CN113041256A - 一种使用CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖的联合给药系统、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用CpG寡脱氧核苷酸和β‑1，3‑葡聚糖的联合给药系统，属于癌症的免疫治疗领域，本发明抑瘤效果显著，较单独用药或以复合物的联合给药更能发挥CpG寡脱氧核苷酸和β‑1，3‑葡聚糖的联合抑瘤效果，尤其是提前注射β‑1，3‑葡聚糖比CpG寡脱氧核苷酸和β‑1，3‑葡聚糖一起给药抑瘤效果好。

Description

一种使用CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖的联合给药系统、 方法和用途
技术领域
本发明涉及癌症的免疫治疗领域，具体涉及一种使用CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖的联合给药系统、方法和用途。
背景技术
CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)是包含免疫刺激CpG基序的短的(约20个碱基对)、单链的合成DNA片段，可以通过激活Toll样受体9来刺激机体的先天免疫和获得性免疫系统，主要包括可以直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞等；间接激活T细胞、NK细胞；诱导以TH1型为主的免疫应答，最终使得机体内的CD8+T细胞、Type I IFN增加，因此该CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)在肿瘤免疫治疗中有着强大的潜在应用价值。
目前存在四种类型的CpG寡脱氧核苷酸，其每一种具有不同的骨架、序列和免疫刺激特性。A型CpG寡脱氧核苷酸通常包含具有磷酸二酯(PO)骨架和硫代磷酸酯(PS)多G尾的一个回文CpG基序，通过G残基形成分子间四分体和高分子量聚集体，增强稳定性，增加内体摄取和配体浓度，从而使其活化类浆细胞DC(pDC)以产生大量的IFN-α，但无法诱导pDC成熟和B细胞活化。其他三类(B，C，P型)CpG寡脱氧核苷酸由硫代磷酸酯(PS)骨架组成，B型CpG寡脱氧核苷酸是不含回文的多CpG基序，最有效的激活人类细胞的ODN通常有三个CpG基序，额外的CpG基序不能进一步增强活性，并且在18到26个核苷酸之间，能强烈活化B细胞以产生IL-6，但几乎不产生IFN-α；C型CpG寡脱氧核苷酸由一个位于5′端或近5′端的刺激性六聚CpG基序组成，并由一个T间隔基连接到一个富含GC的回文序列，具有类似于B型CpG寡脱氧核苷酸的一些序列要求，并结合了A型和B型的特性，刺激B细胞和活化类浆细胞DC(pDC)。P型CpG寡脱氧核苷酸分别含有两个回文CpG基序，也可以如B型活化B细胞和如A型活化类浆细胞DC(pDC)。
β-1,3-葡聚糖是一类主链由β-1,3-糖苷键连接而成的多聚糖,通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,2/β-1,4/β-1,6-连接的支链，如香菇多糖和裂褶菌多糖(SPG)等。β-1,3-葡聚糖可以通过调节各种细胞因子的合成释放，清除自由基的方式来解除由环磷酰胺所引起的免疫抑制作用，除此之外还展现出了更为广泛的免疫学活性，包括：激活巨噬细胞、树突状细胞和和单核细胞，诱导NO的合成，调控与免疫反应相关的细胞信号传递，降低电离辐射对机体免疫力的损伤，促进免疫球蛋白的合成等。香菇多糖是一种以β-D(1→3)葡聚糖残基为主链，侧链为(1→6)葡聚糖残基的葡聚糖，具有免疫增强作用，可通过增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤活性。裂褶菌多糖(SPG)，一种来源于裂褶菌的可溶性β-1，3-葡聚糖，是在日本被批准作为宫颈癌患者的放疗增强剂的药物，持续使用近三十年。
基于CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)及β-1,3-葡聚糖在肿瘤免疫治疗的作用机理及应用价值，目前已有两者联用的研究，如专利CN105683372A中公开了一种具有免疫增强活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途，将B型CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖组合成一个复合体，进行一起给药。但是其治疗肿瘤的效果不佳，不能发挥两者联合最大的抑瘤效果。
发明内容
本发明的目的在于解决CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖联合治疗癌症效果不佳的问题，提供一种CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖的联合给药系统，抑瘤效果显著，较单独用药或以复合物的联合给药更能发挥CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖的联合抑瘤效果，尤其是提前注射β-1，3-葡聚糖比CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖一起给药抑瘤效果好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，包含CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖。
进一步的技术方案，该给药系统的使用方法为先用β-1，3-葡聚糖，再用CpG寡脱氧核苷酸或者β-1，3-葡聚糖、CpG寡脱氧核苷酸同时用药。
进一步的技术方案，所述的使用方法中，β-1，3-葡聚糖提前0-3周给药。
进一步的技术方案，所述的β-1，3-葡聚糖使用的给药方式为口服、肌注或全身静脉给药，优选全身静脉给药。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸使用的给药方式为瘤内或瘤旁给药。
进一步的技术方案，所述的β-1，3-葡聚糖为以β-(1→3)葡聚糖为主链、β-(1→6)葡聚糖为侧链的葡聚糖。
进一步的技术方案，所述的β-1，3-葡聚糖指的是香菇多糖或裂褶菌多糖，优选β-(1→3)葡聚糖为主链，β-(1→6)葡聚糖为侧链的香菇多糖，香菇多糖分子量40万-80万。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸及β-1，3-葡聚糖为冻干制剂或注射液。
进一步的技术方案，所述的β-1，3-葡聚糖中包括辅料，辅料为甘露醇或氯化钠。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸中包括辅料，辅料为甘露醇、蔗糖、氯化钠、HPES或磷酸缓冲盐。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖给药剂量比例为1：0.1-1：5，两者的给药频次均为一周2-4次。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸是不小于10个核苷酸长度的、含有未甲基化CpG基序的人源化的寡脱氧核苷酸；其中所述寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键部分或整体被硫代磷酸酯键取代。
进一步的技术方案，所述的CpG寡脱氧核苷酸含有18-60个碱基长度；包含四种类型的CpG寡脱氧核苷酸，分别为A，B，C，P型CpG寡脱氧核苷酸；不仅包含其分子形式也包含其盐形式。
