CN113029736B - 基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法及装置，该方法包括以下步骤：1)将近红外响应水凝胶均匀平铺在载片上，然后将细胞样本以单层形式平铺到近红外响应水凝胶上；2)通过显微成像系统识别载片上的目标细胞，然后将近红外激光聚焦后照射目标细胞所在区域，使该区域的近红外响应水凝胶因光热效应升温而由固相转换成液相，从而释放目标细胞；3)控制微针运动至目标细胞所在位置，提取目标细胞。本发明将近红外响应水凝胶平铺到载片上，然后单层平铺细胞，形成了可在近红外光照射下释放细胞并进行提取的载片，解决了细胞载片上细胞难以释放提取的难题；本发明能实现目标细胞精准识别、定位、释放以及提取，结构简单，操作方便。

Description

基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法及装置
技术领域
本发明涉及稀有细胞提取领域，特别涉及一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法及装置。
背景技术
稀有细胞是指含量非常稀少但具有重要意义的细胞。在血液中的含量非常少，一般低于100个/mL(血液中红细胞和白细胞分别为109个/mL和106个/mL左右)，但是它们对疾病检测、生殖健康和环境卫生等方面有十分重要的影响。血液中常见稀有细胞有循环肿瘤细胞，母体胎儿细胞、循环内皮细胞、抗原特异性T细胞。例如循环肿瘤细胞提取与分子检测相结合就能实现无创肿瘤诊断，在肿瘤早期发现，手术治疗方案确定以及术后预后均有重要作用；母体胎儿细胞的提取与全基因组测序相结合，就能实现无创产前诊断，彻底避免有创产检带来的风险。目前稀有细胞捕获均是基于特异性抗体识别进行捕获，容易导致稀有细胞的遗漏和非目标细胞的误捕获。
由于稀有细胞的稀有性，常用细胞计数方法(如血球仪等)的有效检测底限一般在104个/mL左右，无法对稀有细胞进行快速、有效的检测。针对上述问题，国内外的科学家均开展了一系列来针对稀有细胞进行富集和分离。2000年，Vona等报道了一种依据细胞大小，通过过滤直接富集上皮性肿瘤细胞的方法。由强生公司子公司Veridex研发的Cell Search系统是全球第一个经过FDA(2004年获批)和CFDA(2012年获批)批准用于检测CTC的商业化产品。2007年，美国麻省总医院癌症中心与强生公司合作，研发出一种能检测出极微量CTC的微流体硅芯片，称为CTC-Chip，至2013年已经开发完成第三代。Vortex Biosciences公司利用微流体技术捕获血液中检测循环肿瘤细胞(CTCs)来辅助大肠癌和前列腺癌的治疗。上述方法都是基于细胞表面特定抗原进行捕获、识别，存在目标细胞的遗漏、以及非目标细胞的吸附等问题，导致目标细胞提取不纯。
近红外光(NIR)具有波长较长、穿透性强、较强的光热效应的优点，由于红外线发射的强度与物体的温度有关还可以进行红外成像。因此，具有近红外光响应的水凝胶不仅可以利用近红外光对水凝胶的药物释放性质进行调控，或者利用其光热性质来直接消除肿瘤。目前，研究报道的具有近红外光响应的水凝胶主要为一类包含有光热性质的贵金属纳米颗粒(例如铂纳米粒子)的水凝胶{Biomaterials 2016,104,129-137}。近红外光响应的水凝胶有望应用于稀有细胞的提取，但现在未见公开可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法及装置。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，包括以下步骤：
1)将近红外响应水凝胶均匀平铺在载片上，然后将细胞样本以单层形式平铺到近红外响应水凝胶上，通过近红外响应水凝胶固定细胞样本；
2)通过显微成像系统识别载片上的目标细胞，然后将近红外激光聚焦后照射目标细胞所在区域，使该区域的近红外响应水凝胶因光热效应升温而由固相转换成液相，从而释放目标细胞；
3)控制用于提取单细胞的微针运动至目标细胞所在位置，提取目标细胞。
优选的是，所述近红外响应水凝胶包括光热材料和温敏水凝胶，通过光热材料将近红外激光的光照转换为热量，达到温敏水凝胶的相转变温度后，近红外响应水凝胶会由固相转换成液相。
