CN113042121B - 用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用，所述芯片包括自芯片的一端依次设置的第一腔体部、液滴生成部和第二腔体部，所述第一腔体部用于外泌体的PCR反应混合液的形成；所述液滴生成部用于生成所述PCR反应混合液的液滴，所述第二腔体部用于所述液滴的储存及PCR反应分析；所述第一腔体部与所述液滴生成部的一端连通，所述液滴生成部的另一端与所述第二腔体部连通。本申请能够实现外泌体的PCR反应混合液的形成、液滴生成、液滴的储存与PCR反应分析等一系列过程，无需复杂的片外处理转移过程，避免了样品损失与污染，从而实现了外泌体核酸的稳定准确检测，具有高通量、高灵敏度、低背景噪声、便于制造、即用即弃等优点。

Description

用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用

技术领域

本申请涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用。

背景技术

外泌体作为一种“液体活检”标志物积极参与了肿瘤的发生、发展、转移等过程，而其中外泌体核酸在肿瘤的早期诊断、病程监控及个体化用药指导方面具有重要应用前景，然而由于外泌体中一些核酸含量极少，稳定且准确地检测血液中外泌体核酸的表达面临技术挑战。

发明内容

本申请的目的在于提供一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用，能够实现外泌体的片上分离与裂解、PCR反应混合液的形成、PCR反应混合液的液滴生成、液滴的储存与PCR反应分析等一系列过程，无需复杂的片外处理转移过程，避免了样品损失与污染，从而实现了外泌体核酸的稳定准确检测。

本申请是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本申请提供一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片，包括自芯片的一端依次设置的第一腔体部、液滴生成部和第二腔体部，所述第一腔体部用于外泌体的PCR反应混合液的形成；所述液滴生成部用于生成所述PCR反应混合液的液滴，所述第二腔体部用于所述液滴的储存及PCR反应分析；所述第一腔体部与所述液滴生成部的一端连通，所述液滴生成部的另一端与所述第二腔体部连通。

进一步地，所述第一腔体部包括第一腔体、第一腔体入口、第一腔体出口、第一微通道和第二微通道；所述第一腔体位于芯片宽度方向的中央区域，于芯片宽度方向所述第一微通道和所述第二微通道分别位于所述第一腔体的两侧；所述第一腔体入口通过所述第一微通道与所述第一腔体连通；所述第一腔体出口通过所述第二微通道与所述液滴生成部连通一腔体连通；所述第一腔体出口通过所述第二微通道与所述液滴生成部连通。

进一步地，所述第一腔体为通孔腔体，所述第一腔体的上侧设有第一封闭层，所述第一封闭层覆盖所述第一腔体部；所述第一腔体的下侧设有第二封闭层，所述第二封闭层覆盖芯片的下表面，所述第一封闭层与所述第二封闭层通过紧固件固定连接。

进一步地，所述液滴生成部包括水相进样口和水相通道，所述第二微通道通过微管与所述水相进样口连通；所述水相通道构造为呈迂回弯曲状；所述液滴生成部还包括油相进样口以及分别与所述油相进样口连通的第一油相通道和第二油相通道，所述第一油相通道和所述第二油相通道对称设于所述水相通道的两侧，所述第一油相通道、所述第二油相通道与所述水相通道交汇形成十字交叉的液滴生成口。

进一步地，所述液滴生成部还包括引流结构，所述引流结构设于所述液滴生成口处，所述引流结构用于将所述液滴导入所述第二腔体部。

进一步地，所述第二腔体部设有第二腔体入口和第二腔体，所述第二腔体入口用于流入自所述液滴生成口处生成的液滴；

所述第二腔体部包括对准重叠设置的第一玻璃片和第二玻璃片，于芯片的宽度方向在所述第一玻璃片与所述第二玻璃片之间对称设有固化胶，所述固化胶、所述第一玻璃片与所述第二玻璃片之间围成的空隙形成所述第二腔体。