所述的CpG寡脱氧核苷酸不仅包含其分子形式也包含其盐形式，盐形式包括任何药学上可接受的盐、酯、和此类脂的盐。
所述的CpG寡脱氧核苷酸的药学上可接受的盐的优选实例包括金属盐诸如碱金属盐(例如钠盐、钾盐和锂盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；胺盐诸如无机盐(例如铵盐)和有机盐(例如，叔辛基胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N，N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐)等；无机酸盐诸如卤代氢酸盐(例如，氢氟化物、氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物)、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐诸如链烷磺酸盐(例如。甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐，乙磺酸盐)，芳基磺酸盐(例如，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐)、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；和氨基酸盐如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
所述的A型CpG寡脱氧核苷酸是指包含具有磷酸二酯(PO)骨架和硫代磷酸酯(PS)多G尾的一个回文非甲基化CpG基序的CpG寡脱氧核苷酸。
所述的B型CpG寡脱氧核苷酸是指由不含回文的多个非甲基化CpG基序及硫代磷酸酯(PS)骨架组成的CpG寡脱氧核苷酸。
所述的C型CpG寡脱氧核苷酸是指由一个位于5′端或近5′端的刺激性六聚CpG基序组成，并由一个T间隔基连接到一个富含非甲基化GC的回文序列，由硫代磷酸酯(PS)骨架组成的CpG寡脱氧核苷酸。
所述的P型CpG寡脱氧核苷酸是指由两个含有两个回文非甲基化CpG基序及硫代磷酸酯(PS)骨架组成的CpG寡脱氧核苷酸。
本发明中的CpG寡脱氧核苷酸纯度不低于70％，优选85％以上。
本发明中的CpG寡脱氧核苷酸可以采用单链、双链和三链的任何形式，但其优选是单链。
香菇多糖(Lentinan，LNT)是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，为灰白色粉末，大多为酸性多糖，溶于水、稀碱，尤其易溶于热水，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，其水溶液呈透明黏稠状，是香菇的主要有效成分，是一种宿主免疫增强剂(host defense potentiator，HDP)。
香菇多糖的临床与药理研究表明，香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等作用，香菇多糖具有免疫增强作用，其机制在体内虽无直接杀伤肿瘤细胞作用，但可通过增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤活性。在体内能使脾脏和腹腔的NK细胞活性增强，诱生干扰素与本品剂量相关，其活性与白细胞介素类或干扰素诱导剂有协同作用。另有证明，在体外本品可增强脱氧胸腺嘧啶核苷的抗艾滋病毒的活性。
目前临床上香菇多糖的适应症如下：
1.抗肿瘤与放疗、化疗、手术配合，主要用于不宜手术或复发的胃肠道肿瘤。本品加放疗、化疗治疗小细胞肺癌、乳癌、恶性淋巴瘤等。也可用于癌性胸腹水的治疗。
2.抗病毒可用于乙型肝炎及艾滋病等。
3.抗感染应用于具有抗药性的肺结核，也用于治疗老年性慢性支气管炎。
裂褶菌多糖(schizophyllan，SPG)是从裂褶菌子实体、菌丝体以及发酵液中提取出来的水溶性多糖，结构为β-(1-3)糖苷为主链，具有β-(1-6)糖苷为侧链的β-D-葡聚糖，裂褶菌多糖具有抑制肿瘤，抗菌消炎，抗辐射提高机体免疫力等多种生理活性。
本发明中的联合给药系统，其用于治疗癌症药物中的应用。
有益效果
本发明技术方案，CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖联合给药系统能起到很好的效果，通过前期实验表明，通过瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸联合静脉注射β-1，3-葡聚糖能大大提高2者的肿瘤抑制效果，有明显的联合药效；
1、本发明采用瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸联合静脉注射β-1，3-葡聚糖比其他随意组合或形成复合物更能发挥出两者的肿瘤抑制效果。
2、本发明采用瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸联合静脉注射β-1，3-葡聚糖比单独使用一种药物的肿瘤抑制效果明显更好。
3、本发明通过先或同时静脉注射香菇多糖效果比提前瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸抑瘤效果更佳。
4、本联合给药系统所需药物的制备方法简单，质量可控。
附图说明
图1为应实施例1在CT-26荷瘤小鼠身上瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1联合静脉注射β-1，3-葡聚糖较单独用药的抑瘤效果比较。
图2为实施例5CpG寡脱氧核苷酸1联合静脉注射β-1，3-葡聚糖给药顺序对药效影响的比较。
具体实施方式
下面示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施例，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、给药方案：
(1)对照组：
瘤内注射生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周3次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周3次。
5、实验方法：
将200uL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，按照上述给药方案给药。其中CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组给药方式为：先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
Figure BDA0002338429550000061
Figure BDA0002338429550000071
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组
小鼠的平均肿瘤体积)
实施例2
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
蔗糖：生产产家：默克
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、给药方案：
(1)对照组：
