CN113030057B - 一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用，所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测蛋白溶液与染料混合反应，之后经重力柱纯化蛋白柱子过滤，得到带有荧光标记的待测蛋白；(2)将步骤(1)得到的带有荧光标记的待测蛋白稀释并与金纳米粒子溶液混合，之后用MST仪器检测，得到检测结果。本发明提供的检测方法成本低、流程短，检测速度快。
Description
技术领域
本发明属于分析领域，具体涉及一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用，尤其涉及一种检测速度快的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用。
背景技术
纳米颗粒进入人体体液后，会迅速与体液中的蛋白质结合，形成特殊的蛋白冠结构。但同时，这些特殊的蛋白冠的形成会影响纳米粒子在人体中的吸收、分布、代谢、排泄，因此蛋白冠这种结构开始逐渐进入研究者的视野中。
目前，所存在的各种纳米颗粒，可以通过透射电子显微镜来观察形貌的变化；各种表面性质，比如粒径大小和电势可以通过马尔文-纳米粒度分析仪来测量；但是不同表面特性的纳米粒子与蛋白质之间的相互作用的亲和力等指标，仍然缺乏相关研究。
CN101620205B公开了一种联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法，通过将蛋白直接或间接固定在生物相容性磁性纳米材料表面，在液相启动候选配体和参考配体竞争结合达到平衡后，利用磁力回收蛋白-配体复合物，然后变性复合物中蛋白提取所结合配体，用达到所需分辨率和灵敏度的色谱系统分析竞争结合前的样品中和提取的结合配体中候选配体与参考配体的相对峰面积或相对峰高，同时测定各种配体经过磁分离和提取过程后的回收率，在各配体的定量指标显著高于其线性响应截距5倍且处于线性范围内、各配体结合率低于20％的条件下，从而定量测定结合在相同位点候选配体的相对亲和力的方法，可用于未纯化预期配体或组合合成混合物中配体亲和力的测定。
目前对于不同表面特性的纳米粒子与蛋白质之间的相互作用的亲和力尚无一种快速有效的检测方法。因此，如何提供一种快速检测不同表面特性的纳米粒子与蛋白质之间的相互作用的亲和力的方法，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用，尤其提供一种检测速度快的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用。本发明提供的检测方法成本低、流程短，检测速度快。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将待测蛋白溶液与染料混合反应，之后经重力柱纯化蛋白柱子过滤，得到带有荧光标记的待测蛋白；
(2)将步骤(1)得到的带有荧光标记的待测蛋白稀释并与金纳米粒子溶液或纳米材料修饰的金纳米粒子溶液混合，之后用MST仪器(微量热泳动仪)检测，得到检测结果。
上述检测方法利用微量热泳动仪使用红外激光进行局部加热导致分子的定向移动，继而通过荧光分析温度梯度场中分子分布比，并且能够检测到由于结合而引起的生物分子的大小、电荷和水化层的变化，从而获得纳米材料与蛋白质之间的亲和力大小；采用微量热泳动技术，节约了成本，减少了检测流程，同时检测速度快。
优选地，步骤(1)所述待测蛋白溶液的浓度为9-11μM，例如9μM、9.5μM、10μM、10.5μM或11μM等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(1)所述染料与待测蛋白溶液混合前还包括将染料用DMSO溶解，之后与标记缓冲液(labeling buffer)混合。
优选地，步骤(1)所述染料包括NT650-NHS。
步骤(1)所述混合的流程示例性地可以是将10μg固体染料NT650-NHS用30μL100％DMSO充分溶解，其终浓度为470μM，取NT650-NHS(5μL)与标记缓冲液(95μL)混合，再加入100μL待测蛋白溶液混合。
