CN113025742B - 一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术与分子生物学技术领域，具体涉及一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。本发明提供的鉴定方法主要包括如下过程：从样本中提取全基因组DNA；以DNA样本为模板，扩增含有ITS2序列的片段，并对其进行HRM‑PCR分析；通过ITS2‑HRM曲线的差异区分药材布渣叶和海南破布叶。本发明提供的方法操作简单，实现了药材布渣叶与混淆品海南破布叶的准确、高效、快速鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与分子生物学技术领域，具体涉及一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。
背景技术
布渣叶药材为椴树科植物破布叶(Microcos paniculata L.)的干燥叶，又名蓑衣子、破布叶、麻布叶等。主产于广东、广西、海南、云南等省。2020年版《中国药典》记载布渣叶性微酸，凉。归脾、胃经。具有消食化滞，清热利湿之功效。用于饮食积滞，感冒发热，湿热黄疸。现代研究表明布渣叶富含异鼠李黄素、山柰黄素、槲皮黄素等多种黄酮类活性成分。具有解热、镇痛、退黄、降血脂、抗炎和保护心血管等作用。同时布渣叶为药食同源药材，常用于清热类中成药和广东凉茶等。海南破布叶(Microcos chungii(Merr.)Chun)为椴树科破布叶属植物，广泛应用于家具、器具等用材，未作为药用植物。
布渣叶药材在我国尤其是岭南地区为常用中草药。海南破布叶与布渣叶的基原植物同为椴树科破布叶属植物，形态相似，不易识别。因此，有些地区常出现海南破布叶被当作布渣叶药材混用的现象。然而，海南破布叶未被列为药用植物，药材药性、功效均未知，两者混淆使用给临床用药造成了潜在威胁。因海南破布叶充当布渣叶药材，均使用相同的组织部位(叶)，依赖传统的形态、显微方法不易准确地鉴定。
现有技术中，有研究人员采用DNA条形码技术建立了布渣叶的特征核苷酸序列，为布渣叶的鉴定提供了依据(汤欢等人，凉茶药材布渣叶及其混伪品的DNA条形码鉴定.中国药学杂志,2015年17期)。但是，并未见到应用该方法针对药材布渣叶与其混伪品的其他分子鉴定研究，而迄今为止亦未发现任何药材布渣叶与海南破布叶的HRM结合DNA条形码鉴定方法的报道。
因此，亟待寻找一种准确、高效、快捷、可视化的方法来鉴定药材布渣叶与海南破布叶。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。本发明提供的方法操作过程简单，实现了药材布渣叶与混淆品海南破布叶的准确、高效、快速鉴定。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鉴定药材布渣叶或其基原植物或植物海南破布叶的方法，其包括如下步骤：
S1、根据提供的药材样本或植物样本，提取样本中的DNA，获得样本中的全基因组DNA；
S2、以步骤S1获得的样本中的全基因组DNA为模板，经HRM-PCR扩增，获得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物；
S3、对步骤S2所得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物进行HRM曲线比对分析，即可。
优选地，所述药材布渣叶的基原植物为破布叶。
优选地，步骤S2所述的HRM-PCR扩增时反应体系共配制25μL，包含2×HRM-PCRMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加灭菌双蒸水至25μL；扩增程序为94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；HRM 2s 75-95℃。
优选地，步骤S2所述HRM-PCR扩增时，采用的引物为ITS2，其上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。
5’-YGACTCTCGGCAACGGATA-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA-3’(SEQ ID NO.2)；
其中，Y代表碱基C/T，R代表碱基A/G。
优选地，步骤S2所述完整的布渣叶及其基原植物ITS2基因间隔区的主导单倍型序列信息如SEQ ID NO.3所示。
CGCATCGTCGCCCCCCACGCCCCCGAGCCCGCGGGGCTCGCGGACGAGTCGGGCGGAGAATGGCCTCCCGTGAGCCGACGCTCGCGGTCGGCCCAAAAAGCCGGTCCCCGGCGACAAGAGCGCCACGGCTGTCGGTGGTAACGCTGCAAGCGCCCCTCGGAGCCTGTCGTGCGCGCCCTCGTCCGGGCGGACCCCATCGAAAGACCCTAGCGCGTCGCTCGGTCGACGCTCGCGTCG(SEQ ID NO.3)；
布渣叶及其基原植物ITS2基因间隔区有11个变异位点，分别为31、160、190位点G-A变异，47位点A-C变异，75、89位点C-G变异，102位点C-A变异，119位点A-G变异，165位点T-G变异，174位点C-T变异，221位点G-T变异。