进一步地，所述第二腔体构造为使所述液滴在所述第二腔体内部单层分布。

进一步地，所述液滴生成部与所述第二腔体部之间设有预留空隙形成排气通道。

第二方面，本申请提供一种上述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的应用。

第三方面，本申请提供一种基于上述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的外泌体核酸检测方法，包括：

提供待检样品，将所述待检样品通入第一腔体部形成外泌体的PCR反应混合液；

将所述PCR反应混合液导入液滴生成部，并在液滴生成部生成液滴；

所述液滴流入第二腔体部，并将芯片转移至平板PCR仪上进行PCR反应；

将芯片转移至荧光显微镜下进行结果分析。

实施本申请，具有如下有益效果：

1、本申请的一体化芯片包括第一腔体部、液滴生成部和第二腔体部，能够实现外泌体的PCR反应混合液的形成、PCR反应混合液的液滴生成、液滴的储存与PCR反应分析等一系列过程，无需复杂的片外处理转移过程，避免了样品损失与污染，从而实现了外泌体核酸的稳定准确检测。

2、本申请的一体化芯片具有外泌体富集、裂解、RNA释放和液滴数字PCR等多功能，能够实现整合的片上外泌体分离裂解与核酸的绝对定量检测，本申请的芯片具有高通量、高灵敏度、低背景噪声、便于制造、即用即弃等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本申请实施例提供的用于外泌体核酸检测的一体化芯片（未包含第一封闭层与第二封闭层）的俯视示意图；

图2为本申请实施例提供的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的俯视示意图；

图3为本申请实施例提供的第一封闭层的结构示意图；

图4为本申请实施例提供的第二封闭层的结构示意图；

图5为本申请实施例中液滴生成的显微镜表征示意图；

图6为本申请实施例中排气通道的原理示意图；

图7为本申请实施例中排气通道区域的显微镜表征示意图；

图8为本申请实施例中液滴流入第二腔体部的显微镜表征示意图；

图9为本申请实施例中液滴在第二腔体内排布的显微镜表征示意图；

图10为PCR反应后的荧光显微镜表征示意图；

附图标记对应为：1-第一腔体部、11-第一腔体、12-第一腔体入口、13-第一腔体出口、14-第一微通道、15-第二微通道、16-微管、2-液滴生成部、21-水相进样口、22-水相通道、23-油相进样口、24-第一油相通道、25-第二油相通道、26-引流结构、27-排气通道、3-第二腔体部、31-第二腔体、32-固化胶、4-第一封闭层、5-第二封闭层。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本申请作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

实施例

为了稳定且准确地检测血液中外泌体核酸，本申请实施例提供一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片，参阅图1-4，本实施例中的一体化芯片包括自芯片的一端依次设置的第一腔体部1、液滴生成部2和第二腔体部3，第一腔体部1用于外泌体的PCR反应混合液的形成，本实施例中PCR为聚合酶链式反应，本实施例中的PCR反应混合液即能够利用反转录微滴式数字聚合酶链式反应方法（reverse transcriptase droplet digital polymerasechain reaction，简称RT-ddPCR）进行外泌体核酸的绝对定量检测的反应混合液，也即RT-ddPCR反应混合液；液滴生成部2用于生成PCR反应混合液的液滴，第二腔体部3用于液滴的储存及PCR反应分析；第一腔体部1与液滴生成部2的一端连通，液滴生成部2的另一端与第二腔体部3连通。

本申请能够实现外泌体的PCR反应混合液的形成、PCR反应混合液的液滴生成、液滴的储存与PCR反应分析等一系列过程，无需复杂的片外处理转移过程，避免了样品损失与污染，从而实现了外泌体核酸的稳定准确检测，在外泌体中一些核酸含量极少的情况下，也能够稳定且准确地进行血液中外泌体核酸的检测。另外，本申请的一体化芯片具有外泌体富集、裂解、RNA释放和液滴数字PCR等多功能，能够利用RT-ddPCR方法实现整合的片上外泌体分离裂解与核酸的绝对定量检测，本申请的芯片具有高通量、高灵敏度、低背景噪声、便于制造、即用即弃等优点。