优选地，步骤(2)所述金纳米粒子溶液由包括以下步骤的制备方法制备得到：将氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液混合煮沸搅拌，当溶液变为红宝石色时继续搅拌，得到所述金纳米粒子溶液。
氯金酸的浓度示例性地可以是1mM，柠檬酸钠的浓度示例性地可以是38.8mM，氯金酸与柠檬酸钠的体积比示例性地可以是10:1。
继续搅拌的时间示例性地可以是20min。
优选地，步骤(2)所述纳米材料修饰的金纳米粒子溶液由包括以下步骤的制备方法制备得到：将纳米材料与金纳米粒子溶液混合搅拌，之后离心、去除上清液、洗涤，得到纳米材料修饰的金纳米粒子溶液。
优选地，所述纳米材料包括金纳米粒子或者经过修饰的金纳米粒子，所述经过修饰的金纳米粒子包括Au@PDDAC(聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰金纳米粒子)或Au@PDDAC@PSS(聚苯乙烯磺酸钠修饰金纳米粒子)。
优选地，步骤(2)混合的具体流程包括以下步骤：将金纳米粒子溶液或纳米材料修饰的金纳米粒子溶液稀释为一系列浓度梯度，之后将其分别与带有荧光标记的待测蛋白混合。
其中，稀释的流程示例性地可以是以100nM为起始浓度，以2倍稀释16个浓度梯度，最终浓度为0，总体积为10μL。
作为本发明优选的技术方案，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液混合煮沸搅拌，当溶液变为红宝石色时继续搅拌，得到所述金纳米粒子溶液，之后将纳米材料与金纳米粒子溶液混合搅拌，之后离心、去除上清液、洗涤，得到纳米材料修饰的金纳米粒子溶液；
(2)将待测蛋白溶液与染料混合反应，之后经重力柱纯化蛋白柱子过滤，得到带有荧光标记的待测蛋白；
(3)将步骤(2)得到的带有荧光标记的待测蛋白稀释并与步骤(1)得到的金纳米粒子溶液或纳米材料修饰的金纳米粒子溶液混合，之后用MST仪器检测，得到检测结果。
另一方面，本发明还提供了如上所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法在检测不同表面性质的纳米材料与蛋白质之间的亲和力中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，通过利用微量热泳动仪使用红外激光进行局部加热导致分子的定向移动，继而通过荧光分析温度梯度场中分子分布比，并且能够检测到由于结合而引起的生物分子的大小、电荷和水化层的变化，从而获得纳米材料与蛋白质之间的亲和力大小；采用微量热泳动技术，节约了成本，减少了检测流程，同时检测速度快。
附图说明
图1是实施例1中的AuNP的粒径分布图；
图2是实施例1中的AuNP的形貌图；
图3是实施例1中金纳米粒子与蛋白之间亲和力的检测结果图；
图4是实施例2中的Au@PDDAC的粒径分布图；
图5是实施例2中的Au@PDDAC的形貌图；
图6是实施例2中Au@PDDAC与蛋白之间亲和力的检测结果图；
图7是实施例3中的Au@PDDAC@PSS的粒径分布图；
图8是实施例3中的Au@PDDAC@PSS的形貌图；
图9是实施例3中Au@PDDAC@PSS与蛋白之间亲和力的检测结果图；
图10是实施例1-3中的纳米粒子的电位测量结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，微量热泳动仪器型号为Monolith NT.115(德国慕尼黑NanoTemper技术有限公司)。
实施例1
本实施例提供了一种金纳米粒子与蛋白之间亲和力的检测方法，具体步骤如下：
1、制备带负电荷的金纳米粒子(AuNP)：
(1)将1mL 100mM的HAuCl4(≥99％)加入到已有99mL去离子水的透明三颈烧瓶中，边加热边剧烈搅拌，并用球形冷凝管冷凝回流；
(2)待三颈烧瓶中的溶液沸腾后，迅速倒入10mL 38.8mM柠檬酸钠(美国Sigma-Aldrich)溶液，在5分钟的时间里，溶液颜色由透明变为紫色，再变为红宝石色。
(3)继续煮沸，猛烈搅拌20分钟，之后将得到的AuNP溶液冷却，4℃保存备用，其中得到的AuNP的粒径分布见图1，形貌见图2。
2、测试前的准备：
(1)将人源丛生蛋白(50μg)溶于过0.22μm滤膜的去离子水(100μL)中，得到10μM100μL的人源丛生蛋白水溶液；
(2)将试剂盒中的10μg固体染料NT650-NHS用30μL 100％DMSO充分溶解，其终浓度为470μM
