CN113025650A - 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用，属于生物技术领域。本发明提供的方法包括将过表达外源性致癌基因的重组质粒、睡美人转座酶表达质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒共同溶解于生理盐水中后，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，一步操作即可快速建立外源性致癌基因在小鼠肝脏中持续过表达，抑癌基因在小鼠肝脏中的表达被持续敲低、且小鼠肝脏成瘤的诱发型炎癌转化小鼠模型，可以用于筛选原发性癌症早期免疫标志物和/或抗癌症药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用，尤其涉及一种两种致癌基因过表达和两种抑癌基因的表达被敲低的诱发型炎癌转化小鼠模型及其快速建立方法，以及该模型在筛选癌症(例如原发性肝癌)早期免疫诊断标志物和/或抗癌症药物中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(HCC)是最为常见的肝脏原发性恶性病变，其死亡率呈逐渐增长趋势。HCC起病隐匿，许多患者在确诊时已是中晚期，失去手术治疗的机会，靶向治疗药物较少而且预后相对较差。因此，要想提高肝癌的治愈率就要实现早诊断、早治疗，与此相关的原发性肝癌研究动物模型至关重要。
然而，传统的转基因或基因敲除动物模型对动物的生存周期会造成一定影响，化学诱导法建立的肝癌模型时间长并且发病机制复杂。近年来水动力基因转染技术因其具有快速、高效等优势在活体动物模型构建中受到广泛关注。水动力基因转染技术作为一种常规的基因转染方法，可以将外源基因递送到分裂期细胞或者不处于分裂期的细胞，通常被用于基因治疗或转基因动物模型的建立，如在高压下经小鼠尾静脉快速注射含目的基因重组质粒的生理盐水，从而在小鼠体内(主要在小鼠肝脏)实现目的基因的高效表达，进而构建出转基因小鼠模型。然而，这种经典的小鼠活体水动力基因转染技术也存在许多局限性，例如转入的目的基因重组质粒多为瞬时表达，在小鼠体内存留时间短，不能整合到宿主染色体内，从而无法实现基因的持续表达。
现有技术(参见Tward AD等人，Distinct pathways of genomic progression tobenign and malignant tumors of the liver.Proc Natl Acad Sci U S A 2007,104:14771e14776，以下称文献1)将10μg～50μg编码睡美人转座酶的质粒和携带目的基因(外源性致癌基因c-met和Δ90-β-catein)的重组质粒以1:25的比例在2.5ml过滤的生理盐水中稀释，然后利用水动力基因转染技术通过小鼠侧尾静脉在5～7s内快速注入6至8周的FVB/N小鼠中，从而成功构建获得了外源性致癌基因在小鼠肝脏内长时间稳定表达的转基因小鼠肝细胞肝癌模型。然而，虽然该文献1结合利用水动力基因转染技术和睡美人转座酶能够将转染的目的基因整合到小鼠染色体实现目的基因在小鼠肝脏内的持续表达，但是利用该文献1的方法构建活体小鼠模型仍需要较长时间，一般在3个月左右。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种诱发型炎癌转化小鼠模型的建立方法，其包括以下步骤：
1)将过表达外源性致癌基因的重组质粒、睡美人转座酶表达质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒共同溶解于生理盐水中，获得水动力基因转染注射液；
2)以小于5秒的速度将步骤1)获得的水动力基因转染注射液注于小鼠尾静脉中，随后正常喂养小鼠，当所述外源性致癌基因在小鼠肝脏中过表达，以及所述目的抑癌基因在小鼠肝脏中的表达被敲低后，建立诱发型炎癌转化小鼠模型。
上述方法中，步骤1)中所述过表达外源性致癌基因的重组质粒包括一种或多种过表达外源性致癌基因的重组质粒；
所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括一种或多种可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒。
上述方法中，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒包括过表达c-met基因的重组质粒和过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒。
上述方法中，所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒。
上述方法中，步骤1)的具体操作为：将所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒溶解于相当于小鼠体重8％～12％的生理盐水中；其中所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg～10μg，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量各为10μg～20μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量之比满足1:(2～4):(2～4)；
优选地，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒为过表达c-met基因的重组质粒和过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒，所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒为可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒；其中所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为5μg～10μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量之比满足1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)；