在一个具体的实施方式中，第一腔体部1包括第一腔体11、第一腔体入口12、第一腔体出口13、第一微通道14和第二微通道15；第一腔体11位于芯片宽度方向的中央区域，于芯片宽度方向第一微通道14和第二微通道15分别位于第一腔体11的两侧；第一腔体入口12通过第一微通道14与第一腔体11连通；第一腔体出口13通过第二微通道15与液滴生成部2连通。本实施例中的第一微通道与第二微通道具有液体引流与气路泵送的作用，在液滴生成过程中，气路可以与第二微通道相连，推动PCR反应混合液从第一腔体部流入到液滴生成部中。

为了实现通孔腔体的封闭，第一腔体11为通孔腔体，第一腔体11的上侧设有第一封闭层4，第一封闭层4覆盖第一腔体部；第一腔体11的下侧设有第二封闭层5，第二封闭层5覆盖芯片的下表面，第一封闭层4与第二封闭层5的结构示意图如图3和图4所示。第一封闭层4与第二封闭层5通过紧固件固定连接，具体地，紧固件可以采用螺丝螺母组，第一封闭层4与第二封闭层5经螺丝螺母组固定，将芯片的第一腔体封闭，形成整体包装结构。

具体地，第一封闭层4与第二封闭层5的材质为聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，简称PMMA），利用PMMA封闭层对芯片进行包装，以稳定进样时的芯片气压。由于第一腔体11具有较大的尺寸，压力从第一腔体入口13导入时容易隆起，利用PMMA封闭层封闭腔体后可稳定压力，顺利从第一腔体入口经由第一腔体导入到液滴生成部的水相进样口。

在一个具体的实施方式中，第一腔体11的直径可以为1-15mm，高度可以为2-5cm，其反应体积可达100-200μl。在现有的聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔体结构中，通常采用硅工艺刻蚀技术，由于工艺限制往往高度仅为数微米级，反应容积常低于5μl。而在本实施例中的第一腔体11可以实现更大体积的液体反应，从而极大地增加了反应量，能够与核酸检测所需的大反应体系相适应，并获得更大的线性范围。

在一个具体的实施方式中，PCR反应混合液的形成过程具体可以包括：10-30μl分离磁珠被预通于第一腔体中，随后通入50-200μl待检外泌体样品，以在该第一腔体中充分进行片上外泌体的分离反应。分离反应过程中对第一腔体进行封闭，形成密闭的反应体系，从而避免由于与外界接触导致的样本损失与污染。之后，加入裂解液以释放外泌体中核酸。接着，通入PCR反应液形成PCR反应混合液。

在一个具体的实施方式中，液滴生成部2包括水相进样口21和水相通道22，第二微通道15通过微管16与水相进样口21连通，具体地，微管16可以为硬质微管；水相通道22构造为呈迂回弯曲状，本领域技术人员还可以根据流阻需要设计水相通道为圆环状；液滴生成部2还包括油相进样口23以及分别与油相进样口23连通的第一油相通道24和第二油相通道25，第一油相通道24和第二油相通道25对称设于水相通道22的两侧，第一油相通道24、第二油相通道25与水相通道22交汇形成十字交叉的液滴生成口，在其他的实施方式中，本领域技术人员还可以根据实际需要减少一路油相通道，将液滴生成口设计为T字形。该液滴生成结构采用流动聚焦法进行液滴生成，将第一腔体部1中的PCR反应混合液由微管16导入水相进样口21，同时，油相进样口23填充预先配制的矿物油，不互溶的油、液两相在十字交叉口处相遇，在气压作用下，液相破裂并被油相均匀包裹分隔，因此油包液的液滴被稳定生成，本实施例中，在液滴生成部生成液滴的示意图如图5所示。