步骤S2所述完整的海南破布叶ITS2基因间隔区的主导单倍型序列信息如SEQ IDNO.4所示。
CGCATCGTCGCCCCCCACGCCTCCGAGCCCTCGAGGCTCAAGGTTGCATCGGGCGGAGAATGGCCTCCCGTGCGCTAACGCTCGCGGTTGGCCCAAAAAGCCAGTCCCCGGCGATCGGAGCGCCACGACCATCGGTGGTAATGCTACCCGGCCCGTCGTGCGCGCCCCTCGTCCGGGCGAACCCCACGGAAAGACCCTGACGCTCGCACCG(SEQ IDNO.4)；
本发明还提供了一种利用所述的方法在区分药材布渣叶或其基原植物与海南破布叶中的应用。
本发明还提供了一种利用所述的方法在鉴定药材布渣叶或其基原植物中是否掺杂有海南破布叶的应用。
一种用于鉴定布渣叶和/或海南破布叶的试剂盒，包含如SEQ ID NO.1及SEQ IDNO.2所述的引物对。
优选地，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、水、缓冲液、染料、使用说明书、包装和容器中的一种或几种。
在本发明公开的方法中，只要能够将样本中的DNA提取出来，并且所提取的DNA能用于PCR扩增(优选ITS2序列的扩增)，任何方法都是可行的。因此，在一些实施方式中，可以使用任何适当的现有方法甚至未来的方法提取样本中的DNA。
在一些实施方式中，对于提取获得的DNA需要事先进行扩增，以便于随后的HRM-PCR操作。鉴于此，技术人员可以选择任何适当的扩增方法对DNA进行扩增，包括但不限于PCR(聚合酶链式反应)。
当然，本公开的方法并不排除这种情形：即便不需要对DNA事先进行扩增，也能够实现对基因组DNA特定区域进行测序的情况下，扩增步骤是可以省去的。
核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)是真核生物核糖体RNA基因非转录区的一部分，包括ITS1和ITS2两个不同的非编码区域。本申请人发现ITS2区域的核苷酸序列较短，具有极大的保守性，但又在物种水平上变异较快具有特异性。因此，在一些实施方式中，被扩增的区域需要覆盖完整的ITS2基因间隔区。因此，本公开的方法对引物没有特殊的要求，只要使得扩增产物覆盖完整ITS2基因间隔区即可。在本公开的启示下，技术人员可以设计合适的引物进行扩增。
在本发明的具体实施方式中，分别以药材布渣叶、海南破布叶为样本，采用本发明所述方法进行鉴定，将获得的ITS2基因间隔区的HRM曲线与curve 1和curve 2曲线进行比对：当ITS2基因间隔区的HRM曲线与curve 1所示曲线相同，则鉴定所述药材为药材布渣叶，所述植物为药材布渣叶的基原植物；当HRM曲线与curve 2所示曲线相同，则鉴定所述植物为海南破布叶(Microcos chungii(Merr.)Chun)。同时，在用于鉴定药材布渣叶或其基原植物中是否掺杂有海南破布叶时，扩增产物的HRM曲线中存在curve 2所示曲线，则鉴定所述药材布渣叶中掺杂有海南破布叶，所述药材布渣叶基原植物中掺杂有海南破布叶。
在一些实施方式中，将获得的ITS2基因间隔区的HRM曲线分别与选自如下一条或两条的曲线进行比对：curve 1和curve 2。在本发明公开的上下文中，任何可行的方法均可以用来进行HRM曲线的比对。在一些实施方式中，采用公知的比对算法和软件进行曲线比对。本发明对于比对方法没有特殊的要求，任何能够确定两个或多个HRM曲线之间的相似性的方法都适用。
另一方面，本发明提供ITS2基因间隔区在鉴定药材布渣叶或其基原植物中的用途。在具体的实施方式中，所述药材布渣叶的基原植物是破布叶Microcos paniculata L.。在具体的实施方式中，所述ITS2基因间隔区的HRM曲线如curve1所示。
另一方面，本发明提供ITS2基因间隔区在鉴定伪品药材海南破布叶或其基原植物中的用途。在具体的实施方式中，所述植物是海南破布叶Microcos chungii(Merr.)Chun。在具体的实施方式中，所述ITS2基因间隔区的HRM曲线如curve2所示。
另一方面，本发明提供ITS2基因间隔区在区分药材布渣叶和海南破布叶中的用途；或者ITS2基因间隔区在区分药材布渣叶基原植物和海南破布叶中的用途。
另一方面，本发明提供ITS2基因间隔区在区分破布叶Microcos paniculata L.和海南破布叶Microcos chungii(Merr.)Chun中的用途。
在本发明上下文中，药材是指生药。在本发明所属领域中，药材尤指是中药材。就本公开而言，药材尤其是指来自基原植物的中药材；即来自基原植物的纯天然未经过加工或者未经过炮制的中药原料。
在本发明上下文中，基原植物是指药材所属药用植物的物种。
当没有明确指明术语指的是药材还是基原植物时，术语“布渣叶”意图包括布渣叶药材和布渣叶的基原植物两层含义。术语“海南破布叶”意图海南破布叶的基原植物两层含义。
与现有技术相比，本发明提供的方法可以实现药材布渣叶与混淆品海南破布叶的准确、高效、快速鉴定与分离；且适用性广泛，能检测所有能获知ITS2-HRM曲线的的布渣叶与海南破布叶的样本，包括药材、生饮片、粉末等，实现布渣叶和海南破布叶及其它混淆、混伪品的准确、快速、稳定鉴定。
附图说明