进一步优选地，将所述睡美人转座酶表达质粒5μg以及过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒各10μg溶解于相当于小鼠体重8％～12％的生理盐水中。
上述方法中，步骤2)中以小于5秒的速度将步骤1)获得的水动力基因转染注射液注于小鼠尾静脉中6周后，建立获得诱发型炎癌转化小鼠模型。
上述方法中，所述睡美人转座酶表达质粒为pCMV/SB。
本发明另一方面提供一种用于水动力基因转染获得诱发型炎癌转化小鼠模型的质粒组合，其包括睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒；其中在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg～10μg，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量各为10μg～20μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量之比满足1:(2～4):(2～4)。
在上述质粒组合中，过表达外源性致癌基因的重组质粒包括过表达c-met基因的重组质粒和过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒；所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒；其中在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为5μg～10μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量之比满足1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)；
优选地，在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg，所述过表达c-met基因的重组质粒、过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为10μg。
上述的方法建立的诱发型炎癌转化小鼠模型在筛选癌症早期免疫标志物和/或抗癌症药物中的应用也属于本发明的内容，任选地，其中所述癌症包括原发性肝癌。
基于以上技术方案提供的诱发型炎癌转化小鼠模型的建立方法联合利用睡美人转座酶的整合特性、CRISPR/Cas9基因编辑技术特异的基因敲除特性和水动力基因转染技术的肝脏特异转染特性，通过将共同溶解在生理盐水中的适宜量的过表达外源性致癌基因(例如外源性致癌基因c-met、Δ90-β-catein中的一种或两种)的重组质粒、睡美人转座酶表达质粒(例如pCMV/SB)和可敲除目的抑癌基因(例如抑癌基因pten、p53中的一种或两种)的CRISPR/Cas9重组质粒同时快速转染入小鼠体内，可以一步操作便实现将外源性致癌基因整合入小鼠染色体内，并同时敲除小鼠体内的抑癌基因的目的，两者共同发挥促进小鼠肝脏成瘤作用，尤其是大大缩短小鼠体内成瘤时间，在转染后约6周便建立一种外源性致癌基因在小鼠体内稳定持续高表达和敲除的抑癌基因在小鼠体内稳定持续低表达的诱发型炎癌转化小鼠模型，相对于文献1公开的方法建立模型所需时间(约3个月)极大缩短，显著提高了建模效率。经验证，在本发明获得的诱发型炎癌转化小鼠模型中，外源性致癌基因整合入小鼠的染色体内，因此能在小鼠体内长时间存留并稳定持续高表达，敲除的抑癌基因也在小鼠体内稳定持续低表达，该模型可以用于筛选原发性癌症(例如原发性肝癌)早期免疫标志物和/或抗原发性癌症药物。
附图说明
图1为lentiCRISPRv2载体图谱；
图2为lentiCRISPRv2经BsmBI酶切结果；
图3为pCMV/SB10质粒图谱；
图4为pT3-EF1a-c-met质粒图谱；
图5为pT3-N90-β-catenin质粒图谱；
图6为转染质粒后正常喂养的模型小鼠照片，其中A幅表示转染pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒各20μg的正常喂养小鼠，B幅表示转染lentiCRISPR v2和pCMV/SB10质粒各20μg的小鼠；
图7为转染pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒各0.1μg后正常喂养8周的小鼠肝脏HE染色照片，其中A幅表示放大倍率为4倍，B幅表示放大倍率为20倍；
图8为诱发型炎癌转化小鼠模型的小鼠肝脏及其HE染色照片，其中A幅表示转染lentiCRISPR v2(20μg)和pCMV/SB10(5μg)质粒的对照组小鼠肝脏及其HE染色照片；B幅表示转染pCMV/SB10(5μg)、pT3-EF1a-c-met(10μg)、pT3-N90-β-catenin(10μg)、lentiCRISPR-sgPten(10μg)和lentiCRISPR-sgP53(10μg)质粒的实验组小鼠肝脏及其HE染色照片；
图9为免疫组化法检测基因c-met、Δ90-β-catenin、Pten、P53在小鼠肝脏中的表达情况照片，其中A幅表示对照组小鼠肝脏中的表达情况，B幅表示实验组小鼠肝脏中的表达情况。
具体实施方式
针对现有技术中存在的在构建转基因活体动物模型中，水动力基因转染和转座酶结合的技术仍需要较长的建模时间的缺陷，本发明巧妙地联合利用睡美人转座酶的整合特性、CRISPR/Cas9基因编辑技术的特异性基因敲除特性和水动力基因转染技术的肝脏特异转染特性，从而一步操作快速构建得到外源性致癌基因在活体动物体内持续高表达和抑癌基因在活体动物体内持续低表达的诱发型炎癌转化小鼠模型。