(3)取试剂盒中的染料NT650-NHS(5μL)与labeling buffer(95μL)混合，再加入100μL人源丛生蛋白溶液，充分混匀；
(4)避光，20℃反应30min；
(5)以过0.22μm滤膜的去离子水(500μL)为流动相，通过重力柱纯化蛋白柱子过滤，获得500μL带有荧光标记的人源丛生蛋白溶液，浓度为2μM；
(6)用过0.22μm滤膜的去离子水将带荧光标记的人源丛生蛋白稀释15倍(终浓度133nM)；
3、基于微量热泳动技术检测纳米材料-蛋白质之间亲和力的方法：
(1)将Au纳米粒子水溶液(100nM)以2倍稀释16个浓度梯度，最初浓度为100nM，最终浓度为0，总体积为10μL；
(2)将10μL带荧光标记的人源丛生蛋白溶液(133nM)分别和(1)中的16个浓度按照体积比1:1混合；
(3)使用型号MO-K025毛细管吸取样品，放入MST仪器中进行测量，结果见图3(横坐标为金纳米粒的浓度，纵坐标为标准化的荧光值)。KD值为5.83×10-11。
实施例2
本实施例提供了一种修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵的金纳米粒子与蛋白之间亲和力的检测方法，具体步骤如下：
1、制备带正电荷的Au@PDDAC(修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDAC)，合成Au@PDDAC)：
(1)将1mL 2mg/mL的PDDAC水溶液滴加到盛有5mL 10nM的金纳米颗粒的反应瓶中，并在20℃下搅拌1h。
(2)用高速离心机以9000rpm的转速，离心20min，弃去上清，得到Au@PDDAC。
(3)再用去离子水洗涤三次，除去未反应的、多余的PDDAC，4℃保存备用，其中得到的Au@PDDAC(Au-PDDAC)粒径分布见图4，形貌见图5。
2、测试前的准备：
(1)将人源丛生蛋白(50μg)溶于过0.22μm滤膜的去离子水(100μL)中，得到10μM100μL的人源丛生蛋白水溶液；
(2)将试剂盒中的10μg固体染料NT650-NHS用30μL 100％DMSO充分溶解，其终浓度为470μM
(3)取试剂盒中的染料NT650-NHS(5μL)与labeling buffer(95μL)混合，再加入100μL人源丛生蛋白溶液混合；
(4)避光，20℃反应30min；
(5)以过0.22μm滤膜的去离子水(500μL)为流动相，通过重力柱纯化蛋白柱子过滤，获得500μL带有荧光标记的人源丛生蛋白溶液，浓度为2μM；
(6)用过0.22μm滤膜的去离子水将带荧光标记的人源丛生蛋白稀释15倍(133nM)；
3、基于微量热泳动技术检测纳米材料-蛋白质之间亲和力的方法：
(1)将Au@PDDAC纳米粒子水溶液(100nM)以2倍稀释16个浓度梯度，最初浓度为100nM，最终浓度为0，总体积为10μL；
(2)将10μL带荧光标记的人源丛生蛋白溶液(133nM)分别和步骤(1)中的16个浓度按照体积比1:1混合；
(3)使用型号MO-K025毛细管吸取样品，放入MST仪器中进行测量，结果见图6(横坐标为Au@PDDAC纳米粒子的浓度，纵坐标为标准化的荧光值)。KD值为1.04×10-10。
实施例3
本实施例提供了一种修饰聚苯乙烯磺酸钠的金纳米粒子与蛋白之间亲和力的检测方法，具体步骤如下：
1、制备带负电荷的Au@PDDAC@PSS(修饰聚苯乙烯磺酸钠(PSS)，合成Au@PDDAC@PSS)：
(1)将1mL 2mg/mL的PSS水溶液滴加到盛有5mL 10nM的Au@PDDAC的反应瓶中，并在20℃下搅拌1h。
(2)用高速离心机以9000rpm的转速，离心20min，弃去上清，得到Au@PDDAC@PSS。
(3)再用去离子水洗涤三次，除去未反应的、多余的PSS，4℃保存备用，其中得到的Au@PDDAC@PSS(Au-PDDAC-PSS)的粒径分布见图7，形貌见图8。
2、测试前的准备：
(1)将人源丛生蛋白(50μg)溶于过0.22μm滤膜的去离子水(100μL)中，得到10μM100μL的人源丛生蛋白水溶液；
(2)将试剂盒中的10μg固体染料NT650-NHS用30μL 100％DMSO充分溶解，其终浓度为470μM
(3)取试剂盒中的染料NT650-NHS(5μL)与labeling buffer(95μL)混合，再加入100μL人源丛生蛋白溶液混合；
