CN105543064B - 一种数字pcr芯片及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种数字PCR芯片及其使用方法：该芯片包括硅质微孔芯片、加注样品的微流体通道和铝质导热基座，所述硅质微孔芯片上加工有20,000个内壁亲水、表面疏水的通孔。亲水性的核酸或细胞样品流过硅质微孔芯片上方时，被铺展、单分散、并保留在每一个微孔中，再通入矿物油，充满硅质微孔芯片之外的整个空间，实现对每个微反应体系的完全隔离。本发明所述的数字PCR芯片具有设计新颖，容易使用，成本低廉，适用范围广泛的优点，与传统的油包水单分散核酸样品的方法相比成本降低了10多倍，样品准备时间短，操作方法简单，同时分散核酸样品的准确性、反应体系的可靠性极佳，交叉污染小。

Description

一种数字PCR芯片及其使用方法
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学技术应用领域，具体涉及一种分散微量核酸或细胞溶液的装置及使用方法。
背景技术
在生物、化学检测分析中，聚合酶链式反应(PCR，polymers chain reaction)技术是针对核酸的一种强有力的研究技术和手段。自1985年Kary Mullis发明PCR方法以来，PCR仪便出现在世界各地大大小小的实验室中，从第一代的常规半定量终点式PCR技术到第二代的实时定量PCR技术(Real-time PCR)，再发展到现在的第三代绝对定量化的数字PCR技术，PCR技术突飞猛进，朝着绝对定量化、高精确度、高通量以及易检测性的方向发展。早期的绝对定量PCR是通过微流体芯片流路将核酸溶液分散成为成千上万个纳升级别的微液滴，并通过油包水的结构将每个液滴分离开来，然后通过荧光探针标记的核酸扩增，放大目标分子的信号，最终通过光电倍增管(PMT，photomultiplier)进行逐个检测。油包水技术路线存在一些难以避免的问题，譬如微液滴破裂造成的污染，微液滴发生器复杂的流路设计，逐一检测的耗时性等。新一代的绝对定量数字PCR基于微孔芯片和高分辨率感光元件(CCD，Charge Coupled Device)成像技术，省去了复杂的芯片流路设计和漫长的检测分析过程，保证了每一个微反应体系之间具有良好的隔离，PCR扩增反应的结果通过CCD拍摄一张荧光照片，就能够进行快速分析，确定目标分子的有无和数量。
目前市场上的基于微孔PCR的芯片存在的问题就是加样过程难以准确控制，需要专业的训练和仪器的辅助才能达到理想的样品分散效果。而且作为耗材的芯片本身和配套的检测仪器的价格也十分昂贵。因此，发明成本低廉、使用简单甚至无需培训的绝对定量化数字PCR芯片具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用方便、可以自动分散核酸或细胞溶液的数字PCR芯片及其使用方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
该PCR芯片包括硅质微孔芯片以及内部具有流道的芯片壳体，所述硅质微孔芯片表面疏水而硅质微孔芯片的微孔内壁亲水，所述芯片壳体内设置有与所述流道连通的空腔，所述芯片壳体的上侧表面设置有与所述空腔连通的通气孔以及与所述流道连通的加样孔，硅质微孔芯片固定于所述空腔内靠近所述流道一侧且位于所述流道下方，硅质微孔芯片与所述空腔之间留有用于连通所述空腔位于硅质微孔芯片上下两侧的空间的间隙，所述芯片壳体的下侧表面设置有作为所述空腔下侧壁面的导热层，所述空腔的上侧壁面与硅质微孔芯片之间存在100～200μm间隙，硅质微孔芯片的微孔朝向所述空腔的上侧壁面。
所述芯片壳体的上侧表面设置有用于控制所述流道开闭的阀门(即PDMS薄膜截止阀)。
所述硅质微孔芯片表面的尺寸为A×B，其中，A≥10mm，B≥10mm，所述微孔的数量为20000个以上，单个微孔的容积为0.8～1.5nL。