具体地，在常规RT-ddPCR反应体积约20-50μl，液滴的直径设定为15-100μm的情况下，液滴生成口的尺寸可以设置为20-100μm，以较稳定地生成液滴。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据具体情况和实际需要设置液滴生成口的尺寸，以保证液滴生成的稳定、均一和可持续。

还需说明的是，在液滴生成的过程中，可以通过调节液油两相比例为1:0.5-1:3，以生成预设尺寸的液滴，预设尺寸即为在芯片设计时预期获得的液滴尺寸。

进一步地，液滴生成部2还包括引流结构26，引流结构26设于液滴生成口靠近第二腔体部3的一侧，引流结构26用于将液滴导入第二腔体部3，液滴高速生成后该引流结构26能够保持液滴形态，提高液滴稳定性，避免由于碰撞导致的液滴破损与融合现象。

在一个具体的实施方式中，引流结构26可以为迂回汇合结构，能够保证生成的液滴完整流入第二腔体部，减少了液滴被切割现象。

在一个可选的实施方式中，引流结构26还可以为圆柱阵列腔体结构，这种引流结构能够保证生成的液滴完整流入第二腔体部，减少了液滴被切割现象，而且，圆柱阵列腔体结构具有更大的面积利用率，有利于减小芯片设计尺寸。

在一个具体的实施方式中，第二腔体部3设有第二腔体入口和第二腔体31，第二腔体入口用于流入自液滴生成口处生成的液滴；第二腔体部3包括对准重叠设置的第一玻璃片和第二玻璃片，于芯片的宽度方向在第一玻璃片与第二玻璃片之间对称设有固化胶32，具体地，固化胶32可以设于芯片宽度方向的两端，以获得均一稳定的腔体高度，固化胶32、第一玻璃片与第二玻璃片之间围成的空隙形成第二腔体31。

本实施例中，第二腔体表面为透明的玻璃材质，一方面，玻璃材质具有强度高、热稳定性强、不会吸油、抑制蒸发等优势，在RT-ddPC反应过程中，保存在玻璃腔室中的液滴具有更高的稳定性，能够减少破裂、融合现象，且在热循环反应前后均可保持均一、稳定形态；另一方面，玻璃材质的透光性好，不影响荧光信号的采集，也不干扰阳性信号以及阴性信号的区分；同时，玻璃腔制作简便，使用常规的玻璃片进行划片即可使用，且均一性较好、成本低。

具体地，第二腔体31构造为使液滴在第二腔体31内部单层分布，液滴在第二腔体31内部均一紧密排布的液滴层，避免了因液滴的破碎、多层堆积以及密度低下等问题带来的观测统计困难。

具体地，在RT-ddPCR反应体积约20-50μl，液滴的直径15-100μm的情况下，可以设置第二腔体的底部面积6-16cm2，第二腔体的腔体高度15-100μm。另外，需要说明的是，在实际检测过程中，由于不可控因素，如储气装置以及气相控制设备的不稳定性等，会导致气体波动，进而影响液、油相的压力，进而导致液滴生成的不稳定性。为此，基于流量、压强以及流阻的关系P=R*Q，其中，P代表芯片进样口所给予的压强，R代表流阻，Q代表流量，在液滴生成中，液油两相的体积比即等于流量比，在偶然偏差导致的气压波动的情况下，可以适当地同步增大各相流阻，流量的突变会变小，即可降低系统的不稳定性带来的影响。

液滴生成中常会出现气泡现象，由于气泡比热容小，会在热循环过程中反复增大与缩小，严重影响液滴形态的维持，因此排除气泡尤为重要。在一个具体的实施方式中，如图6所示，图中a表示液滴，b表示气泡，液滴生成部2与第二腔体部3之间设有预留空隙形成排气通道27，该排气通道可以利用密度差原理将液滴溶液中的气泡排除，避免气泡进入第二腔体31。