瘤内注射生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：蔗糖，氯化钠)，50μg/只，一周3次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，0.26mg/kg，一周2次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：蔗糖，氯化钠)，50μg/只，一周3次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周2次。
5、实验方法：
将200uL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，按照上述给药方案给药。其中CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组给药方式为：先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
分组 名称 抑瘤率(％)
1 CpG寡脱氧核苷酸组 35
2 β-1，3-葡聚糖组 15
3 CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组 70
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
实施例3
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、给药方案：
(1)对照组：
瘤内注射生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，25μg/只，一周4次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，5mg/kg，一周4次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，25μg/只，一周4次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，5mg/kg，一周4次。
5、实验方法：
将200uL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，按照上述给药方案给药。其中CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组给药方式为：先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
分组 名称 抑瘤率(％)
1 CpG寡脱氧核苷酸组 20
2 β-1，3-葡聚糖组 25
3 CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组 70
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组
小鼠的平均肿瘤体积)
实施例4
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、给药方案：
(1)对照组：
瘤内注射生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(注射液；辅料：氯化钠)，0.1mg/kg，一周3次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，0.1mg/kg，一周3次。
5、实验方法：
将200uL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，按照上述给药方案给药。其中CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组给药方式为：先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
分组 名称 抑瘤率(％)
1 CpG寡脱氧核苷酸组 35
2 β-1，3-葡聚糖组 8
3 CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组 52
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组
小鼠的平均肿瘤体积)
实施例5
给药顺序对药效影响的研究
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司。
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠乳腺癌4T1细胞
4、实验分组：
(1)对照组：
生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周2次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组(β-1，3-葡聚糖提前给药组)：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周2次。
(3)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖(同时给药组)：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周2次，2者同时给药。
(4)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组(CpG寡脱氧核苷酸提前给药组)：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周2次，香菇多糖延后给药。
5、实验方法：
β-1，3-葡聚糖提前给药组：将200μL含有1×106个4T1细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
同时给药组：将200μL含有1×106个4T1细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸并静脉注射香菇多糖，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
CpG寡脱氧核苷酸提前给药组：将200μL含有1×106个4T1细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸，给药一周后再静脉注射香菇多糖，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
序号 分组 抑瘤率(％)
1 对照组-CpG寡脱氧核苷酸组 33
2 对照组-β-1，3-葡聚糖组 20
3 β-1，3-葡聚糖提前给药组 74
4 同时给药组 69
5 CpG寡脱氧核苷酸提前给药组 45
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖给药，提前给β-1，3-葡聚糖提前给药(抑瘤率74％)或同时给药组(抑瘤率69％)抑瘤率大于CpG寡脱氧核苷酸提前给药组(抑瘤率45％)。
实施例6
CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖给药方式对药效结果的影响
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠B细胞性淋巴癌A20
4、实验分组：
(1)对照组：生理盐水组，50μL/只；
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组1：将CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)与香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)组合在一起，一起采用瘤内注射方式给药，CpG寡脱氧核苷酸1，50μg/只，注射香菇多糖，2.6μg/只，一周2次。
