CN109536380B - 一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法，其区分为正面和反面，包括，样品进样腔和油相进样腔；微流通道，样品自所述样品进样腔通过微流通道与自所述油相进样腔和微流通道汇流，制备液滴，并流至第一容置空间；第二容置空间，液滴自所述第一容置空间通过所述平铺腔进口流至所述第二容置空间内。本发明进行功能区分隔，在独立的区域内分别完成数字PCR的三环节，液滴制备，PCR扩增及平铺统计计数，在液滴的制备及扩增环节，微液滴处于自由状态，微液滴稳定性高，有效地保障了液滴的稳定性，数字PCR芯片使用过程中无开盖步骤，无交叉污染的风险，提高了数字PCR实施的成功率及时效性。
Description
技术领域
本发明涉及生物反应的检测或分析等中使用的试样分析试管技术领域，特别是，涉及一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法。
背景技术
核酸是生命的最基本物质之一，任何疾病都能在核酸水平上找到证据。目前，核酸检测已被广泛应用于疾病研究、体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
当前核酸分子的定量检测有三种方法：光度法、实时荧光定量PCR以及数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术。数字PCR技术是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种核酸分子扩增及绝对定量的技术。该技术将稀释后的核酸溶液分散至大量的微反应器中，每个微反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR热循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会呈现荧光信号，没有模板的反应器就无荧光信号。在结果读出过程中，根据微反应腔荧光信号的相对比例，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
基于液滴微流控技术的液滴数字PCR，由于具备：更容易提供小体积、高通量的微反应器等优点，受到广泛地关注。液滴数字PCR反应分为三个环节：液滴制备、扩增及液滴计数统计。目前，具有代表性的液滴数字PCR系统有3款，分别是Bio-Rad公司的QX-100TM/QX-200TM、Raindance公司的Rain Drop TM以及Stilla technologies公司的Naica TM系统。
一体化芯片的技术路线，目前存在的问题主要是由于功能区域重合而造成的。目前无论是商品化的产品还是文献中报道的用于数字PCR的微流控芯片，其设计均将液滴收集、扩增反应和结果读出集中在同一区域，为了保证最终读数的准确性，现存方案均在液滴制备后就将制备的微液滴在扩增腔中平铺成一层，因为液滴计数是采用显微成像的方法，用数码相机对所有液滴进行拍照。只有液滴均匀的平铺成一层，才能够利用拍摄清楚的图像对最终的液滴数量进行精准计数。现有技术中，液滴扩增及扩增后液滴技术均在扩增腔中完成，这样就造成了种种限制：(a)油相(连续相)的选择提出了限制。因为需要保证在扩增过程及扩增之后，扩增腔中的微液滴均需维持平铺成一层的效果。但是，微液滴平铺成一层属于“亚稳态”。在这种状态下，微液滴的稳定性降低。同时，实现此状态对液滴的制备过程，需要选择特殊的油相加以克服，以提高微液滴的稳定性。(b)微液滴数目有限。芯片内液滴的数目越多，最终数字PCR的定量结果就越准确，而由于液滴扩增及结果统计均在扩增腔中完成。为了便于结果统计，微液滴需平铺成一层。这就对扩增腔内能容纳微液滴的数量提出了限制。(c)芯片制作材料的限制。目前为了保障(平铺成一层)微液滴稳定地进行PCR扩增反应，人们往往需要使用稳定性高的材料(如：玻璃)。然而，这种限制将会增加工艺的选择性及难度，导致加工成本增加。(d)在数字PCR扩增过程中，微液滴平铺成一层的状态很难维持。扩增过程涉及到温度循环(温度在4～96摄氏度范围内变化)，温度的变化将会诱导流动及气泡的产生，扰乱液滴平铺的状态，导致数字PCR检测的失败。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是提供一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其区分为正面和反面，包括，进样口，包括样品进样腔和油相进样腔，两者均自所述正面向所述反面的方向凹陷，凹陷至所述微流通道的层面；微流通道，自所述样品进样腔和油相进样腔的底部向上凹陷形成流道，样品自所述样品进样腔通过微流通道与自所述油相进样腔和微流通道汇流，制备液滴，并流至第一容置空间；第一容置空间，包括液滴出口和平铺腔进口，所述液滴出口和平铺腔进口自所述反面向所述正面方向凹陷，凹陷至与所述微流通道汇通，所述液滴通过所述液滴出口自所述微流通道流至所述第一容置空间；第二容置空间，液滴自所述第一容置空间通过所述平铺腔进口流至所述第二容置空间内。