本发明还提供一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置，其采用如上所述的方法，该装置包括：载片、显微成像系统、测距仪以及单细胞提取系统。
优选的是，所述单细胞提取系统包括液路控制器、与所述液路控制器连接的用于吸取单细胞的微针以及用于实现所述微针的三维移动的三维运动平台。
优选的是，所述显微成像系统包括近红外激光光源、准直镜、第一会聚镜、明场光源、科勒镜、二向色镜、载物台、显微物镜、反射镜、第二会聚镜以及成像探测器；
所述载物台用于放置所述载片，且所述载物台具备二维移动功能。
优选的是，该基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置的工作步骤包括：
Ⅰ、预先将所述近红外响应水凝胶均匀平铺在所述载片上，常温下水凝胶变成固相后，将细胞样本以单层形式平铺到近红外响应水凝胶上，然后将载片放置到载物台上；
Ⅱ、打开所述明场光源，所述明场光源发出的照明光经过所述科勒镜匀光后透射所述二向色镜，照射到处于所述载物台上的载片上，透光载片后的照明光由所述显微物镜收集后再经所述反射镜反射后，被所述第二会聚镜会聚至所述成像探测器上，实现全载片成像，根据获得的全载片图像识别出载片上的目标细胞；
Ⅲ、打开所述近红外激光光源，所述近红外激光光源发出的激光经过所述准直镜准直、第一会聚镜会聚后被所述二向色镜反射至处于所述载物台上的载片上，通过载物台带动载片进行二维移动使得目标细胞移动到激光照射区域，经激光照射后，目标细胞所处区域的近红外响应水凝胶升温而由固相转换成液相，释放出目标细胞；
Ⅳ、通过所述三维运动平台将所述微针的针头移动到目标细胞位置，通过液路控制器使微针的针头产生吸力作用，从而利用微针提取出目标细胞。
优选的是，所述步骤Ⅰ中，获得全载片图像后，通过目标细胞的几何形状、尺寸、细胞核位置的信息进行目标细胞识别。
优选的是，所述步骤Ⅲ中，所述测距仪利用所述近红外激光光源发出的激光通过激光三角测量法测量微针与目标细胞的垂直距离，通过显微成像系统获得的全载片图像计算得到微针与目标细胞的水平距离；然后再根据垂直距离和水平距离的信息，通过所述三维运动平台将所述微针的针头移动到目标细胞位置。
优选的是，所述近红外激光光源发出的激光的波长在所述近红外响应水凝胶的响应波长的范围内。
优选的是，平铺在所述载片上的所述近红外响应水凝胶的厚度为200μm。
本发明的有益效果是：
1、本发明将近红外响应水凝胶平铺到载片上，然后单层形式平铺细胞，形成了可在近红外光照射下释放细胞并进行提取的载片，解决了细胞载片上细胞难以释放提取的难题；
2、本发明将近红外激光聚焦技术和倒置显微成像技术相结合，能够实现目标细胞精准识别、定位、释放以及提取，结构简单，操作方便。
3、本发明的近红外激光光源既用于实现细胞释放，又能用于进行激光三角法测距，通过复用近红外激光光源，优化了结构设计，降低了装置成本。
附图说明
图1为本发明的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置的结构示意图；
图2为本发明的近红外响应水凝胶和细胞在载片上的铺设示意图；
图3为本发明的载片上的目标细胞释放的示意图；
图4为本发明的一种实施例中的凝胶的图片；
图5为本发明的一种实施例中近红外响应水凝胶被激光照射后转变为液相的结果；
图6为本发明的一种实施例中测距仪进行目标细胞的垂直位置测量的原理示意图；
图7为本发明的一种实施例中的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置的工作流程图。
附图标记说明：
近红外激光光源1、准直镜2、第一会聚镜3、明场光源4、科勒镜5、二向色镜6、测距仪7、微针8、三维运动平台9、液路控制器10、载片11、载物台12、显微物镜13、反射镜14、第二会聚镜15、成像探测器16、近红外响应水凝胶1101、细胞1102、近红外激光1103。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例提供一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，包括以下步骤：