(4)避光，20℃反应30min；
(5)以过0.22μm滤膜的去离子水(500μL)为流动相，通过重力柱纯化蛋白柱子过滤，获得500μL带有荧光标记的人源丛生蛋白溶液，浓度为2μM；
(6)用过0.22μm滤膜的去离子水将带荧光标记的人源丛生蛋白稀释15倍(133nM)；
3、基于微量热泳动技术检测纳米材料-蛋白质之间亲和力的方法：
(1)将Au@PDDAC@PSS纳米粒子水溶液(100nM)以2倍稀释16个浓度梯度，最初浓度为100nM，最终浓度为0，总体积为10μL；
(2)将10μL带荧光标记的人源丛生蛋白溶液(133nM)分别和步骤(1)中的16个浓度按照体积比1:1混合；
(3)使用型号MO-K025毛细管吸取样品，放入MST仪器中进行测量，结果见图9(横坐标为Au@PDDAC@PSS纳米粒子的浓度，纵坐标为标准化的荧光值)。KD值为4.50×10-10。
测量实施例1-3中得到的纳米粒子的电位，结果见图10。
以上实施例显示本发明提供的检测方法利用微量热泳动技术，通过特定操作步骤方法有效地检测了纳米材料与蛋白之间的亲和力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (9)
1.一种纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）将待测蛋白溶液与染料混合反应，之后经重力柱纯化蛋白柱子过滤，得到带有荧光标记的待测蛋白；
（2）将步骤（1）得到的带有荧光标记的待测蛋白稀释并与纳米材料修饰的金纳米粒子溶液混合，之后用MST仪器检测，得到检测结果；
所述纳米材料包括经过修饰的金纳米粒子，所述经过修饰的金纳米粒子包括Au@PDDAC或Au@PDDAC@PSS。
2.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述待测蛋白溶液的浓度为9-11 μM。
3.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述染料与待测蛋白溶液混合前还包括将染料用DMSO溶解，之后与标记缓冲液混合。
4.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述染料包括NT650-NHS。
5.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述金纳米粒子溶液由包括以下步骤的制备方法制备得到：将氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液混合煮沸搅拌，当溶液变为红宝石色时继续搅拌，得到所述金纳米粒子溶液。
6.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述纳米材料修饰的金纳米粒子溶液由包括以下步骤的制备方法制备得到：将纳米材料与金纳米粒子溶液混合搅拌，之后离心、去除上清液、洗涤，得到纳米材料修饰的金纳米粒子溶液。
7.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，步骤（2）混合的具体流程包括以下步骤：将纳米材料修饰的金纳米粒子溶液稀释为一系列浓度梯度，之后将其分别与带有荧光标记的待测蛋白混合。
8.根据权利要求1所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液混合煮沸搅拌，当溶液变为红宝石色时继续搅拌，得到所述金纳米粒子溶液，之后将纳米材料与金纳米粒子溶液混合搅拌，之后离心、去除上清液、洗涤，得到纳米材料修饰的金纳米粒子溶液；
（2）将待测蛋白溶液与染料混合反应，之后经重力柱纯化蛋白柱子过滤，得到带有荧光标记的待测蛋白；
（3）将步骤（2）得到的带有荧光标记的待测蛋白稀释并与步骤（1）得到的纳米材料修饰的金纳米粒子溶液混合，之后用MST仪器检测，得到检测结果。
9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的纳米材料与蛋白之间亲和力的检测方法在检测不同表面性质的纳米材料与蛋白质之间的亲和力中的应用。
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