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：所述第二容置空间包括出口，所述出口与所述第二容置空间相连通，其中，所述出口自所述正面向所述反面方向凹陷，凹陷至与所述第二容置空间相连通。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：还包括，控制通道，其包括控制道进口、控制流道和控制道出口，所述控制流道的一端与所述控制道进口相联通，另一端与所述控制道出口相连通；其中，所述控制道进口自所述正面向所述反面的方向凹陷，凹陷至与所述控制流道相连通；其中，所述控制道出口自所述反面向所述正面的方向凹陷，凹陷至与所述控制流道相连通。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：所述第一容置空间还包括毛细管，所述毛细管与所述平铺腔进口相连接，伸入到所述第一容置空间的底部。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：所述第二容置空间内设有隔板，所述隔板垂直连接所述第二容置空间的上下面，且均匀的设于所述第二容置空间内。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：所述控制道进口通入与油相不相溶的相。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：所述控制道进口注入100微升的氟碳油。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的一种优选方案，其中：第二容置空间的深度在0.5d到2d的范围内，其中，d代表微液滴的直径。
本发明其中一个目的是提供一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法。
一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法，样品自所述样品进样腔流入，油相自所述的油相进样腔流入，样品和油相在微流通道内汇流形成液滴；所述液滴沿着所述微流通道流至第一容置空间内，气泡及所述第一容置空间内的空气会通过所述出口释放；其中，所述液滴制备完成进入到所述第一容置空间内，对所述第一容置空间进行加热，完成PCR扩增反应；其中，控制道进口施压后，所述液滴通过所述毛细管进入到所述第二容置空间内。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法的一种优选方案，其中：在所述毛细管及第二容置空间的毛细力做用下，微液滴悬浮液平铺于所述第二容置空间内。
作为本发明所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法的一种优选方案，其中：
本发明的有益效果：本发明进行功能区分隔，在独立的区域内分别完成数字PCR的三环节：液滴制备，PCR扩增及平铺统计计数，在液滴的制备及扩增环节，微液滴处于自由状态，微液滴自由地悬浮在油相中，油相充分地包裹微液滴，微液滴稳定性高，有效地保障了液滴的稳定性，减少了数字PCR芯片的种种限制，并增加了微液滴数目的潜能，扩展了芯片材料及工艺的可选择性。同时，数字PCR芯片上集成了数字PCR的三个环节，数字PCR芯片使用过程中无开盖步骤，无交叉污染的风险，这些措施都将提高了数字PCR实施的成功率及时效性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的一个角度的整体结构示意图；
图2为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的另一个角度的整体结构示意图；
图3为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的内部流路示意图；
图4为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的局部结构放大示意图；
图5a为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的第二容置空间内平铺后的明场图；
图5b为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例的第二容置空间内平铺后的荧光图像；
