CN113025704A - 诊治心肌梗死的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了诊治心肌梗死的生物标志物，所述的生物标志物包括LINC00997和/或HAUS3。本发明公开了检测LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的试剂在制备诊断心肌梗死的产品中的应用。本发明还公开了一种筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物的方法。

Description

诊治心肌梗死的生物标志物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及诊治心肌梗死的生物标志物。
背景技术
心肌梗死是全球发病率和死亡率最高的心血管急症，是由于持续的严重缺血导致的心肌组织坏死。及时、准确的诊断可以提高心梗患者的生存率并能够改善长期预后。肌钙蛋白I(c TnI)是目前在临床实践中广泛使用的诊断心肌梗死的生物学标志物，但血浆cTnI浓度可能在某些心脏和非心脏疾病如严重的心力衰竭、心房颤动、慢性肾脏病、严重败血症和感染性休克等情况下假性升高，因此，寻找能够诊断心肌梗死并有较高敏感性及特异性的新的生物标志物很有必要。
非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)是基因组中一类不被翻译成蛋白质的RNA，短的只有二十几个核苷酸，长的可以达到几千个核苷酸，这些RNA分子结构中均缺乏开放阅读框。人类基因组中超过98％的基因为非编码RNA，它们与编码蛋白质的基因之间存在着竞争关系，组成了细胞中复杂的RNA调控网络，可能有着重要的生物学作用。近10年来，越来越多的ncRNAs逐渐地被发现，其中的一些在基因调控网络中发挥了重要作用。随着对于ncRNAs研究的深入，越来越多的研究证据表明，不编码蛋白质的RNA同样在各种生物进程中发挥着重要的作用：不仅参与机体正常的生长发育和生理过程，而且参与了多种疾病的病理过程。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNAs)是一类大于200个核苷酸的非编码RNA，它不编码蛋白质。Lnc RNAs与mRNA类似，与mRNA唯一的区别是缺乏蛋白质编码的开放阅读框。Lnc RNAs以往被认为是“基因翻译的噪音”，认为是RNA聚合酶II转录的副产物，没有具体的生物学功能。随着DNA测序技术的发展，全基因组转录体的研究表明，超过98％的人类的基因不编码蛋白质。Lnc RNAs在多种的生物进程中发挥调控作用，近年来逐渐成为研究的热点。寻找可应用于心肌梗死诊断的lnc RNAs，有望提供一种诊断心肌梗死的新方法，早诊断，早治疗，提高心肌梗死患者的生存率。
发明内容
本发明的目的在于提供用于诊治心肌梗死的生物标志物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种试剂，所述的试剂可以检测LINC00997和/或HAUS3基因表达水平。
所述的“LINC00997”是指Gene ID为401321的基因。
所述的“HAUS3”是指Gene ID为79441的基因。
进一步，所述的试剂包括引物、探针、抗体。
本文使用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述“引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但它不引起与靶基因序列不一致或互补的非靶序列的扩增。
本文使用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针都可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白、RNA或DNA，最优选PNA。具体地，所述探针是一种生物材料，其可以来自有机体或可以体外合成、或是其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、DNA或RNA。DNA可包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸。同样地，基因组RNA、mRNA和寡核苷酸可落入RNA的范围内。蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。
本文使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原以引发抗原-抗体反应的物质。出于本公开内容的目的，术语“抗体”意指特异性结合至HAUS3蛋白的抗体。落入本公开内容的抗体的范围的是多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。使用本领域熟知的技术可容易地制备这些抗体。此外，可用于本公开内容的抗体可以是由两条全长轻链和两条全长重链组成的完整抗体、或是完整抗体分子的功能片段。术语抗体分子的“功能片段”意指保留抗体结合功能的片段，例如Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。
本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明所述的试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白芯片试剂盒或MRM(多反应监测)试剂盒。
例如，所述的试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10至39bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物。此外，所述RT-PCR试剂盒可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水。
此外，本公开内容的试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA试剂盒可包含特异性针对蛋白的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述ELISA试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。
本发明第三方面提供了一种芯片，所述的芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明第四方面提供了一种组合物，所述的组合物包括抑制LINC00997和/或HAUS3表达的试剂。
进一步，所述的组合物还包括与所述试剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
短语“药学上可接受的载体”是本领域认可的并且包括例如参与从身体的一个器官或部分携带或运输任何主题组合物至身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须在与主题组合物的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对患者无害。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无热原的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其他无毒的相容物质。
本发明第五方面提供了一种筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物的方法，所述的方法包括如下步骤：
用待筛选物质处理表达或含有LINC00997和/或HAUS3的体系；检测所述体系中LINC00997和/或HAUS3的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC00997和/或HAUS3的表达，则表明该候选物质是预防或治疗心肌梗死的候选药物。
术语“治疗”是本领域公知的，并且包括预防疾病、失调或病症在可能有出现疾病、失调和/或病症的倾向但还没有被诊断患有所述疾病、失调和/或病症的动物中发生；抑制疾病、失调或病症，例如，阻碍其进展；并缓解疾病、失调或病症，例如，引起疾病、失调和/或病症的消退。治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，如通过施用药剂治疗受试者的神经系统病状如多发性硬化和与氧化应激相关的其他疾病如肾脏疾病，尽管这种药剂不治疗该病状的病因。如本文所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括治愈性疗法、预防性(例如，预防疾病的)疗法、辅助疗法和姑息疗法。
“施用”表示将剂量药物给患者的方法。在本发明方法中使用的组合物可通过选自但不限于如下途径施用：吸入、眼部、肠胃外、皮肤、经皮、口腔、直肠、舌下、舌周(Perilingual)、鼻、局部给药和口服给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内给药。优选的给药方法可根据多种因素变化，如，被施用的组合物的组分和被治疗的病症的严重度。