图1为采用ITS2序列通用引物结合HRM技术对布渣叶和海南破布叶的归一化熔解曲线图；
图2为采用ITS2序列通用引物结合HRM技术对布渣叶和海南破布叶的衍生熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1药材布渣叶与海南破布叶的基原植物鉴定
样本获得：收集不同产地的布渣叶基原植物和药材样本共13份，海南破布叶基原植物样本共6份(详见表1)。
| 序号 | 样本编号 | 样本名称 | 采样部位 | 样本来源 |
| 1 | BZY1 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 河北安国 |
| 2 | BZY2 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 河北安国 |
| 3 | BZY3 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 安徽亳州 |
| 4 | BZY4 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 安徽亳州 |
| 5 | BZY5 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 江西樟树 |
| 6 | BZY6 | 布渣叶<sup>b</sup> | 叶片 | 江西樟树 |
| 7 | TH10 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南万宁 |
| 8 | TH11 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 广东阳江 |
| 9 | TH12 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 广东茂名 |
| 10 | TH13 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南万宁 |
| 11 | TH14 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南乐东 |
| 12 | TH15 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 广东广州 |
| 13 | TH16 | 布渣叶<sup>a</sup> | 叶片 | 广东湛江 |
| 14 | HNB1 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南万宁 |
| 15 | HNB2 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南万宁 |
| 16 | HNB3 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南五指山 |
| 17 | HNB4 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南乐东 |
| 18 | HNB5 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南保亭 |
| 19 | HNB6 | 海南破布叶<sup>a</sup> | 叶片 | 海南陵水 |
备注：a表示样本为基原植物，b表示样本为药材。
DNA样本提取：所有样本低温烘干(例如40℃)，分别取干燥叶片约30mg用高通量组织研磨仪(宁波新芝)以50Hz研磨120s，用植物基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#DP3112，Bioteke Corporation)提取总DNA。
PCR扩增：用于PCR扩增的引物为ITS2，其上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；用于扩增的引物由生工生物工程公司有限公司(北京)合成，引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol/μL。
PCR反应体系共25μL：2×HRM-PCR Master Mix 12.5μL，正反向引物各1μL，DNA模版1μL(40～60ng)，加灭菌双蒸水至25μL。
HRM-PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；HRM 2s75-95℃(0.1or 0.15℃increments)。HRM-PCR扩增反应结束后，在Rotor Gene Q系统上进行HRM曲线分析，结果如图1所示，图1中，curve1:布渣叶和破布叶；curve 2:海南破布叶。
数据分析：高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting curve,简称HRM)分析采用QIAGEN Co.,Ltd Rotor-Gene Q(version 2.3.1.49)软件进行。标准化的随温度变化的熔解曲线(normalized and shifted melting curve)可以展示分型间的差异，结果如图1所示，也可派生出其他曲线形式(normalized and temp-shifted difference plot)，如图2所示，图2中参考基因型选取布渣叶为基。curve 1:布渣叶和破布叶；curve 2:海南破布叶；将其间差异进行放大，更方便观察物种间的差别。