所述PCR芯片具体包括依次层叠的第一PMMA板、第一双面胶、第二PMMA板、若干层中间双面胶、第三PMMA板以及铝质导热基座，硅质微孔芯片位于第三PMMA板上的第三PMMA板镂空窗口中，所述若干层中间双面胶上具有与所述第三PMMA板镂空窗口位置对应的中间双面胶镂空窗口，与第二PMMA板邻接的一层中间双面胶上设置有与中间双面胶镂空窗口连接的镂空流道，硅质微孔芯片部分边缘与中间双面胶镂口窗口边缘接触，铝质导热基座将第三PMMA板镂空窗口盖住，第一PMMA板上设置有通气孔、与所述镂空流道相应位置点对应的加样孔以及PDMS薄膜截止阀安装孔，通气孔位于第三PMMA板镂空窗口覆盖区域外，且位于铝质导热基座覆盖区域内，第一双面胶以及第二PMMA板上设置有与所述安装孔以及加样孔位置对应的连通孔，连通孔的尺寸小于第一PMMA板上对应的孔结构的尺寸3～4mm，所述安装孔中设置有PDMS薄片，第一双面胶、第二PMMA板、所述若干层中间双面胶以及第三PMMA板上设置有与通气孔位置对应的连通气孔。
上述数字PCR芯片的使用方法，包括以下步骤：
1)将亲水性样品溶液注入加样孔中，并利用外压使所述样品溶液沿所述流道流至硅质微孔芯片，然后分散至所述微孔内；
2)经过步骤1)后，由加样孔注入密封油，利用密封油填充所述空腔中硅质微孔芯片之外的部分，同时排出所述空腔内的空气，形成以所述微孔为单位的多个互相独立的密闭微反应体系。
所述外压由注射器提供。
所述样品溶液的一次注入总体积至少为15μL。
所述样品溶液为核酸溶液或细胞溶液。
所述核酸溶液的浓度小于1333copies/μL；所述细胞溶液的浓度小于1.3×106个/mL。
本发明的有益效果为：
本发明充分利用硅质微孔芯片与芯片壳体的空隙所发挥的毛细作用，以及硅质微孔芯片自身表面疏水内部亲水的特点，使亲水性的核酸或细胞样品溶液流过硅质微孔芯片上方时，被铺展、单分散、并保留在每一个微孔中，再通入密封油充满硅质微孔芯片之外的整个空间，实现对每个微反应体系的完全隔离。本发明所述的数字PCR芯片具有设计新颖，容易使用，成本低廉，适用范围广泛的优点，与传统的油包水单分散核酸样品的方法相比成本降低了10多倍，样品准备时间短，操作方法简单，同时分散核酸样品的准确性、反应体系的可靠性极佳，交叉污染小，且便于操作，无需专业知识培训。
附图说明
图1为本发明所述PCR芯片的结构示意图；
图2为本发明所述PCR芯片部件的多层组装示意图；
图3为本发明所述铝质导热基座的结构示意图；其中，(a)为剖视图，(b)为俯视图；
图4为本发明所述硅质微孔芯片的扫描电镜图；其中，(a)为硅质微孔芯片正面(100倍)，(b)为硅质微孔芯片截面(200倍)；
图5为本发明所述PCR芯片对于亲水性色素溶液的扩散图；其中，(a)为扩散前(100倍，图中白色线段代表比例尺60μm)，(b)为扩散后(100倍)；
图6为本发明所述硅质微孔芯片在加入了色素溶液后的液体边界(200倍)；
图7a为本发明所述PCR芯片对浓度为106个/mL的细胞溶液进行分散之后进行死活细胞荧光染色的活细胞荧光图(100倍)；
图7b为本发明所述PCR芯片对浓度为106个/mL的细胞溶液进行单细胞分散之后在明场显微镜下的观察结果(40倍，放大图：200倍)；
图7c为本发明所述PCR芯片对浓度为106个/mL的细胞溶液进行单细胞分散之后在明场显微镜下的观察结果(400倍)；
图8a为本发明所述PCR芯片对浓度为106个/mL的细胞溶液进行单细胞分散之后的细胞DAPI荧光染色图(100倍)；
图8b为本发明所述PCR芯片对浓度为106个/mL的细胞溶液进行单细胞分散之后的细胞DAPI荧光染色图(200倍)；
图9为本发明所述PCR芯片对加入了Taqman荧光探针的核酸溶液在PCR反应后的荧光检测结果(100倍，放大图：200倍)；
图10为本发明所述PCR芯片的亲水性样品的油封结果(100倍，放大图：200倍)；
图中：1为PMMA板，2为加样孔，3为PDMS薄膜截止阀安装孔，4为硅质微孔芯片，5为通气孔，6为铝质导热基座，7为双面胶，8为镂空窗口，9为镂空流道。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