图6a为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片中第二容置空间不采用平铺后的明场图；
图6b为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片中第二容置空间不采用平铺后的荧光图像；
图7为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例采用隔板后的效果示意图；
图8a为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例液滴少时的分布图；
图8b为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的一种实施例液滴致密时的分布图；
图9为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第一种实施例中所述第一容置空间的液滴流向过程图；
图10为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第二种实施例中所述第一容置空间的液滴流向过程图；
图11为本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第三种实施例中所述第一容置空间的液滴流向过程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
参照图1～图8b，本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第一个实施例，该实施例中的液滴微流控芯片区分为正面M和反面N，主体包括进样口100、微流通道200、第一容置空间300和第二容置空间400，样品和油相通过进样口100进入到液滴微流控芯片内，并通过微流通道200依次流入到第一容置空间300和第二容置空间400中，完成核酸高灵敏检测。其中，在第一容置空间300中进行扩增，扩增后在外部作用下，使得微液滴进入第二容置空间400，液滴在第二容置空间400中，微液滴平铺成一层。最后通过对第二容置空间400中的微液滴进行拍照，统计，完成结果读出。
具体的，参照图1～4，进样口100，包括样品进样腔101和油相进样腔102，两者均自正面M向反面N的方向凹陷，且凹陷的深度相同，均不穿透微流控芯片的反面N。
需要说明的是，在本实施例中，样品进样腔101和油相进样腔102不穿透液滴微流控芯片的正面M和反面N的原因是：保证样品或者油相可以有保存密封的空间，如果穿透正面M和反面N的话，那样样品或者油相容易造成外泄，造成环境的污染，因为如果在驻留处(反面N)密封是一大问题，很容易造成液体的泄露，如果设置成开盖类型，容易产生交叉污染的风险，采用本申请的实施方式可以提高芯片在做数字PCR时的成功率和时效性。这里的时效性为检测周期，时效性也是通过液滴在第二容置空间400平铺成一层才有的技术效果。
需要说明的是，油相采用的是矿物油以及表面活性剂EM90、Triton X-100、Span80等，本实施例中的油相和表面活性剂的选择仅是说明性的，可使用其他类型的油相及表面活性剂。
数字PCR技术的提出主要是为了实现，在复杂背景或干扰情况下，痕量核酸检测的目的。例如，在癌症的早期诊断中，病人血液中的循环肿瘤DNA(目标核酸)含量极少，且与大量野生DNA共存(约数十万个野生型中一个突变型)。
数字PCR技术将待检测的DNA模板(即核酸样品)分散到成千上万个纳升或皮升级微单元中，每个微单元中的模板数不多于一个，因而避免了抑制现象，然后在每个微单元中进行PCR扩增反应，最终通过统计有无荧光信号(甚至不同荧光信号)的微单元数量及比值，得出微量突变体的数量。
较佳的，样品进样腔101和油相进样腔102均自正面M向反面N的方向凹陷整个液滴微流控芯片厚度的三分之二的深度。
微流通道200，自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向上凹陷形成流道，样品自样品进样腔101通过微流通道200与自油相进样腔102和微流通道200汇流，制备液滴，并流至第一容置空间300。
需要说明的是，这里的微流通道200自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向上凹陷是为了避免样品进样腔101和油相进样腔102内有残留液体，因此，微流通道200的最底部应该不高于样品进样腔101或油相进样腔102的最低处。
较佳的，在本实施例中，参照图4，油相进样腔102设于所述样品进样腔101的正上方，所述油相进样腔102分左支路102a和右支路102b往下流。