在本发明的诱发型炎癌转化小鼠模型的构建过程中，发明人惊讶发现，当联合使用合适量的过表达外源性致癌基因(例如c-met和Δ90-β-catein)的重组质粒、睡美人转座酶表达质粒和可敲除目的抑癌基因(例如pten和p53)的CRISPR/Cas9重组质粒三者时，可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的存在对由过表达外源性致癌基因的重组质粒和睡美人转座酶表达质粒组成的整合体系不会产生影响，使得外源性致癌基因在转座酶的作用下整合入小鼠染色体内单独发挥作用，而且可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒也不受整合体系的影响从而单独发挥目的基因的敲除作用，然而两者在促进小鼠肝脏成瘤方面共同发挥作用，并且不会对小鼠的生存期造成影响，可以在转染后约6周便成功建立小鼠肝细胞肝癌模型，远远短于文献1利用水动力基因转染技术仅将过表达外源性致癌基因(c-met和Δ90-β-catein)的重组质粒和睡美人转座酶表达质粒转染入小鼠体内建立小鼠肝癌模型所需的时间(大约3个月)，极大提高了建模效率。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
以下实施例中使用的引物均可用已有技术合成。
以下描述中以建立小鼠肝癌模型为代表，建议一种外源性致癌基因c-met、Δ90-β-catein在小鼠体内持续高表达，敲除的抑癌基因pten、p53在小鼠体内持续低表达的小鼠肝癌模型。但是利用本发明的方法并不限于建立小鼠肝癌模型，其还可以用于构建任意的诱发型炎癌转化小鼠模型。
实施例1：敲除小鼠的抑癌基因pten、p53的慢病毒重组质粒的构建
1.1、按照下表1所示的酶切体系使用限制性内切酶BsmBI对lentiCRISPR v2载体(图1示出了该载体的图谱)进行酶切，使其线性化，作为构建敲除小鼠的抑癌基因pten、p53的慢病毒重组质粒的骨架载体；其中酶切条件为：在55℃条件下酶切反应15min后，80℃酶失活20min，酶切产物进行1％琼脂糖电泳，结果如图2所示，可见在2kb处有条带，即获得目的线性化的lentiCRISPR v2载体，回收目的载体条带保存于-20℃备用。
表1：限制性内切酶BsmBI对lentiCRISPRv2载体进行酶切的体系
1.2、按照下表2所示的序列设计针对小鼠Pten和P53基因的guide RNA(sgRNA)。
表2：针对小鼠Pten和P53基因的guide RNA核酸序列
| 靶基因 | 序列(5′-3′) |
| Pten上游 | CACCGAGATCGTTAGCAGAAACAAA(SEQ ID NO:1) |
| Pten下游 | AAACTTTGTTTCTGCTAACGATCTC(SEQ ID NO:2) |
| P53上游 | CACCGCCTCGAGCTCCCTCTGAGCC(SEQ ID NO:3) |
| P53下游 | AAACGGCTCAGAGGGAGCTCGAGGC(SEQ ID NO:4) |
1.3、敲除小鼠的抑癌基因pten、p53的慢病毒重组质粒的构建
1.3.1、分别将抑癌基因pten、p53的sgRNA用T4多聚核苷酸激酶在5’端添加磷酸基团，反应体系如下表3所示；反应条件为：37℃温育30min，然后95℃5min，以2℃/min降温，直至25℃，得到退火后的低聚物。
表3：sgRNA的5’端添加磷酸基团的反应体系
1.3.2、以1:100将步骤1.3.1获得的低聚物稀释到无菌水中，按照下表4的反应体系加入T4连接酶分别将pten、p53的sgRNA(在5’端已添加磷酸基团)连接至步骤1.1获得的线性化的lentiCRISPR v2载体中，T4连接反应条件为：4℃连接过夜；随后将连接产物转化到Stbl3感受态细胞，挑取阳性克隆增菌后进行序列测定，成功构建了敲除小鼠的抑癌基因pten的慢病毒重组质粒(命名为lentiCRISPR-sgPten质粒，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:5所示)和敲除小鼠的抑癌基因p53的慢病毒重组质粒(命名为lentiCRISPR-sgP53质粒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)。
表4：T4连接酶反应体系
实施例2：诱发型炎癌转化小鼠模型的构建
该实施例利用上述实施例1构建获得的敲除小鼠的抑癌基因pten的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-sgPten、敲除小鼠的抑癌基因p53的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-sgP53，以及睡美人转座酶表达质粒pCMV/SB10、过表达c-met基因的重组质粒pT3-EF1a-c-met和过表达Δ90-β-catein基因的重组质粒pT3-N90-β-catenin(后三者均购自addgene公司，如图3至图5，分别示出了三种质粒的图谱，增菌后进行质粒大量提取，-20℃保存备用)建立小鼠肝癌模型，具体包括以下操作：采用水动力基因转染方法，经C57BL/6小鼠(购自维通利华，6～8周龄，体重18～21g)尾静脉向每只小鼠快速(3秒)注射含有5μg的pCMV/SB10和各10μg的pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53混合质粒(共计45μg质粒)的生理盐水(约2ml)，之后正常喂养6周成功建立小鼠肝癌模型。在喂养过程中，通过小鼠活体荧光成像证实转染24小时后外源性致癌基因(c-met、Δ90-β-catein)已在小鼠肝脏中获得高表达，而敲除的抑癌基因(pten、p53)也已在小鼠肝脏中低表达。