由以上技术方案，在该芯片的第一腔体部中，待检样品中所含外泌体被高效特异分离后再进行原位裂解以释放核酸，随后与PCR反应液混合形成PCR反应混合液。图7-8示出了液滴由液滴生成部经排气通道流入第二腔体部，可以看出，在液滴生成部中，PCR反应混合液通过液滴生成结构被分隔为大量均匀液滴组分，液滴能够均一、稳定、可持续生成，且生成后的液滴不受反应过程影响，依旧能够保持原有形态。如图9所示，在第二腔体部中，液滴平铺于反应分析区域中，且保持原有形态。将芯片置于平板PCR仪上运行RT-ddPCR热循环程序，反应结束后，在第二腔体部区域进行荧光观察与数据统计，从而实现原样品中外泌体稀有靶标的绝对定量和精确分析。

本申请的另一实施例提供一种上述实施例中的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的应用。由于一体化芯片具有外泌体富集、裂解、RNA释放和液滴数字PCR等多功能，从而能够应用于整合的片上外泌体分离裂解与核酸的绝对定量检测，实现外泌体核酸的稳定准确检测。

本申请的另一实施例还提供一种基于上述实施例中的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的外泌体核酸检测方法，该方法包括：

提供待检样品，将待检样品通入第一腔体部形成外泌体的PCR反应混合液；

将PCR反应混合液导入液滴生成部，并在液滴生成部生成液滴；

液滴流入第二腔体部，并将芯片转移至平板PCR仪上进行PCR反应；

将芯片转移至荧光显微镜下进行结果分析。

在一个具体的实施方式中，外泌体核酸检测方法的具体步骤如下：首先，在第一腔体部预通入10μl标记有外泌体分离蛋白CD9的磁珠，之后，加入细胞系上清样品100μl，混合均匀后，封闭并置于25℃恒温空气浴中混合孵育30分钟，在该反应中，保证外泌体表面CD9受体与磁珠表面的对应抗体充分结合，目的为使更多外泌体被捕获到磁珠表面。孵育结束后，使用磁极将磁珠富集于芯片底部并排出样品反应液。然后，加入裂解液，以破坏外泌体双层膜结构，释放出其内容物核酸。随后，再加入预配制的PCR反应体系与之混合形成PCR反应混合液，也即RT-ddPCR反应混合液。接着，在液滴生成部，将PCR反应混合液经微管由第一腔体导出接入水相进样口，之后于油相进样口添加油相并与气路连接，再通过第一腔体入口接入另一气路，两气路均施加稳定气压以生成液滴，两相压力参数均设定为200 mbar。生成后液滴经过引流结构导入第二腔体部，在显微镜下观察发现，液滴稳定、均一。最后，将芯片转移到平板PCR仪上进行RT-ddPCR反应。反应结束后，转移至荧光显微镜下进行结果的观察和分析，统计阴、阳性液滴总数后计算原始拷贝数。如图10所示的实验结果显示，在该芯片上，能够成功检测细胞系来源的外泌体GAPDH的表达情况，表明集成外泌体富集、裂解、RNA释放以及液滴数字PCR为一体化的本微流控芯片能够实现外泌体核酸的绝对定量检测。

本申请的上述实施例，具有如下有益效果：

1、本申请的一体化芯片包括第一腔体部、液滴生成部和第二腔体部，能够实现外泌体的PCR反应混合液的形成、PCR反应混合液的液滴生成、液滴的储存与PCR反应分析等一系列过程，无需复杂的片外处理转移过程，避免了样品损失与污染，从而实现了外泌体核酸的稳定准确检测。