参见图1、图4(a)以及图4(b)，本发明所述数字PCR芯片包括多层PMMA(polymethylmethacrylate，有机玻璃)板1(厚度为1mm)、加样孔2、PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)薄膜截止阀、硅质微孔芯片4、通气孔5和铝质导热基座6。所述硅质微孔芯片4包括厚约300μm、面积为1平方厘米的矩形硅质片材，采用光刻法在硅质片材上加工约20,000个边长为30μm的正六边形通孔(即微孔)，每个通孔的容积约为1nL。通孔加工好后，硅质片材首先经过氧化，使所有表面(包括通孔内壁表面)呈亲水性，随后抛光硅质片材上表面和下表面，暴露出疏水的硅质，形成具有上、下表面疏水、微孔内壁亲水的芯片结构。
所述PCR芯片还包括多层厚度约50μm的3M双面胶7，在制作PCR芯片时，双面胶7既用于连接PMMA板1与硅质微孔芯片4，又用于形成PMMA板1与硅质微孔芯片4之间的空隙，还用于形成流道图案。所述PCR芯片的检测精确度(检测极限)为：20,000个核酸分子(或细胞)中可检测到一个目标核酸拷贝(或目标细胞)。
参见图2，所述PCR芯片具体包括依次层叠的第一PMMA板、第一双面胶、第二PMMA板、第二双面胶、第三双面胶、第三PMMA板以及铝质导热基座6，单层PMMA板的图案由台式激光切割机加工而成，硅质微孔芯片4位于第三PMMA板上的第三PMMA板镂空窗口中，第三双面胶以及第二双面胶上具有与上述第三PMMA板镂空窗口位置对应的第三双面胶镂空窗口以及第二双面胶镂空窗口，第二双面胶上设置有与第二双面胶镂空窗口连接的镂空流道9(流道图案根据实验需要设计)。硅质微孔芯片4部分边缘与第三双面胶镂口窗口边缘接触(靠近流道侧)，完成硅质微孔芯片4固定，铝质导热基座6将第三PMMA板镂空窗口盖住(铝质导热基座6与第二PMMA板、第三PMMA板镂空窗口、第二以及第三双面胶镂空窗口共同形成包围硅质微孔芯片4的空腔)，第一PMMA板上设置有与镂空流道相应位置点对应的加样孔2以及PDMS薄膜截止阀安装孔3，此外，第一PMMA板上还设置有通气孔5，通气孔5位于第三PMMA板镂空窗口覆盖区域外，同时，位于铝质导热基座6覆盖区域内，第一双面胶以及第二PMMA板上设置有与所述安装孔以及加样孔位置对应的连通孔，连通孔尺寸略小于第一PMMA板上对应的孔结构的尺寸(例如加样孔的直径为5～8mm，比对应的连通孔的直径大3～4mm)，使加样孔面积较其下层连通孔面积大，这样，可以在加样孔内设置乳胶圈，并通过挤压乳胶圈封闭加样孔(乳胶圈在挤压下形变进入连通孔)，可以保证样品(例如，亲水性的核酸或细胞溶液)不会在其加样点后方(样品流向)的某个加样孔处溢出PCR芯片，PDMS薄膜截止阀也是类似原理，即将PDMS薄片(厚度与PMMA板相同)设置于所述安装孔中，挤压，则堵住流道(第二PMMA板、第二以及第三双面胶叠合后形成)对应位置。第一双面胶、第二PMMA板、第二双面胶、第三双面胶以及第三PMMA板上设置有与所述通气孔位置对应的连通气孔。
参见图3(a)以及图3(b)，所述铝质导热基座6具体包括：底板(可选为正方形或长方形)以及侧板，铝质导热基座6尺寸可选为：高度H＝5.3mm，长度L＝宽度W＝25mm，侧板厚度T2＝1.7mm，底板厚度T1＝1.3mm。侧板沿底板边缘连续布置，侧板一端与底板连接，另一端与第三PMMA板连接。
所述硅质微孔芯片4三侧边缘宽约1mm的区域与PMMA板(第三PMMA板)通过双面胶(第三双面胶)粘结起来，用于限制液体的流动区域，同时，也不妨碍液体由硅质微孔芯片4第四侧边缘(远离流道的一侧，与第三PMMA板镂空窗口存在间隙)流至硅质微孔芯片4下留出的空间，硅质微孔芯片4下留出的空间(靠近铝质导热基座6一侧)的作用还在于用于平衡硅质微孔芯片4两侧的气压，帮助硅质微孔芯片4通孔结构发挥毛细作用。
本发明所述PCR芯片适用的范围非常广泛，用所述PCR芯片可分散亲水性的核酸溶液，进行PCR扩增；用所述PCR芯片还可分散亲水性的细胞溶液，进行单细胞观察。