关于由转座酶表达质粒和携带目的基因的重组质粒(即本发明的过表达外源性致癌基因的重组质粒)组成的整合体系，现有技术中普遍采用较低含量比例的转座酶表达质粒，这是因为在利用水动力基因转染和转座酶结合的技术构建活体动物模型过程中，可能存在转座酶产物过剩抑制(是指当转座酶过多时，转座率反而下降)而造成转座率下降的问题，以及在转座过程中，转座酶表达质粒也可能随机整合到基因组中，从而造成转座酶表达质粒在活体动物中持续表达，而导致建模失败的问题(例如参见谢飞等人，“睡美人”转座子的研究进展，遗传，2007年7月，29(7)：785-792)，并且现有技术也证明了在使用较低含量比例的转座酶表达质粒条件下确实获得了较好的外源基因转染效果，例如文献1公开的方法中合适的转座酶表达质粒的使用量与携带目的基因的重组质粒的使用量之比为1:25(质粒总量共计10μg～50μg)，Yant SR等人(Somatic intergration and long-term transgeneexpression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system，NatGenet，2000，25(1)：35，以下称文献2)公开的方法中合适的转座酶表达质粒(pCMV-SB)的使用量与携带目的基因的重组质粒(pT-EF1α-hFIX)的使用量之比也为1:25(1μg pCMV-SB+25μg pT-EF1α-hFIX)，并且证明了当使用更高含量的转座酶表达质粒时，在具有免疫能力的动物中过多的转座酶可能会促进细胞毒性T淋巴细胞对转染细胞进行清除而造成转座率下降的问题。然而，在本发明构建诱发型炎癌转化小鼠模型过程中，发明人按照文献1和文献2公开的方法将1μg转座酶表达质粒pCMV/SB10、25μg的两种过表达外源性致癌基因的重组质粒(pT3-EF1a-c-met和pT3-N90-β-catenin，分别为12.5μg)和25μg的两种可敲除目的抑癌基因的重组质粒(lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53，分别为12.5μg)溶解入约2ml生理盐水中并通过小鼠尾静脉注射入小鼠体内8周后，仍不能获得小鼠肝脏成瘤的小鼠肝癌模型。可能的原因是两种可敲除目的抑癌基因的重组质粒的加入对由1μg转座酶表达质粒pCMV/SB10和25μg的两种过表达外源性致癌基因的重组质粒组成的整合体系产生了影响，使得两种外源性致癌基因不能有效整合入小鼠染色体内；或者由于转座酶表达质粒的使用量太低。
而当发明人通过创造性劳动将转座酶表达质粒pCMV/SB10、两种过表达外源性致癌基因的重组质粒(pT3-EF1a-c-met和pT3-N90-β-catenin)和两种可敲除目的抑癌基因的重组质粒(lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53)共五种质粒的使用量均控制在5μg～10μg的范围内，且转座酶表达质粒pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53的使用量之比满足1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)时，均可以通过小鼠活体荧光成像在转染24小时后在小鼠肝脏中检测到外源性致癌基因(c-met、Δ90-β-catein)的持续高表达，和敲除的抑癌基因(pten、p53)的持续低表达，并在转染后6周左右成功建立获得小鼠肝脏成瘤的小鼠肝癌模型。在所要求的转座酶表达质粒的使用量范围内(5μg～10μg)，优选使用较低含量的质粒，而在两种过表达外源性致癌基因的重组质粒pT3-EF1a-c-met和pT3-N90-β-catenin，以及两种可敲除目的抑癌基因的重组质粒lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53的使用量范围(5μg～10μg)内，优选使用较高量的质粒，这对促进小鼠肝脏快速成瘤是有益的，并且可以避免转座酶产物过剩抑制问题。超过此范围的质粒使用量(例如五种质粒的使用量均为12.5μg～20μg)，则可能会导致转座酶产物过剩抑制问题，而导致外源性致癌基因脱靶增加，甚至会导致小鼠出现脱毛、易激怒和死亡率增加现象。如图6所示，其中A幅为转染pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒各20μg的正常喂养实验组小鼠，相对于只转染了lentiCRISPR v2和pCMV/SB10质粒各20μg的对照组小鼠(图6中B幅所示)，明显可见实验组小鼠有脱毛、毛色灰暗、状态较差(易激怒)的现象出现，并且随着喂养时间的延长，小鼠死亡率明显增加。低于此范围的质粒使用量(例如五种质粒的使用量均为0.1μg～1μg)，则可能导致外源性致癌基因不能有效整合入小鼠染色体内进而不能持续高表达，和/或内源性抑癌基因不能被有效敲除进而不能使抑癌基因持续低表达等，因此不能有效促进小鼠肝脏成瘤。如图7所示，为转染pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒各0.1μg的正常喂养8周的小鼠肝脏的HE染色结果(具体HE染色方法请参见以下实施例3)，其中A幅的放大倍率为4倍，B幅的放大倍率为20倍，可见小鼠肝脏中肝细胞排列整齐，仅有少量肝细胞核出现轻微的肿胀，无多核细胞，即小鼠肝脏未成瘤。
以下实施例3和实施例4是针对实施例2构建的小鼠肝癌模型进行验证和检测。
实施例3、诱发型炎癌转化小鼠模型的形成验证
转染第7周(即6周后)处死小鼠后观察小鼠肝脏成瘤情况，其中实验组小鼠转染了pCMV/SB10(5μg)、pT3-EF1a-c-met(10μg)、pT3-N90-β-catenin(10μg)、lentiCRISPR-sgPten(10μg)和lentiCRISPR-sgP53(10μg)的混合质粒，对照组小鼠转染了lentiCRISPRv2(20μg)和pCMV/SB10(5μg)质粒，HE染色法观察小鼠肝脏病理变化：
