CN113024654B

CN113024654B - 一种抗菌肽bmapm及其表达方法和应用

Info

Publication number: CN113024654B
Application number: CN202110597581.1A
Authority: CN
Inventors: 汪仁; 周正雄; 高萌; 李洁; 孙彬
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN113024654A

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用，属于生物医药领域。本发明以牛源Cathelicidins家族的抗菌肽为出发序列，通过人工设计螺旋结构氨基酸序列获得抗菌肽BMAPM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其杀菌能力与天然抗菌肽相比大大提高。本发明制备抗菌肽BMAPM方法是以酵母为表达宿主，通过在其C端融合荧光蛋白，并通过简并引物随机突变抗菌肽的N端序列，再由流式细胞仪分选荧光强度高的突变株，即筛选抗菌肽高表达的突变株。本发明为高效表达和检测抗菌肽提供了新的方式。

Description

一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用。

背景技术

传统抗生素的滥用导致耐药性微生物不断增多，从而导致很多疾病的治疗变得更为困难，而新抗生素的发现周期相对较长，短期内很难挖掘效果显著的新抗生素。但人们发现在机体遭受微生物感染后，可以迅速产生大量的具有抗菌活性的小分子多肽，即为抗菌肽，参与机体免疫。这些机体自身免疫产生的抗菌肽的发现为新型肽类抗生素的发现提供了丰富的资源，并有望解决传统抗生素长期使用带来的微生物耐药性问题。从而在医药卫生、农业生产、食品工业、保健品、洗护用品等领域都是最佳的防腐剂、保鲜剂的候选名单，具有广阔的应用前景。

目前哺乳动物细胞合成的抗菌肽主要分为两类：Defensins和Cathelicidins，其中Cathelicidins家族的抗菌肽的结构主要分为4种：α螺旋结构、β片层结构、延伸螺旋结构和环状结构等。牛源抗菌肽等大部分哺乳动物抗菌肽都属于α螺旋结构，即在其N端是由带正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸组成α螺旋结构，而在C端由一段疏水性的氨基酸残基构成，其中N端的α螺旋结构在杀菌过程中起决定性作用。带正电荷的氨基酸通过静电作用力与细胞膜表面带负电荷的磷酸分子相结合，在此基础上，由疏水性氨基酸将抗菌肽插入细菌细胞膜中，破坏细胞膜电位、改变膜通透性并导致代谢物的渗漏，最终导致细菌死亡。

为了增强抗菌肽的抗菌作用与免疫调节作用，缓解各类菌种日益增强的耐药性，科学家们正在寻找更多设计合成或改造天然抗菌肽的方法。

此外，随着合成生物学技术及蛋白质表征技术的发展，利用微生物细胞异源表达异源蛋白基因成为一种流行趋势，然而不同宿主适合表达的蛋白有限，且基本都有一定的密码子偏好性。然而对于蛋白类化合物而言，目前可用的检测手段比较有限，一般采用SDS-PAGE、高效液相色谱或者高效液相色谱/质谱联用的方法进行检测，而上述三种检测手段方案复杂，不利于高通量检测蛋白的表达量。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗菌肽BMAPM。本发明还要解决的技术问题在于提供表达所述BMAPM的具体方法。本发明最后要解决的技术问题在于提供所述BMAPM的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种抗菌肽BMAPM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的抗菌肽BMAPM的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8中的任一所示。

一种制备所述抗菌肽BMAPM的方法，采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM；或直接采用人工合成的方式来制备抗菌肽BMAPM。

所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM的具体方法是：以荧光蛋白为筛选标记，利用简并引物构建抗菌肽BMAPM的编码核苷酸随机突变库，进行诱导表达，通过检测荧光强度筛选荧光强度强的突变株为表达菌株，对表达菌株进行诱导表达，获得抗菌肽BMAPM。

所述的表达抗菌肽BMAPM的方法，利用简并引物通过PCR的方法随机突变抗菌肽BMAPM的N端编码核苷酸序列。

所述筛选标记是在抗菌肽C端融合荧光蛋白。

所述的表达抗菌肽BMAPM的方法，所用宿主为毕赤酵母或酿酒酵母。

所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、樱桃红色荧光蛋白中的一种或几种。

所述的表达抗菌肽BMAPM的方法，选择荧光强度超过了10⁵的突变株为表达抗菌肽BMAPM的菌株。

所述的抗菌肽BMAPM作为抗菌剂在制备食品、卫生用品、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂或天然食品防腐剂中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本申请以牛源Cathelicidins家族的抗菌肽为出发序列，通过人工设计α螺旋结构氨基酸序列，有效提高抗菌肽BMAPM的杀菌能力。

(2)本申请提出通过C端融合荧光蛋白，并检测荧光蛋白的荧光强度来表征抗菌肽的表达量。此方法能够快速准确的检测抗菌肽的表达强度，并适合高通量筛选表达强度高的抗菌肽。