例如，需要样品和油相两者能够在相同时间达到汇聚点，那么，自样品进样腔101流出的流通支路101a是曲折的，通过计算，确保样品通过流通支路101a曲折路程到达汇聚点所耗费的时间等于油相通过左支路102a或右支路102b到达汇聚点的时间。
需要说明的是，在本申请中，将101a设计成弯拐，目的是控制水相的流阻，调节生成液滴时的水相油相流量比。
应当说明的是，流通支路101a的宽度小于左支路102a或右支路102b。
应当说明的是，汇聚点形成液滴的流道连通左支路102a、右支路102b、流通支路101a和微流通道200，且其流通的宽度和流通支路101a的宽度相等。
第一容置空间300，包括液滴出口301和平铺腔进口302，因为第一容置空间300设于液滴微流控芯片的反面N，所以液滴出口301设于反面N，并且自反面N向正面M方向凹陷，凹陷至与微流通道200汇通，液滴通过液滴出口301自微流通道200流至第一容置空间300，在第一容置空间300完成扩增。
当液滴制备环节停止后，对扩增腔进行热循环，这里的热循环只需要对扩增腔进行局部加热即可，但是，对整个芯片加热也同样可以实现液滴中核酸扩增之目的。
需要说明的是，在液滴的制备及扩增环节，微液滴处于自由状态(微液滴自由地悬浮在油相中，油相充分地包裹微液滴，微液滴稳定性高)。这样就有效地保障了液滴的稳定性，减少了现有技术中的数字PCR芯片种种限制(如液滴数目有限，芯片材料，加工工艺等方面的限制)，并增加了微液滴数目的潜能，扩展了芯片材料及工艺的可选择性。
参照图9，完成PCR扩增反应后，将芯片翻转，随后，微液滴悬浮液在重力的作用下下沉，微液滴悬浮液将会进入到第二容置空间400内。
第二容置空间400，液滴自第一容置空间300通过平铺腔进口302流至第二容置空间400内。需要注意的是，第二容置空间400设于液滴微流控芯片的内部，较佳的，第二容置空间400的最低端不高于微流通道200的最低端。而第一容置空间300设于液滴微流控芯片的反面N，所以平铺腔进口302自反面N向正面M方向凹陷，凹陷至与微流通道200汇通。
需要说明的是，第二容置空间400的深度与制备的微液滴的直径相当，用于实现微液滴单层平铺。例如，第二容置空间400的凹陷的深度为50微米，制备微液滴的直径为30～60微米之间。当液滴比较少，即液滴的数量比较少时，不会出现液滴不能平铺的效果，顶多就是液滴比较稀疏而已，见下图8a和图8b举例。若液体比较多，即液滴比较多，过多的液滴会从出口溢出。因此，液滴平铺腔的深度在0.5d到2d的范围内，d代表微液滴的直径。第二容置空间400的体积一般能容纳2万个以上微液滴，优选地容纳5万个以上微液滴。
较佳的，第二容置空间400包括出口401，出口401与第二容置空间400相连通，出口401自正面M向反面N方向凹陷，凹陷至与第二容置空间400相连通。在微液滴悬浮液流入到第一容置空间300内的过程中，气泡以及第一容置空间300内的空气将会通过出口401释放。
在本实施例中，在独立的区域内分别完成数字PCR的三环节：液滴制备，扩增及统计计数。各个功能区的独立，能够避免不同流程的相互干扰，仅在液滴计数统计环节(液滴计数统计环节是在第二容置空间400中完成)中实现液滴平铺成一层的效果，平铺一层有益于提高结果读出过程的效率。
采用第二容置空间400将液滴平铺一层的明场图参照图5a，荧光图5b参照图，液滴平铺成一层在“液滴计数统计环节”中通过拍照，识别就能统计出其中有荧光液滴的数目，以及所有液滴的数目，通过这两个参数就能推算出核酸样品中目标核酸的数目。
而如果第二容置空间400不采用本实施例中的平铺的明场图参照图6a，荧光图参照图6b，这样拍照时多层液滴的之间存在相互干扰，所以很难有效地统计有荧光液滴的数目，以及所有液滴的数目，故难以实现数字PCR之目的。
需要说明的是，在本实例中，采用软光刻工艺在聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作相应的微结构(需要注意的是，软光刻工艺及PDMS仅是说明性的，可使用其他材料及工艺)，并通过打孔、键合等工艺，形成样品进样腔101、油相进样腔102、微流通道200、第二容置空间400、流通支路101a、左支路102a、右支路102b以及汇聚点。
较佳的，第一容置空间300采用200微升的PCR管。
需要注意的是，此处选择200微升的PCR管仅是说明性的，可使用其他体积的PCR管。还应该理解的是，此处PCR管是充当扩增腔的作用，其他通过注塑或微加工工艺集成在芯片上的可用于扩增的微腔也在本发明的范围内。
需要说明的是，这个实例中讲述的微流控通道是同层凹陷，但是本发明也同样适用于多层通道。
较佳的，第二容置空间400内设有隔板403，隔板403垂直连接第二容置空间400的上下面，且均匀的设于第二容置空间400内。
参照图7，上述隔板403为微柱结构，隔板403可以保证液面齐头并进，保证平铺腔中每个角落都铺满液滴，同时，可以用于引导微液滴悬浮液的流动。