(1)取小鼠肝脏组织样本厚度约3mm，梯度酒精脱水70％、80％、95％、100％各30min，二甲苯两瓶各20min，石蜡浸蜡两缸各12min。石蜡包埋后切片，厚度约4μm。
(2)苏木素伊红(hematoxylin eosin，HE)染色：①脱蜡，三瓶二甲苯每瓶脱蜡8min；两瓶100％酒精每瓶8min；90％酒精、80％酒精、60％酒精各8min；②苏木素染色4min，流水清洗；③盐酸酒精分化2～3s，流水清洗；④0.5％氨水20s，流水清洗，上镜观察；⑤0.5％伊红染色1min；⑥80％酒精、90％酒精各分化3-5s，95％酒精5min，三瓶100％酒精各5min，两瓶二甲苯各5min；⑧中性树脂胶封固。
检测结果如图8所示，其中A幅表示对照组水动力注射lentiCRISPR v2和pCMV/SB10质粒6周后小鼠肝脏，B幅表示实验组水动力注射pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒6周后小鼠肝脏，A1和B1分别表示肝脏组织，A2和B2分别表示肝脏组织的HE染色结果，A3是A2中框中图像的放大图，B3是B2中框中图像的放大图。由图8中A幅和B幅所示的HE染色结果，可以明显观察到实验组相对于对照组部分肝细胞出现肿大，为正常肝细胞面积的3～4倍，导致肝细胞索明显拥挤；变性的肝细胞胞浆内出现大小不一的多个空泡，呈空泡变性，细胞核内可见有包涵体样物；一些肝细胞核增大，或出现双核甚至三个核的肝细胞，个别增大的核呈现巨大形态不整，显示肝细胞再生明显，这些均符合原发性肝癌细胞质中脂质或糖原明显积聚的特点，表明小鼠肝脏已经成瘤，已成功建立了小鼠肝癌模型。
实施例4、免疫组化法检测c-met、Δ90-β-catenin、Pten、P53在小鼠肝脏中的表达
(1)试样制备：转染质粒(其中试验组小鼠转染pCMV/SB10(5μg)、pT3-EF1a-c-met(10μg)、pT3-N90-β-catenin(10μg)、lentiCRISPR-sgPten(10μg)和lentiCRISPR-sgP53(10μg)质粒，对照组小鼠转染lentiCRISPR v2(20μg)和pCMV/SB10(5μg)质粒)后第7周(即6周后)，将小鼠脱臼处死，取出肝脏，固定24h以上。将固定后的组织精细取材后，于4℃下脱水、透明，52℃低熔点石蜡浸蜡包埋制成蜡块。切片机对蜡块进行连续切片，厚度为4μm，贴于载玻片上，56℃烘箱内烤干备用。
(2)免疫组化法采用SP法：制片后常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，PBS洗片3次，每次5min，放入湿盒中。0.3％H2O2孵育，室温10min。PBS洗片3次，每次5min。正常血清(1:10)孵育，室温20min。除去多余血清滴加c-met(1:200)一抗(购自Cell Signal公司)100μl于切片上，4℃，12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥公司)100μl于切片上，室温30min。PBS洗3次，每次5min。DAB显色10min(购自北京中杉金桥公司)。充分水洗，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检及显微镜摄影记录结果。Δ90-β-catenin、Pten、P53的检测步骤同上，兔抗人OCLN一抗(购自Invitrogen)的孵育浓度为1:200。
检测结果如图9所示，其中A幅表示对照组水动力注射lentiCRISPR v2和pCMV/SB10质粒6周后小鼠肝脏免疫组化的结果，B幅表示实验组水动力注射pCMV/SB10、pT3-EF1a-c-met、pT3-N90-β-catenin、lentiCRISPR-sgPten和lentiCRISPR-sgP53质粒6周后小鼠肝脏免疫组化的结果。明显可见，转染6周后，与对照组相比，实验组小鼠肝脏组织中外源致癌基因c-met、Δ90-β-catenin均持续高表达(参见图9中深染部位)，而抑癌基因Pten、P53的表达均显著降低(参见图9中浅染部位)，表明本发明建立的小鼠肝癌模型中外源性致癌基因能够在小鼠体内长时间存留，且已经整合到宿主的染色体内，进而实现外源性致癌基因的持续表达，另一方面，被敲除的抑癌基因Pten、P53也表现出稳定持续的低表达。
综上实验结果，证明在转染质粒的第6周便已经成功构建了小鼠肝脏已经成瘤、且外源性致癌基因c-met、Δ90-β-catenin整合入小鼠染色体内，并能够在小鼠肝脏内稳定持续高表达、并且小鼠内源性抑癌基因Pten、P53被敲除，进而两者在小鼠肝脏内稳定持续低表达的诱发型炎癌转化小鼠模型(此处为小鼠肝癌模型)。
综上实施例结果，本发明将睡美人转座酶的整合特性、CRISPR/Cas9基因编辑技术的特异性基因敲除特性和水动力基因转染技术的肝脏特异转染特性巧妙地结合在一起，并优化水动力注射体系中的各质粒使用量，可以一步操作同时将一种或多种过表达外源性致癌基因的重组质粒、一种或多种可敲除小鼠内源性抑癌基因的重组质粒和睡美人转座酶表达质粒转染入小鼠肝脏内，并且其中过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除小鼠内源性抑癌基因的重组质粒在促进小鼠成瘤方面共同发挥作用，可以快速(约6周)诱导小鼠肝脏成瘤，并使外源性致癌基因在小鼠体内持续高表达和使敲除的抑癌基因在小鼠体内持续低表达，进而成功构建获得诱发型炎癌转化小鼠模型，该模型可以有效用于筛选原发性癌症早期免疫标志物和/或抗原发性癌症的药物。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgagatc gttagcagaa acaaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactttgtt tctgctaacg atctc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgcctcg agctccctct gagcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacggctca gagggagctc gaggc 25