附图说明

图1为重组表达载体pPICZA-BMAPM-G4S-GFP构建示意图；

图2为重组表达载体pPICZA-BMAPM-G4S-RFP构建示意图；

图3为重组表达载体pYES2-BMAPM-G4S-mCherry构建示意图；

图4为流式细胞仪分选抗菌肽表达突变株

图5为重组表达载体pPIC9K-BMAPM构建示意图

图6为高效液相色谱-质谱联用检测酵母表达的抗菌肽的含量结果图；其中图a为色谱图，图b为质谱图；

图7为抗菌肽BMAPM对金黄色葡萄球菌的抑菌能力实验结果图；

图8为抗菌肽BMAPM对霉菌的抑菌能力实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1利用毕赤酵母制备抗菌肽BMAPM突变体库

1、抗菌肽BMAPM的设计和合成

根据牛源抗菌肽氨基酸序列特点(富含正电荷氨基酸及疏水氨基酸等)和抗菌肽的催化机制，采用Rosetta软件设计符合α螺旋结构且带正电荷的抗菌肽序列，使用RosettaDesign模块优化过渡态与不直接参与催化的氨基酸的空间结构；运用蒙特卡罗算法进行多轮采样，模拟退火优化抗菌肽的酶结构；依据过渡态能量、未直接参与催化的氨基酸残基的空间构象等参数评估设计结果，筛选过渡态构象范德华力＜-5kcal/mol、

最后，挑选一种疏水性、带正电荷能力最强的短肽，序列如SEQ ID NO.1所示，进行人工合成，即为抗菌肽BMAPM。

2、抗菌肽C端融合绿色荧光蛋白

通过G4S linker(用于连接抗菌肽和荧光蛋白的柔性连接肽，由Gly-Gly-Gly-Gly-Ser组成。)将抗菌肽BMAPM和绿色荧光蛋白(GFP，编码该酶的基因序列参见NCBI中GenBank：AMQ45836.1)融合后，经Gibbson组装，同源重组整合到pPICZA的EcoR I和Not I位点，构建出重组表达载体pPICZA-BMAPM-G4S-GFP，其中BMAPM的序列如SEQ ID NO.3所示(图1)。

3、抗菌肽C端融合红色荧光蛋白

通过G4S linker将抗菌肽BMAPM和红色荧光蛋白(RFP，编码该酶的基因序列参见NCBI中GenBank：ABN59525.1)融合后，经Gibbson组装，同源重组整合到pPICZA的EcoR I和Not I位点，构建出重组表达载体pPICZA-BMAPM-G4S-RFP(图2)。

4、利用简并引物构建抗菌肽随机突变库

通过简并引物F/R(F：GGNCGNTTMAAYCGNTTMCGNAAYAAYTTMAAYAAYMTNTTMAAYAAYTTMAAYAAYMTNTCNGGAGGAGGAGGATCC，R：GGATCCTCCTCCTCC，其中N为任意核苷酸，M为核苷酸T或C，Y为核苷酸A或G，)反向扩增重组表达载体pPICZA-BMAPM-G4S-GFP、pPICZA-BMAPM-G4S-RFP，并通过限制性内切酶Dpn I消化模板，构建抗菌肽突变体库pPICZA-BMAPM-G4S-GFPm、pPICZA-BMAPM-G4S-RFPm。

5、利用甲醇诱导表达抗菌肽突变体库

以pPIC系列载体为表达载体构建的重组表达载体pPICZA-mBMAPM-G4S-GFP、pPICZA-mBMAPM-G4S-RFP突变体库转化毕赤酵母得到转化子库；以pPICZA空载体转化毕赤酵母得到的转化子，作为对照。从平板上刮取所有的重组表达菌体突变体库，接种于3mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养过夜。按1％(v/v)的比例转接50mL BMMY培养基(加入终浓度为0.5g/L的甲醇)中，20℃，200rpm诱导5d。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，备测荧光强度。

实施例2利用酿酒酵母制备抗菌肽BMAPM突变体库

1、抗菌肽C端融合樱桃色荧光蛋白

通过G4S linker将抗菌肽BMAPM和樱桃色荧光蛋白(mCherry，编码该酶的基因序列参见NCBI中GenBank：AST15061.1)融合后，经Gibbson组装，同源重组整合到pYES2的HindI和Not I位点，构建重组表达载体pYES2-BMAPM-G4S-mCherry(图3)。

2、利用简并引物构建抗菌肽随机突变库

通过实施例1中所用的简并引物F/R反向扩增重组表达载体pYES2-BMAPM-G4S-cherry，构建抗菌肽突变体库pYES2-BMAPM-G4S-mCherrym。

3、利用半乳糖诱导表达抗菌肽突变体库

以pYES系列载体为表达载体构建重组表达载体pYES2-BMAPM-G4S-cherrym突变体库转化酿酒酵母得到转化子库；以pYES2空载体转化酿酒酵母得到的转化子，作为对照。从平板上刮取所有的重组表达菌体突变体库，接种于50mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养过夜。离心，收集菌体，重悬于含有2％的半乳糖的YNB培养基中，28℃，诱导24h后收集菌体，备测荧光强度。