1)将近红外响应水凝胶1101均匀平铺在载片11上，然后将细胞样本1102以单层形式平铺到近红外响应水凝胶1101上，通过近红外响应水凝胶1101固定细胞样本；参照图2；
2)通过显微成像系统识别载片11上的目标细胞，然后将近红外激光1103聚焦后照射目标细胞所在区域，使该区域的近红外响应水凝胶1101因光热效应升温而由固相转换成液相，从而释放目标细胞；参照图3；
3)控制用于提取单细胞的微针8运动至目标细胞所在位置，提取目标细胞。
其中，近红外响应水凝胶包括光热材料和温敏水凝胶，通过光热材料将近红外激光的光照转换为热量，达到温敏水凝胶的相转变温度后，近红外响应水凝胶会由固相转换成液相，从而可以通过激光照射特定区域实现该区域的目标细胞释放。例如，在一种可选的实施例中，光热材料可选用Ti3C2Tx金属碳氮化物，Ti3C2Tx作为MXene二维材料家族的一员，具有突出的光热性能，在808nm近红外光的照射下可达到30％的光热转换效率，且具备优异的热稳定性，是构建近红外响应水凝胶的理想光热材料。温敏水凝胶可选择明胶，明胶是由胶原蛋白部分水解衍生而来的天然大分子材料，具有良好的生物相容性并在一定程度上保留了胶原蛋白的氨基酸序列，可以促进细胞粘附。
在一种可选的实施例中，通过显微成像系统识别载片11上的目标细胞的方法为：利用显微成像系统实现载片11整体成像，获得全载片11图像后，通过目标细胞的几何形状、尺寸、细胞核位置的等信息精准识别出目标细胞。
在一种可选的实施例中，微针8是通过吸力作用吸取目标细胞(微针8与液路系统连接，通过液路控制产生吸力)，微针8针头的口径根据目标细胞尺寸进行选取，在一种实施例中针头口径为50μm。
实施例2
本实施例提供一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置，其采用实施例1的方法进行单细胞提取，该装置包括：载片11、显微成像系统、测距仪7以及单细胞提取系统。
其中，单细胞提取系统包括液路控制器10(优选为精密液路控制器10)、与液路控制器10连接的用于吸取单细胞的微针8以及用于实现微针8的三维移动的三维运动平台9。微针8的针头具有一定直径的针孔，液路控制器10通过液路控制能使微针8的针头产生吸力从而吸取细胞，针孔的口径根据目标细胞尺寸进行选取。
其中，显微成像系统包括近红外激光光源1、准直镜2、第一会聚镜3、明场光源4、科勒镜5、二向色镜6、载物台12、显微物镜13、反射镜14、第二会聚镜15以及成像探测器16；载物台12用于放置载片11，且载物台12具备二维移动功能。
其中，近红外激光光源1发出的激光的波长在近红外响应水凝胶的响应波长的范围内，即近红外激光光源1发出的激光需保证可使近红外响应水凝胶因光热效应而发生相转变。在一种优选的实施例中，近红外激光光源1发出的激光的波长为808nm。
其中，二向色镜6对长波长的光反射、短波长的光透射，二向色镜6反射会近红外激光光源1发出的激光，而透射明场光源4发出的照明光。在一种优选的实施例中，二向色镜6反射720nm以上波长的光，透射720nm以下波长的光。
参照图7，本实施例中，该基于近红外响应水凝胶的单细胞提取装置的工作步骤包括：
Ⅰ、预先将近红外响应水凝胶均匀平铺在载片11上，常温下水凝胶变成固相后，将细胞样本以单层形式平铺到近红外响应水凝胶上(厚度优选为200μm，参照图4为一种实施例中的凝胶的图片)，然后将载片11放置到载物台12上。
Ⅱ、打开明场光源4，进行明场成像：明场光源4发出的照明光经过科勒镜5匀光后透射二向色镜6，照射到处于载物台12上的载片11上，透光载片11后的照明光由显微物镜13收集后再经反射镜14反射后，被第二会聚镜15会聚至成像探测器16上，配合载物台12的二维移动，直至实现全载片11成像，根据获得的全载片11图像识别出载片11上的目标细胞；
在优选的实施例中，目标细胞的识别方法为：获得全载片11图像后，通过目标细胞的几何形状、尺寸、细胞核位置的信息进行目标细胞识别。