<210> 5
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggctttc cgatacaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 60
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 120
ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 180
ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg agatcgttag cagaaacaaa 240
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 300
ggcaccgagt cggtgctttt ttgaattcgc tagctaggtc ttgaaaggag tgggaattgg 360
ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg 420
aggggtcggc aattgatccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga 480
tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt 540
agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg accggttcta 600
gagcgctgcc accatggaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt 660
gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg 720
caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg 780
cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa 840
gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag 900
cttcttcaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac 960
ccatcttcgg cacatcgtgg acgaggtggc tacccgagaa gtacccacca tctacacctg 1020
agaagaactg gtggaagcac cacaaggcga ctggggtgat tttctggcct ggcccatgtt 1080
aaatttcggg gcctttctgt tgaggggact gaac 1114
<210> 6
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgctttcc gaatacaggg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac 60
aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt 120
tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga 180
tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctcgagct ccctctgagc 240
cgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 300
tggcaccgag tcggtgcttt tttgaattcg ctagctaggt cttgaaagga gtgggaattg 360
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 420
gaggggtcgg caattgatcc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 480
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 540
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gaccggttct 600
agagcgctgc caccatggac aagaagtaca gcatcggcct ggacatcggc accaactctg 660
tgggctgggc cgtgatcacc gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg 720
gcaacaccga ccggcacagc atcaagaaga acctgatcgg agccctgctg ttcgacagcg 780
gcgaaacagc cgaggccacc cggctgaaga gaaccgccag aagaagatac accagacgga 840
agaaccggat ctgctatctg caagagatct tcagcaacga gatggccaag gtggacgaca 900
gcttcttcca cagactggaa gagtccttcc tggtggaaga ggataagaag cacgagcggc 960
accccatctt cggcacatcg tggacgagtg ggcctaccac gagaagtacc ccccatctac 1020
cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggcag actgg 1065
Claims (10)
1.一种诱发型炎癌转化小鼠模型的建立方法，其包括以下步骤：
1)将过表达外源性致癌基因的重组质粒、睡美人转座酶表达质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒共同溶解于生理盐水中，获得水动力基因转染注射液；
2)以小于5秒的速度将步骤1)获得的水动力基因转染注射液注于小鼠尾静脉中，随后正常喂养小鼠，当所述外源性致癌基因在小鼠肝脏中过表达，以及所述目的抑癌基因在小鼠肝脏中的表达被敲低后，建立诱发型炎癌转化小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述过表达外源性致癌基因的重组质粒包括一种或多种过表达外源性致癌基因的重组质粒；
所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括一种或多种可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒包括过表达c-met基因的重组质粒和过表达△90-β-catein基因的重组质粒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)的具体操作为：将所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒溶解于相当于小鼠体重8％～12％的生理盐水中；其中所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg～10μg，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量各为10μg～20μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量之比满足1:(2～4):(2～4)；
优选地，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒为过表达c-met基因的重组质粒和过表达△90-β-catein基因的重组质粒，所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒为可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒；其中所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为5μg～10μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量之比满足1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)；
进一步优选地，将所述睡美人转座酶表达质粒5μg以及过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒各10μg溶解于相当于小鼠体重8％～12％的生理盐水中。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中以小于5秒的速度将步骤1)获得的水动力基因转染注射液注于小鼠尾静脉中6周后，建立获得诱发型炎癌转化小鼠模型。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述睡美人转座酶表达质粒为pCMV/SB。
8.一种用于水动力基因转染获得诱发型炎癌转化小鼠模型的质粒组合，其包括睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒；其中在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg～10μg，所述过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量各为10μg～20μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达外源性致癌基因的重组质粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒的使用量之比满足1:(2～4):(2～4)。
9.根据权利要求8所述的质粒组合，其中所述过表达外源性致癌基因的重组质粒包括过表达c-met基因的重组质粒和过表达△90-β-catein基因的重组质粒；所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重组质粒包括可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒；其中在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为5μg～10μg，且所述睡美人转座酶表达质粒、过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量之比满足1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)；
优选地，在单次水动力基因转染中，所述睡美人转座酶表达质粒的使用量为5μg，所述过表达c-met基因的重组质粒、过表达△90-β-catein基因的重组质粒、可敲除小鼠pten基因的重组质粒和可敲除小鼠p53基因的重组质粒的使用量各为10μg。
10.权利要求1-7中任一项所述的方法建立的诱发型炎癌转化小鼠模型在筛选癌症早期免疫标志物和/或抗癌症药物中的应用；
任选地，所述癌症包括原发性肝癌。
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