对于核酸样品的特异性或非特异性的PCR检测，15μL核酸溶液(小于1333拷贝/微升)通过加样孔2由注射器提供的外压通入所述PCR芯片的流道，并以一定的流速加注到硅质微孔芯片4上表面与PMMA板(指第二PMMA板)之间的空隙(宽100～200μm，取决于第二PMMA板与第三PMMA板之间双面胶的总厚度)中。所述的PMMA板1为透光性极好的有机高分子疏水材料，其与硅质微孔芯片4之间形成的微小空隙所产生的毛细力将样品铺散到整个硅质微孔芯片4上，此时，溶液中的核酸分子在通孔内壁的亲水性与硅质微孔芯片表面的疏水性作用下，进入到通孔中，通孔内产生的毛细力将核酸分子保持在通孔内。随后可通过加样孔2缓慢加入密封油(例如矿物油)，用于赶走所述PCR芯片流道内和硅质微孔芯片4上方未扩散的样品，同时填充硅质微孔芯片4周围的空间，密封油也将硅质微孔芯片4上的每一个通孔完全隔离开，作为单独的微反应体系。注入密封油时，铝质导热基座6内的空气经由通气孔5排出。注满密封油后，将铝质导热基座6放置在变温加热台上，即可运行PCR反应的控温程序，开始所述PCR芯片上的核酸扩增反应，配合荧光成像系统，即可以实现单分子核酸的PCR反应与荧光检测。
对于各种细胞溶液的明场形态观察和特异性荧光染色观察，将细胞溶液(小于1.3×106个/mL)加入加样孔，由注射器推入流道，流经硅质微孔芯片4上表面时，细胞溶液在硅质微孔芯片4与PMMA板上盖(指第二PMMA板)的空隙之间借助毛细力，扩散至整张硅质微孔芯片，此时，溶液中的细胞在通孔内壁的亲水性与硅质微孔芯片4表面的疏水性作用下，进入到通孔中。通孔内产生的毛细力将细胞保持在通孔内。然后将密封油(矿物油)加入加样孔，由注射器推入流道，流经硅质微孔芯片4表面，推走未扩散的细胞样品，并填满硅质微孔芯片4周围空间。
通过控制PDMS薄膜截止阀的开合，可改变不同试剂流入硅质微孔芯片4的顺序。
例1用PCR芯片分散有色染料
步骤1：将15μL溶解后有色染料注入PCR芯片的加样孔中，在外压推动下，流经硅质微孔芯片，亲水性的染料分散并进入硅质微孔芯片中。由于硅质微孔硅片的亲疏水结构，液体在扩散过程中形成了锯齿状的边缘(见图6)。
步骤2：注入密封油，填充硅质微孔芯片之外的空腔，同时排出腔内的空气，形成20,000个互相独立的密闭体系。这样将加入的15μL有色染料溶液均匀地分散成了大约20,000个每个体积约1nL的微体系，说明该PCR芯片具有均匀分散核酸或细胞样品溶液的潜力(见图5(a)、图5(b)、图10)。
例2用PCR芯片分散一定浓度的细胞溶液
步骤1：将15μL浓度为106个/mL的MCF-7细胞分别进行死活染色和DAPI染色，然后分别注入PCR芯片的加样孔中，在外压推动下，流经硅质微孔芯片，溶液中的细胞分散并进入硅质微孔芯片中。
步骤2：注入密封油，填充硅质微孔芯片之外的空腔，同时排出腔内的空气，形成20,000个互相独立的单细胞阵列。不仅在明场下能够清晰的观察到独立的细胞(见图7b，图7c)，还能够观察细胞的死活染色结果(见图7a)和DAPI染色结果(见图8a和图8b)。说明了所述PCR芯片具有形成单分散地细胞阵列的能力，还说明在所述PCR芯片上能够进行细胞的荧光染色观察。
例3用PCR芯片分散核酸溶液，并进行PCR扩增
步骤1：将1～2μL浓度为1000拷贝/μL的标准核酸溶液与PCR预混液混合(混合后达到15μL)，然后注入PCR芯片的加样孔，在外压推动下，流经硅质微孔芯片，溶液中的核酸分子分散并进入硅质微孔芯片中。
步骤2：注入密封油，填充硅质微孔芯片之外的空腔，同时排出腔内的空气，形成20,000个互相独立的PCR微反应体系。将PCR芯片置于变温加热台(铝制导热基座与变温加热台接触)，即可运行PCR反应的控温程序。待PCR结束，将PCR芯片置于荧光显微镜下，即可获得该标准核酸样品的Taqman探针荧光检测图像(见图9)。图9中发亮的微孔即代表可与荧光探针结合的核酸序列进行了扩增，扩增过程中不断产生了Taqman探针的目的荧光。目的荧光对应的微孔占所有显出背景荧光的微孔的比例即可代表目标核酸序列在整个样品中的浓度。

