在于，其化学结构如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003556557920000011
2.一种如权利要求1所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，其包括：
将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸通过热解法制备碳点荧光混合物；
将所述碳点荧光混合物通过色谱分离，以得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，热解法制备碳点荧光混合物包括：将N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的混合水溶液在65～75℃的温度下进行干燥，再将干燥混合物在160～220℃的温度下热解。
4.根据权利要求3所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，在65～75℃的温度下的干燥时间为10～14h；在180～220℃的温度下热解的时间为0.5～2.5h。
5.根据权利要求4所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，在65～75℃的温度下的干燥时间为12h；在180～220℃的温度下热解的时间为2.5h。
6.根据权利要求3所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的摩尔比为1～2：2～3。
7.根据权利要求6所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的摩尔比为3～4：4～5。
8.根据权利要求7所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸与柠檬酸的摩尔比为4：5。
9.根据权利要求2～8任一项所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，将所述碳点荧光混合物进行色谱分离包括：以正相硅胶柱为色谱柱，通过二氯甲烷和石油醚作为流动相对所述碳点荧光混合物进行洗脱，洗脱体积为3～5BV，其中，二氯甲烷和石油醚的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2；再调整流动相为二氯甲烷和甲醇对所述碳点荧光混合物进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为90～110：1、25～35：1，对应的洗脱体积依次为9～11BV、4～6BV，以得到三种组分Fr.1～Fr.3；
然后将Fr.2进行梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的质量比依次为400～550：1、90～110：1、25～35：1，得到组分Fr.2-1～Fr.2-3；对应的洗脱体积依次为4BV、4BV、5BV；
将Fr.2-2过制备型液相色谱分离得到式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
10.根据权利要求9所述的氮硫杂环化合物的制备方法，其特征在于，二氯甲烷和石油醚的质量比为1：1。
11.一种碳点荧光混合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。
12.一种碳量子点溶液，其特征在于，其包括如权利要求11所述的碳点荧光混合物。
13.根据权利要求12所述的碳量子点溶液，其特征在于，所述碳量子点溶液的浓度为31.25～500μg/mL。
14.根据权利要求13所述的碳量子点溶液，其特征在于，所述碳量子点溶液的浓度为200μg/mL。
15.如权利要求1所述的氮硫杂环化合物或如权利要求11所述的碳点荧光混合物在制备细胞成像试剂上的应用。
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