本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第二个实施例，该实施例不同于第一个实施例的是：在本实施例中，还包括控制通道500，控制通道500包括控制道进口501、控制流道502和控制道出口503，控制流道502的一端与控制道进口501相联通，另一端与控制道出口503相连通，控制道进口501自正面M向反面N的方向凹陷，凹陷至与控制流道502相连通，控制道出口503自反面N向正面M的方向凹陷，凹陷至与控制流道502相连通。
具体的，参照图1～图8b，该实施例中的液滴微流控芯片区分为正面M和反面N，主体包括进样口100、微流通道200、第一容置空间300、第二容置空间400和控制通道500，样品和油相通过进样口100进入到液滴微流控芯片内，并通过微流通道200依次流入到第一容置空间300和第二容置空间400中，完成核酸高灵敏检测。其中，在第一容置空间300中进行扩增，扩增后在控制通道500作用下，使得微液滴进入第二容置空间400，液滴在第二容置空间400中，微液滴平铺成一层。最后通过对第二容置空间400中的微液滴进行拍照，统计，完成结果读出。
进样口100，包括样品进样腔101和油相进样腔102，两者均自正面M向反面N的方向凹陷，且凹陷的深度相同，均不穿透微流控芯片的反面N。
需要说明的是，在本实施例中，样品进样腔101和油相进样腔102不穿透液滴微流控芯片的正面M和反面N的原因是：保证样品或者油相可以有保存密封的空间，如果穿透正面M和反面N的话，那样样品或者油相容易造成外泄，造成环境的污染，因为如果在驻留处(反面N)密封是一大问题，很容易造成液体的泄露，如果设置成开盖类型，容易产生交叉污染的风险，采用本申请的实施方式可以提高芯片在做数字PCR时的成功率和时效性。这里的时效性为检测周期，时效性也是通过液滴在第二容置空间400平铺成一层才有的技术效果。
需要说明的是，油相采用的是矿物油以及表面活性剂EM90、Triton X-100、Span80等，本实施例中的油相和表面活性剂的选择仅是说明性的，可使用其他类型的油相及表面活性剂。
微流通道200，自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向上凹陷形成流道，样品自样品进样腔101通过微流通道200与自油相进样腔102和微流通道200汇流，制备液滴，并流至第一容置空间300。
需要说明的是，这里的微流通道200自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向上凹陷是为了避免样品进样腔101和油相进样腔102内有残留液体，因此，微流通道200的最底部应该不高于样品进样腔101或油相进样腔102的最低处。
较佳的，在本实施例中，油相进样腔102设于所述样品进样腔101的正上方，所述油相进样腔102分左支路102a和右支路102b往下流。
例如，需要样品和油相两者能够在相同时间达到汇聚点，那么，自样品进样腔101流出的流通支路101a是曲折的，通过计算，确保样品通过流通支路101a曲折路程到达汇聚点所耗费的时间等于油相通过左支路102a或右支路102b到达汇聚点的时间。
需要说明的是，在本申请中，将101a设计成弯拐，目的是控制水相的流阻，调节生成液滴时的水相油相流量比。
应当说明的是，流通支路101a的宽度小于左支路102a或右支路102b。
应当说明的是，汇聚点形成液滴的流道连通左支路102a、右支路102b、流通支路101a和微流通道200，且其流通的宽度和流通支路101a的宽度相等。
第一容置空间300，包括液滴出口301和平铺腔进口302，因为第一容置空间300设于液滴微流控芯片的反面N，所以液滴出口301设于反面N，并且自反面N向正面M方向凹陷，凹陷至与微流通道200汇通，液滴通过液滴出口301自微流通道200流至第一容置空间300，在第一容置空间300完成扩增。
当液滴制备环节停止后，对扩增腔进行热循环，这里的热循环只需要对扩增腔进行局部加热即可，但是，对整个芯片加热也同样可以实现液滴中核酸扩增之目的。
需要说明的是，在液滴的制备及扩增环节，微液滴处于自由状态(微液滴自由地悬浮在油相中，油相充分地包裹微液滴，微液滴稳定性高)。这样就有效地保障了液滴的稳定性，减少了现有技术中的数字PCR芯片种种限制(如液滴数目有限，芯片材料，加工工艺等方面的限制)，并增加了微液滴数目的潜能，扩展了芯片材料及工艺的可选择性。
较佳的，第一容置空间300还包括毛细管303，毛细管303与平铺腔进口302相连接，伸入到第一容置空间300的底部。
参照图10，完成PCR扩增反应后，微液滴悬浮液在控制通道500的作用下下沉，微液滴悬浮液将会通过毛细管303进入到第二容置空间400内。