(3)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组2：将CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)与香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)组合在一起，一起采用静脉注射方式给药，CpG寡脱氧核苷酸1，5mg/kg，注射香菇多糖，0.26mg/kg，一周2次。
(4)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组3：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸1(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，0.26mg/kg，一周2次。
5、实验方法：
将200μL含有1×106个A20细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，按照上述给药方案给药。其中CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组1、组2、组3给药方式为：待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时，瘤内或静脉注射CpG寡脱氧核苷酸1并瘤内或静脉注射香菇多糖(具体按照试验分组内容)，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
Figure BDA0002338429550000131
Figure BDA0002338429550000141
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸静脉注射β-1，3-葡聚糖(抑瘤率70％)比CpG寡脱氧核苷酸1与香菇多糖一起瘤内(抑瘤率45％)或静脉注射(抑瘤率50％)的抑瘤率大。
实施例7
给药剂量对药效结果的影响
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸3，序列：5‘-gGGGTCGTCGACGAggggG-3’(小写字母代表磷酸二酯键被硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠肉瘤细胞株S180细胞
4、实验分组：
(1)对照组：
生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸3(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，辅料：氯化钠，甘露醇)，2mg/kg，一周3次；
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸3(注射液；辅料：氯化钠)，50μg/只，一周2次外加静脉注射香菇多糖(冻干制剂，辅料：氯化钠，甘露醇)，按照不同剂量给药，一周3次，其剂量比例如下：
Figure BDA0002338429550000151
注：比例计算按照小鼠每只25g算，则1mg/kg剂量，为25ug/只。
5、实验方法：
将200μL含有1×106个S180细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，先提前静脉注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸3，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
分组 CpG寡脱氧核苷酸组：β-1，3-葡聚糖 抑瘤率(％)
1 1:1 78
2 1:0.1 70
3 1:5 72
4 1:0.05 51
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖治疗肿瘤时，其质量比为1：0.1-1：5时联合抑瘤效果较好(抑瘤率70％-78％)，超出范围联合抑瘤效果下降，质量比为1：0.05时抑瘤率为51％。
实施例8
β-1，3-葡聚糖给药方式对药效结果的影响
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸4，序列：5‘-gGGGACGACGICGIGgggGG-’3(小写字母代表磷酸二酯键被硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
HEPES：SIGMA
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠肝癌细胞细胞株H22细胞
4、实验分组
(1)对照组：
生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤旁注射CpG寡脱氧核苷酸4(注射液；辅料：HEPES)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：静脉注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，0.26mg/kg，一周2次。
(2)β-1，3-葡聚糖组：
瘤旁注射CpG寡脱氧核苷酸4(注射液；辅料：HEPES)，50μg/只，一周2次外加不同给药方式注射香菇多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：氯化钠，甘露醇)，0.26mg/kg，一周2次。
分组 香菇多糖给药方式
对照组 静脉注射
β-1，3-葡聚糖组1 肌肉注射
β-1，3-葡聚糖组2 灌胃注射
5、实验方法：
将200μL含有1×106个H22细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，先提前按照上述给药方式给注射香菇多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时瘤旁注射CpG寡脱氧核苷酸4，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
Figure BDA0002338429550000171
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖治疗肿瘤时，β-1，3-葡聚糖采用静脉给药方式给药(抑瘤率70％)抑瘤效果比肌肉注射(抑瘤率67％)和灌胃给药(抑瘤率53％)好。
实施例9
CpG寡脱氧核苷酸给药方式对药效结果的影响
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸5，序列：5’-tctcccagcgtgcgccat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：裂褶菌多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：氯化钠，生产产家：阿拉丁
甘露醇，生产产家：石家庄华旭药业股份有限公司
一水磷酸二氢钠：生产产家：湖南九典制药股份有限公司
磷酸氢二钠：生产产家：湖南九典制药股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、实验分组