本发明第六方面提供了生物标志物在构建预测心肌梗死的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，所述的生物标志物包括LINC00997和/或HAUS3。
本文使用的术语“标志物”、“生物标志物”或“诊断标志物”意指允许区分正常和疾病状态、或能够使治疗结果被预测或客观测量的标签。具体地，在与心肌梗死相关的情况下，标志物意指在患心肌梗死或有心肌梗死发病风险的受试者中，相比于正常对照(未患心肌梗死的受试者)，其蛋白或基因表达水平显著升高或降低的有机生物分子，例如多肽或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖、二糖、寡糖等)。
本发明第七方面提供了一种系统，包括：
(1)心肌梗死评估装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有心肌梗死；和
(2)彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的样本中的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的数据；
其中，所述心肌梗死评估装置的控制单元包括：
1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的数据；
2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中LINC00997和/或HAUS3基因表达水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的判别来计算判别值；
3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的心肌梗死的情况进行评价；以及
4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
本发明第八方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
d.本发明第四方面所述的组合物在制备治疗心肌梗死的药物中的应用；
e.本发明第五方面所述的方法在筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现检测LINC00997和/或HAUS3的试剂可用于诊断心肌梗死，为诊断心肌梗死提供了一种新方法。
本发明提供了LINC00997和/或HAUS3在构建预测心肌梗死的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用。
本发明还提供了一种筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物的方法。
附图说明
图1是LINC00997差异表达箱线图；
图2是LINC00997诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图3是LINC00997和HAUS3联合诊断急性心肌梗死的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1筛选急性心肌梗死差异表达基因
1、数据来源
从GEO数据库下载急性心肌梗死(AIM)数据集GSE66360，样本量为control：AIM＝50:49。
2、差异表达分析
使用R软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为adj.Pvalue<0.05。
3、实验结果
分析结果显示，本发明涉及的生物标志物LINC00997、HAUS3在急性心肌梗死样本中表达上调，如表1和图1所示。
表1、LINC00997、HAUS3的差异表达情况
基因 AveExpr t P.Value
LINC00997 5.23 3.64 0.00
HAUS3 8.87 4.67 0.00
实施例2诊断效能验证
1、实验方法
使用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。在判断指标联合的诊断效能时，对各基因的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合检测方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
2、实验结果
(1)LINC00997的ROC曲线分析
LINC00997的诊断效能参见表2和图2，通过实验结果可知LINC00997对于急性心肌梗死具有很好的诊断效果。
表2、LINC00997的诊断效能
基因 AUC 敏感性 特异性
LINC00997 0.74 0.54 0.94
(2)LINC00997+HAUS3联合诊断的ROC曲线分析
LINC00997、HAUS3基因的AUC值参见表3，LINC00997+HAUS3联合诊断的ROC曲线参见图3。
表3、基因的AUC值
基因 AUC
LINC00997 0.74
HAUS3 0.75
LINC00997+HAUS3 0.92
通过实验结果可知，LINC00997+HAUS3组合对于急性心肌梗死的诊断效果好于单个标志物，具有更好的诊断效能。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种试剂，其特征在于，所述的试剂可以检测LINC00997和/或HAUS3基因表达水平。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针、抗体。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的试剂。
4.一种芯片，其特征在于，所述芯片包括权利要求1或2所述的试剂。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括抑制LINC00997和/或HAUS3表达的试剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括与所述试剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
7.一种筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
用待筛选物质处理表达或含有LINC00997和/或HAUS3的体系；检测所述体系中LINC00997和/或HAUS3的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC00997和/或HAUS3的表达，则表明该候选物质是预防或治疗心肌梗死的候选药物。
8.生物标志物在构建预测心肌梗死的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括LINC00997和/或HAUS3。
9.一种系统，其特征在于，包括：
(1)心肌梗死评估装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有心肌梗死；和
(2)彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的样本中的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的数据；
其中，所述心肌梗死评估装置的控制单元包括：
1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的数据；
2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中LINC00997和/或HAUS3基因表达水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的LINC00997和/或HAUS3基因表达水平的判别来计算判别值；
3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的心肌梗死的情况进行评价；以及
4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
10.如下任一项所述的应用：
a.权利要求1或2所述的试剂在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
b.权利要求3所述的试剂盒在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
c.权利要求4所述的芯片在制备诊断心肌梗死的产品中的应用；
d.权利要求5或6所述的组合物在制备治疗心肌梗死的药物中的应用；
e.权利要求7所述的方法在筛选预防或治疗心肌梗死的候选药物中的应用。
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