优选的，毛细管303内径为0.5mm的特氟龙毛细管，但是，该材质及尺寸的选择仅是说明性的，不仅仅限于此。
控制通道500包括控制道进口501、控制流道502和控制道出口503，控制流道502的一端与控制道进口501相联通，另一端与控制道出口503相连通，控制道进口501自正面M向反面N的方向凹陷，凹陷至与控制流道502相连通，控制道出口503自反面N向正面M的方向凹陷，凹陷至与控制流道502相连通。
控制道进口501通入与油相不相溶的相，使得自控制道进口501通入的气体或者液体通过控制流道502和控制道出口503能够对第一容置空间300内的微液滴悬浮液施压，使得微液滴悬浮液能够通过毛细管303到达第二容置空间400，优化了实施例1中需要翻转芯片的做法。
第二容置空间400，液滴自第一容置空间300通过平铺腔进口302流至第二容置空间400内。需要注意的是，第二容置空间400设于液滴微流控芯片的内部，较佳的，第二容置空间400的最低端不高于微流通道200的最低端。而第一容置空间300设于液滴微流控芯片的反面N，所以平铺腔进口302自反面N向正面M方向凹陷，凹陷至与微流通道200汇通。
需要说明的是，第二容置空间400的深度与制备的微液滴的直径相当，用于实现微液滴单层平铺。例如，第二容置空间400的凹陷的深度为50微米，制备微液滴的直径为30～60微米之间。当液滴比较少，即液滴的数量比较少时，不会出现液滴不能平铺的效果，顶多就是液滴比较稀疏而已，见下图8a和8b举例。若液体比较多，即液滴比较多，过多的液滴会从出口溢出。因此，液滴平铺腔的深度在0.5d到2d的范围内，d代表微液滴的直径。第二容置空间400的体积一般能容纳2万个以上微液滴，优选地容纳5万个以上微液滴。
较佳的，第二容置空间400包括出口401，出口401与第二容置空间400相连通，出口401自正面M向反面N方向凹陷，凹陷至与第二容置空间400相连通。
在本实施例中，在独立的区域内分别完成数字PCR的三环节：液滴制备，扩增及统计计数。各个功能区的独立，能够避免不同流程的相互干扰，仅在液滴计数统计环节(液滴计数统计环节是在第二容置空间400中完成)中实现液滴平铺成一层的效果，平铺一层有益于提高结果读出过程的效率。
需要说明的是，在本实例中，采用软光刻工艺在聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作相应的微结构(需要注意的是，软光刻工艺及PDMS仅是说明性的，可使用其他材料及工艺)，并通过打孔、键合等工艺，形成样品进样腔101、油相进样腔102、微流通道200、第二容置空间400、流通支路101a、左支路102a、右支路102b以及汇聚点。
较佳的，第一容置空间300采用200微升的PCR管。
需要注意的是，此处选择200微升的PCR管仅是说明性的，可使用其他体积的PCR管。还应该理解的是，此处PCR管是充当扩增腔的作用，其他通过注塑或微加工工艺集成在芯片上的可用于扩增的微腔也在本发明的范围内。
需要说明的是，这个实例中讲述的微流控通道是同层凹陷，但是本发明也同样适用于多层通道。
较佳的，第二容置空间400内设有隔板403，隔板403垂直连接第二容置空间400的上下面，且均匀的设于第二容置空间400内，隔板403为微柱结构，隔板403可以保证液面齐头并进，保证平铺腔中每个角落都铺满液滴，同时，可以用于引导微液滴悬浮液的流动。
需要说明的是，在微液滴悬浮液流入到第一容置空间300内的过程中，气泡以及第一容置空间300内的空气将会通过出口401释放。
本发明核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片提供的第三个实施例，该实施例不同于第二个实施例的是：控制道进口501注入的100微升的氟碳油，其他的与第二个实施例的实施类似，具体的流向参照图11。
本发明还提供了一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法，该方法中采用核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，样品自样品进样腔101流入，油相自油相进样腔102流入，样品和油相在微流通道200内汇流形成液滴；液滴沿着微流通道200流至第一容置空间300内，气泡及第一容置空间300内的空气会通过出口401释放；液滴制备完成进入到第一容置空间300内，对第一容置空间300进行加热，完成PCR扩增反应；控制道进口501施压后，液滴通过毛细管303进入到第二容置空间400内。
较佳的，在毛细管303及第二容置空间400的毛细力做用下，微液滴悬浮液平铺于第二容置空间400内。因为毛细管提供的毛细力只能将液滴吸到302处，更多地还是靠400及其中的隔板提供毛细力将液滴吸进400。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其区分为正面（M）和反面（N），其特征在于：包括，