最后应当说明的是，上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州王老吉大健康产业有限公司、中国中医科学院中药研究所
<120> 一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法
<130> 2021.3.11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> ITS2-F
<400> 1
ygactctcgg caacggata 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ITS2-R
<400> 2
rgtttctttt cctccgctta 20
<210> 3
<211> 237
<212> DNA
<213> 布渣叶及其基原植物ITS2基因间隔区的主导单倍型序列(The DominantHaplotype Sequences of the ITS2 Gene Interval Region of Cloth residue Leafand Its Primitive Plant)
<400> 3
cgcatcgtcg ccccccacgc ccccgagccc gcggggctcg cggacgagtc gggcggagaa 60
tggcctcccg tgagccgacg ctcgcggtcg gcccaaaaag ccggtccccg gcgacaagag 120
cgccacggct gtcggtggta acgctgcaag cgcccctcgg agcctgtcgt gcgcgccctc 180
gtccgggcgg accccatcga aagaccctag cgcgtcgctc ggtcgacgct cgcgtcg 237
<210> 4
<211> 211
<212> DNA
<213> 海南破布叶ITS2基因间隔区的主导单倍型序列(The Dominant HaplotypeSequences of the ITS2 Intergenic Region in Hainan Rag Leaf)
<400> 4
cgcatcgtcg ccccccacgc ctccgagccc tcgaggctca aggttgcatc gggcggagaa 60
tggcctcccg tgcgctaacg ctcgcggttg gcccaaaaag ccagtccccg gcgatcggag 120
cgccacgacc atcggtggta atgctacccg gcccgtcgtg cgcgcccctc gtccgggcga 180
accccacgga aagaccctga cgctcgcacc g 211
Claims (3)
1.一种鉴定药材布渣叶和植物海南破布叶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、根据提供的药材布渣叶和植物海南破布叶样本，提取样本中的DNA，获得样本中的全基因组DNA；
S2、以步骤S1获得的样本中的全基因组DNA为模板，经HRM-PCR扩增，获得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物；
S3、对步骤S2所得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物进行HRM曲线比对分析，即可；步骤S2所述的HRM-PCR扩增时反应体系共配制25μL，包含2×HRM-PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加灭菌双蒸水至25μL；扩增程序为94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；HRM 2s 75-95℃；步骤S2所述HRM-PCR扩增时，采用的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL；步骤S2所述完整的ITS2基因间隔区的序列信息如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
2.一种利用权利要求1所述的方法在区分药材布渣叶与海南破布叶中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的方法在鉴定药材布渣叶中是否掺杂有海南破布叶的应用。
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| 不同地理居群破布叶的psbA-trnH和ITS2序列及其聚类分析;林爽等;《中草药》;20170412;第48卷(第07期);第1403-1408 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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