2、本申请的一体化芯片具有外泌体富集、裂解、RNA释放和液滴数字PCR等多功能，能够实现整合的片上外泌体分离裂解与核酸的绝对定量检测，本申请的芯片具有高通量、高灵敏度、低背景噪声、便于制造、即用即弃等优点。

以上所述是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于外泌体核酸检测的一体化芯片，其特征在于，包括自芯片的一端依次设置的第一腔体部（1）、液滴生成部（2）和第二腔体部（3），所述第一腔体部（1）用于外泌体的PCR反应混合液的形成；所述液滴生成部（2）用于生成所述PCR反应混合液的液滴，所述第二腔体部（3）用于所述液滴的储存及PCR反应分析；

所述第一腔体部（1）与所述液滴生成部（2）的一端连通，所述液滴生成部（2）的另一端与所述第二腔体部（3）连通；

所述第一腔体部（1）包括第一腔体（11）、第一腔体入口（12）、第一腔体出口（13）、第一微通道（14）和第二微通道（15）；

所述第一腔体（11）位于芯片宽度方向的中央区域，于芯片宽度方向所述第一微通道（14）和所述第二微通道（15）分别位于所述第一腔体（11）的两侧；

所述第一腔体入口（12）通过所述第一微通道（14）与所述第一腔体（11）连通；所述第一腔体出口（13）通过所述第二微通道（15）与所述液滴生成部（2）连通；

所述液滴生成部（2）包括水相进样口（21）和水相通道（22），所述第二微通道（15）通过微管（16）与所述水相进样口（21）连通；所述水相通道（22）构造为呈迂回弯曲状；

所述液滴生成部（2）还包括油相进样口（23）以及分别与所述油相进样口（23）连通的第一油相通道（24）和第二油相通道（25），所述第一油相通道（24）和所述第二油相通道（25）对称设于所述水相通道（22）的两侧，所述第一油相通道（24）、所述第二油相通道（25）与所述水相通道（22）交汇形成十字交叉的液滴生成口；

所述液滴生成部（2）还包括引流结构（26），所述引流结构（26）设于所述液滴生成口处，所述引流结构（26）用于将所述液滴导入所述第二腔体部（3）。

2.根据权利要求1所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片，其特征在于，所述第一腔体（11）为通孔腔体，所述第一腔体（11）的上侧设有第一封闭层（4），所述第一封闭层（4）覆盖所述第一腔体部；所述第一腔体（11）的下侧设有第二封闭层（5），所述第二封闭层（5）覆盖芯片的下表面，所述第一封闭层（4）与所述第二封闭层（5）通过紧固件固定连接。

3.根据权利要求1所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片，其特征在于，所述第二腔体部（3）设有第二腔体入口和第二腔体（31），所述第二腔体入口用于流入自所述液滴生成口处生成的液滴；

所述第二腔体部（3）包括对准重叠设置的第一玻璃片和第二玻璃片，于芯片的宽度方向在所述第一玻璃片与所述第二玻璃片之间对称设有固化胶（32），所述固化胶（32）、所述第一玻璃片与所述第二玻璃片之间围成的空隙形成所述第二腔体（31）。

4.根据权利要求3所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片，其特征在于，所述第二腔体（31）构造为使所述液滴在所述第二腔体（31）内部单层分布。

5.根据权利要求1所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片，其特征在于，所述液滴生成部（2）与所述第二腔体部（3）之间设有预留空隙形成排气通道（27）。

6.一种权利要求1-5任一项所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片在外泌体核酸检测中的应用。

7.一种基于权利要求1-5任一项所述的用于外泌体核酸检测的一体化芯片的外泌体核酸检测方法，其特征在于，包括：

提供待检样品，将所述待检样品通入第一腔体部形成外泌体的PCR反应混合液；

将所述PCR反应混合液导入液滴生成部，并在液滴生成部生成液滴；

所述液滴流入第二腔体部，并将芯片转移至平板PCR仪上进行PCR反应；

将芯片转移至荧光显微镜下进行结果分析。

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