Ⅲ、打开近红外激光光源1，近红外激光光源1发出的激光经过准直镜2准直、第一会聚镜3会聚后被二向色镜6反射至处于载物台12上的载片11上，通过载物台12带动载片11进行二维移动使得目标细胞移动到激光照射区域(激光经过准直镜2准直、第一会聚镜3会聚后形成一定大小的激光照射区域，即光斑，光斑直径优选小于200微米，以确保细胞释放精度)，经激光照射后，目标细胞所处区域的近红外响应水凝胶升温而由固相转换成液相，释放出目标细胞；例如激光照射1分钟，然后关闭近红外激光光源1，打开明场光源4，以观察目标细胞是否释放，若是则进行下一步，否则延长激光照射时间。参照图5，为一种实施例中，近红外响应水凝胶被激光照射后转变为液相的结果，图中D为转换成液相区域的直径。
Ⅳ、通过三维运动平台9将微针8的针头精确移动到目标细胞位置，通过液路控制器10使微针8的针头产生吸力作用，从而利用微针8精准提取出目标细胞；
其中，参照图6，测距仪7利用近红外激光光源1发出的激光通过激光三角测量法测量微针与目标细胞的垂直距离，通过显微成像系统获得的全载片11图像计算得到微针与目标细胞的水平距离；然后再根据微针与目标细胞的垂直距离和水平距离的信息，通过三维运动平台9将微针8的针头移动到目标细胞位置。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，该方法采用以下装置进行单细胞提取，该装置包括：载片、显微成像系统、测距仪以及单细胞提取系统；
所述单细胞提取系统包括液路控制器、与所述液路控制器连接的用于吸取单细胞的微针以及用于实现所述微针的三维移动的三维运动平台；
所述显微成像系统包括近红外激光光源、准直镜、第一会聚镜、明场光源、科勒镜、二向色镜、载物台、显微物镜、反射镜、第二会聚镜以及成像探测器；
所述载物台用于放置所述载片，且所述载物台具备二维移动功能；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：
Ⅰ、预先将所述近红外响应水凝胶均匀平铺在所述载片上，常温下水凝胶变成固相后，将细胞样本以单层形式平铺到近红外响应水凝胶上，然后将载片放置到载物台上；
Ⅱ、打开所述明场光源，所述明场光源发出的照明光经过所述科勒镜匀光后透射所述二向色镜，照射到处于所述载物台上的载片上，透光载片后的照明光由所述显微物镜收集后再经所述反射镜反射后，被所述第二会聚镜会聚至所述成像探测器上，实现全载片成像，根据获得的全载片图像识别出载片上的目标细胞；
Ⅲ、打开所述近红外激光光源，所述近红外激光光源发出的激光经过所述准直镜准直、第一会聚镜会聚后被所述二向色镜反射至处于所述载物台上的载片上，通过载物台带动载片进行二维移动使得目标细胞移动到激光照射区域，经激光照射后，目标细胞所处区域的近红外响应水凝胶升温而由固相转换成液相，释放出目标细胞；
Ⅳ、通过所述三维运动平台将所述微针的针头移动到目标细胞位置，通过液路控制器使微针的针头产生吸力作用，从而利用微针提取出目标细胞。
2.根据权利要求1所述的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，其特征在于，所述近红外响应水凝胶包括光热材料和温敏水凝胶，通过光热材料将近红外激光的光照转换为热量，达到温敏水凝胶的相转变温度后，近红外响应水凝胶会由固相转换成液相。
3.根据权利要求1所述的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，其特征在于，所述步骤Ⅰ中，获得全载片图像后，通过目标细胞的几何形状、尺寸、细胞核位置的信息进行目标细胞识别。
4.根据权利要求1所述的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，其特征在于，所述步骤Ⅲ中，所述测距仪利用所述近红外激光光源发出的激光通过激光三角测量法测量微针与目标细胞的垂直距离，通过显微成像系统获得的全载片图像计算得到微针与目标细胞的水平距离；然后再根据垂直距离和水平距离的信息，通过所述三维运动平台将所述微针的针头移动到目标细胞位置。
5.根据权利要求1所述的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，其特征在于，所述近红外激光光源发出的激光的波长在所述近红外响应水凝胶的响应波长的范围内。
6.根据权利要求1所述的基于近红外响应水凝胶的单细胞提取方法，其特征在于，平铺在所述载片上的所述近红外响应水凝胶的厚度为200μm。
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