Claims (9)

1.一种数字PCR芯片，其特征在于：该PCR芯片包括硅质微孔芯片(4)以及内部具有流道的芯片壳体，所述硅质微孔芯片(4)表面疏水而硅质微孔芯片(4)的微孔内壁亲水，所述芯片壳体内设置有与所述流道连通的空腔，所述芯片壳体的上侧表面设置有与所述空腔连通的通气孔(5)以及与所述流道连通的加样孔(2)，硅质微孔芯片(4)固定于所述空腔内靠近所述流道一侧且位于所述流道下方，硅质微孔芯片(4)与所述空腔之间留有用于连通所述空腔位于硅质微孔芯片(4)上下两侧的空间的间隙，所述芯片壳体的下侧表面设置有作为所述空腔下侧壁面的导热基座，硅质微孔芯片(4)的微孔朝向所述空腔的上侧壁面，所述空腔的上侧壁面与硅质微孔芯片(4)之间存在100～200μm空隙以产生毛细力将样品铺散到整个硅质微孔芯片(4)上。
2.根据权利要求1所述一种数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片壳体的上侧表面设置有用于控制所述流道开闭的PDMS薄膜截止阀。
3.根据权利要求1所述一种数字PCR芯片，其特征在于：所述硅质微孔芯片(4)的尺寸为A×B，A≥10mm，B≥10mm，所述微孔的数量为20000个以上，单个微孔的容积为0.8～1.5nL。
4.根据权利要求1所述一种数字PCR芯片，其特征在于：所述PCR芯片具体包括依次层叠的第一PMMA板、第一双面胶、第二PMMA板、若干层中间双面胶、第三PMMA板以及铝质导热基座(6)，硅质微孔芯片(4)位于第三PMMA板上的第三PMMA板镂空窗口中，所述若干层中间双面胶上具有与所述第三PMMA板镂空窗口位置对应的中间双面胶镂空窗口，与第二PMMA板邻接的一层中间双面胶上设置有与中间双面胶镂空窗口连接的镂空流道(9)，硅质微孔芯片(4)部分边缘与中间双面胶镂空窗口边缘接触，铝质导热基座(6)将第三PMMA板镂空窗口盖住，第一PMMA板上设置有通气孔(5)、与所述镂空流道(9)相应位置点对应的加样孔(2)以及PDMS薄膜截止阀安装孔，通气孔(5)位于第三PMMA板镂空窗口覆盖区域外，且位于铝质导热基座(6)覆盖区域内，第一双面胶以及第二PMMA板上设置有与所述安装孔以及加样孔位置对应的连通孔，连通孔的尺寸小于第一PMMA板上对应的孔结构的尺寸，所述安装孔中设置有PDMS薄片，第一双面胶、第二PMMA板、所述若干层中间双面胶以及第三PMMA板上设置有与通气孔(5)位置对应的连通气孔。
5.一种如权利要求1所述数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将亲水性样品溶液注入加样孔(2)中，并利用外压使所述样品溶液沿所述流道流至硅质微孔芯片(4)，所述空隙所产生的毛细力将样品铺散到整个硅质微孔芯片(4)上，然后进入所述微孔内；
2)经过步骤1)后，由加样孔(2)注入密封油，利用密封油填充所述空腔中硅质微孔芯片(4)之外的部分，同时经由通气孔(5)排出所述空腔内的空气，形成以所述微孔为单位的多个互相独立的密闭体系。
6.根据权利要求5所述一种数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：所述外压由注射器提供。
7.根据权利要求5所述一种数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：所述样品溶液的一次注入总体积至少为15μL。
8.根据权利要求5所述一种数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：所述样品溶液为核酸溶液或细胞溶液。
9.根据权利要求8所述一种数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：所述核酸溶液的浓度小于1333copies/μL；所述细胞溶液的浓度小于1.3×106个/mL。
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