(1)对照组：
生理盐水组，50μL/只；
CpG寡脱氧核苷酸组：瘤旁注射CpG寡脱氧核苷酸5(注射液；辅料：磷酸盐)，50μg/只，一周2次；
β-1，3-葡聚糖组：灌胃给药裂褶菌多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，2mg/kg，一周3次。
(2)CpG寡脱氧核苷酸联合β-1，3-葡聚糖组：采用不同给药方式给CpG寡脱氧核苷酸5(注射液；辅料：磷酸盐)，50μg/只，一周2次外加灌胃给药裂褶菌多糖(冻干制剂，生理盐水复溶；辅料：甘露醇，氯化钠)，2mg/kg，一周3次。
Figure BDA0002338429550000181
5、实验方法：
将200μL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，先提前灌胃给药裂褶菌多糖，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时按不同给药方式注射CpG寡脱氧核苷酸5，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
分组 名称 抑瘤率(％)
1 CpG寡脱氧核苷酸瘤旁注射 50
2 CpG寡脱氧核苷酸静脉注射 35
3 CpG寡脱氧核苷酸瘤内注射 55
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：CpG寡脱氧核苷酸瘤内注射(抑瘤率55％)或瘤旁给药(抑瘤率
50％)抑瘤效果大于静脉给药(抑瘤率35％)。
实施例10
1、药物：CpG寡脱氧核苷酸1，序列：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(磷酸二酯键全部硫代磷酸化修饰)，生产厂家：广州锐博生物科技有限公司。β-1，3-葡聚糖：香菇多糖，生产厂家：南京绿叶制药有限公司
辅料：一水磷酸二氢钠：生产产家：湖南九典制药股份有限公司
2、动物：BALB/c小鼠
3、细胞：小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞
4、实验分组：
(1)对照组：生理盐水组，50μL/只
(2)CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖复合物1：静脉注射CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖组合物，CpG寡脱氧核苷酸，5mg/kg，注射香菇多糖，2mg/kg，一周2次。
(3)CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖复合物2：瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖复合物，CpG寡脱氧核苷酸，50μg/只，注射香菇多糖，20μg/只，一周2次。
5、实验方法：
(1)按照实施例1中的方法进行。
(2)对比方法(复合物的制备方法)
组合物制备：将香菇多糖溶解在0.25N NaOH至50mg/ml，并将混合物在室温下静置过夜。将CpG寡脱氧核苷酸1溶解在注射用水中至100mM。将香菇多糖溶液和CpG寡脱氧核苷酸1溶液混合(混合比例为：组合物中CpG：香菇多糖＝5:2)，随后加入与香菇多糖相同体积的330mM NaH2PO4，并将混合物在4℃保持过夜以完成络合。
将200μL含有1×106个CT-26细胞悬液皮下接种于小鼠的右后背，待肿瘤平均体积约100mm3的小鼠时静脉注射组合物1或瘤内注射组合物2，每周测量记录肿瘤大小体积2次。
6、实验结果：
Figure BDA0002338429550000201
注：抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-(给药组小鼠的平均肿瘤体积/生理盐水组小鼠的平均肿瘤体积)
7、结论：CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖组合物1抑瘤率为53％，CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖组合物2的抑瘤率为46％，均小于本发明所述联合给药系统(瘤内注射CpG寡脱氧核苷酸，静脉注射β-1，3-葡聚糖(实施例1))的75％抑瘤率。

Claims (12)

1.一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，包含CpG寡脱氧核苷酸和β-1，3-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，该给药系统的使用方法为先用β-1，3-葡聚糖，再用CpG寡脱氧核苷酸，或者β-1，3-葡聚糖与CpG寡脱氧核苷酸同时用药。
3.根据权利要求2所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的使用方法中，β-1，3-葡聚糖提前0-3周给药。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合药系统，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖使用的给药方式为口服、肌注或全身静脉给药。
5.根据权利要求4所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖使用的给药方式为全身静脉给药。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的CpG寡脱氧核苷酸使用的给药方式为瘤内或瘤旁给药。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖为以β-(1→3)葡聚糖为主链、β-(1→6)葡聚糖为侧链的葡聚糖。
8.根据权利要求7所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖为香菇多糖或裂褶菌多糖。
9.根据权利要求8所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述β-1，3-葡聚糖为香菇多糖。
10.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的CpG寡脱氧核苷酸及β-1，3-葡聚糖为冻干制剂或注射液。
11.根据权利要求1所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，所述的CpG寡脱氧核苷酸与β-1，3-葡聚糖给药剂量比例为1：0.1-1：5，两者的给药频次均为一周2-4次。
12.权利要求1-11任一项所述的一种肿瘤免疫治疗联合给药系统，其特征在于，其用于治疗癌症药物中的应用。
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US20180256630A1 (en) * 2014-12-26 2018-09-13 National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition Use of nucleic acid-polysaccharide complexes having immunopotentiating activity as anti-tumor drug

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