进样口（100），包括样品进样腔（101）和油相进样腔（102），两者均自所述正面（M）向所述反面（N）的方向凹陷，凹陷至微流通道（200）的层面；
微流通道（200），自所述样品进样腔（101）和油相进样腔（102）的底部向上凹陷形成流道，样品自所述样品进样腔（101）通过微流通道（200）与自所述油相进样腔（102）和微流通道（200）汇流，制备液滴，并流至第一容置空间（300）；
第一容置空间（300），包括液滴出口（301）和平铺腔进口（302），所述液滴出口（301）和平铺腔进口（302）自所述反面（N）向所述正面（M）方向凹陷，凹陷至与所述微流通道（200）汇通，所述液滴通过所述液滴出口（301）自所述微流通道（200）流至所述第一容置空间（300）；
第二容置空间（400），液滴自所述第一容置空间（300）通过所述平铺腔进口（302）流至所述第二容置空间（400）内；
还包括控制通道（500），其包括控制道进口（501）、控制流道（502）和控制道出口（503），所述控制流道（502）的一端与所述控制道进口（501）相联通，另一端与所述控制道出口（503）相连通；
其中，所述控制道进口（501）自所述正面（M）向所述反面（N）的方向凹陷，凹陷至与所述控制流道（502）相连通；
其中，所述控制道出口（503）自所述反面（N）向所述正面（M）的方向凹陷，凹陷至与所述控制流道（502）相连通；
所述第一容置空间（300）还包括毛细管（303），所述毛细管（303）与所述平铺腔进口（302）相连接，伸入到所述第一容置空间（300）的底部。
2.根据权利要求1所述的核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其特征在于：所述第二容置空间（400）包括出口（401），所述出口（401）与所述第二容置空间（400）相连通，
其中，所述出口（401）自所述正面（M）向所述反面（N）方向凹陷，凹陷至与所述第二容置空间（400）相连通。
3.根据权利要求2所述的核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其特征在于：所述第二容置空间（400）内设有隔板（403），
所述隔板（403）垂直连接所述第二容置空间（400）的上下面，且均匀的设于所述第二容置空间（400）内。
4.根据权利要求3所述的核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其特征在于：所述控制道进口（501）通入与油相不相溶的相。
5.根据权利要求4所述的核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其特征在于：所述控制道进口（501）注入氟碳油。
6.根据权利要求2或3所述的核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片，其特征在于：第二容置空间（400）的深度在 0.5d 到2d的范围内，其中，d代表微液滴的直径。
7.如权利要求2~6任一项所述一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法，其特征在于：样品自所述样品进样腔（101）流入，油相自所述油相进样腔（102）流入，样品和油相在微流通道（200）内汇流形成液滴；
所述液滴沿着所述微流通道（200）流至第一容置空间（300）内，气泡及所述第一容置空间（300）内的空气会通过所述出口（401）释放；
其中，所述液滴制备完成进入到所述第一容置空间（300）内，对所述第一容置空间（300）进行加热，完成PCR扩增反应；
其中，控制道进口（501）施压后，所述液滴通过所述毛细管（303）进入到所述第二容置空间（400）内。
8.根据权利要求7所述核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片的使用方法，其特征在于：在所述毛细管（303）及第二容置空间（400）的毛细力做用下，微液滴悬浮液平铺于所述第二容置空间（400）内。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN206109411U (zh) * | 2016-10-09 | 2017-04-19 | 戴敬 | 基于高效液滴微反应器的绝对定量数字核酸分析系统 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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