实施例3抗菌肽突变体库mBMAPM的筛选及培养

1、流式细胞仪分选抗菌肽突变体库

将收集到的毕赤酵母突变体库诱导细胞P.pastoris GS115pPICZA-mBMAPM-G4S-GFP和酿酒酵母突变体库诱导细胞Saccharomyces cerevisiae pYES2-BMAPM-G4S-cherrym经20mM PBS缓冲液(pH7.4)清洗后，再利用20mM PBS缓冲液(pH 7.4)重悬至10⁷个细胞/mL。经细胞过滤后，移入流式管，置于冰上。上机检测分析毕赤酵母诱导细胞的荧光强度范围后，在纯化模式下，分选荧光强度达到10⁵的细胞至左1侧液流中。最后上机回测荧光强度，检验样品的纯度(图4)。结果表明突变株的平均荧光强度为4.5*10⁴，约5％的突变株的荧光强度超过了10⁵，挑取荧光强度最强的10株突变株进行核苷酸测序，得到4组核苷酸序列：mBMAPM1，GGGAGATTTAAAAGATTTAGAAAGAAATTTAAGAAATTATTTAAAAAATTCAAAAAATTATCA(SEQID NO.6)；mBMAPM2，GGCAGATTTAAACGTTTCAGAAAAAAGTTTAAGAAATTATTCAAAAAGTTCAAGAAGCTGAGT，(SEQ ID NO.2)；mBMAPM3，GGTAGATTCAAACGTTTCAGGAAAAAATTCAAGAAGTTGTTCAAGAAATTTAAGAAATTGTCT(SEQ ID NO.7)；mBMAPM4，GGACGGTTCAAGAGGTTCCGAAAGAAGTTTAAGAAACTGTTCAAGAAGTTCAAAAAGCTCTCA(SEQ ID NO.8)。

2、抗菌肽突变体库菌株的培养与产物含量测定

利用步骤1中获得的高表达突变体序列构建重组表达载体pPIC9K-mBMAPM1、pPIC9K-mBMAPM2、pPIC9K-mBMAPM3、pPIC9K-mBMAPM4(图5)，并采用实施例1步骤5的方法诱导毕赤酵母发酵生产抗菌肽，并通过高效液相色谱-质谱联用检测样品的表达量(图6)。其中，所用高效液相色谱条件为：色谱柱：Inertsil ODS-34.6×250mm；流动相：0.065％三氟乙酸的水溶液(A)，0.05％三氟乙酸乙腈溶液(B)；检测波长：220nm；流速：1mL/min。时间(min)0.01：泵A95％+泵B5％，时间(min)25.00：泵A35％+泵B65％，时间(min)25.01：泵A35％+泵B65％，时间(min)27.00：泵A5％+泵B95％，时间(min)27.01：泵A95％+泵B5％，时间(min)32.00：泵A95％+泵B5％。

所用质谱条件：离子源：ESI；雾化器流速：1.5L/min；干燥器流速：5L/min；离子源温度：200℃；传输线温度：250℃。

抗菌肽表达量的计算方法：通过液相色谱中待测样品的的峰面积与标准品的峰面积进行换算获得待测样品的浓度。

抗菌肽浓度计算公式：Y＝X/699788；其中，699788为1mg/L BMAPM在液相色谱中的峰面积。

结果表明以目前的色谱条件，抗菌肽mBMAPM的出峰时间为9.377min，跟出发序列(SEQ ID NO.3)相比，抗菌肽mBMAPM的表达量分别增加了1.3、9.8、3.5、7.6倍，达到23mg/L、109mg/L、45mg/L、87mg/L。

实施例4：透明质酸中添加抗菌肽BMAPM的抗菌实验

透明质酸是日化产品中常用的保湿剂，本实施例通过在1g/L的透明质酸溶液中添加1mg/L的抗菌肽BMAPM或牛源抗菌肽BMAP-27来模拟在保湿产品中添加BMAPM。将培养到10⁸/mL的金黄色葡萄球菌液体1mL分别加到10mL透明质酸溶液或10mL透明质酸、BMAPM混合溶液中，37℃，200rpm培养8h。每隔1h取样测定培养液的OD_600nm，从而比较杀菌肽BMAPM对金黄色葡萄球菌的杀菌能力(图7)。结果表明，BMAPM对金黄色葡萄球菌7h的抑菌率达到了100％，而BMAP-27的抑菌率为74％，明显低于目标序列。

实施例5：紫花苜蓿添加抗菌肽BMAPM的抗菌实验

紫花苜蓿是奶牛的主要饲料，但紫花苜蓿的存放过程中容易腐败变质，造成浪费，并带来一定的经济损失。在本实施例中，通过在粉碎的紫花苜蓿粉末中添加10mg/L的抗菌肽BMAPM或BMAP-27和10⁵cpu/mL的霉菌孢子一段时间之后涂布马铃薯培养基PDA平板，30℃，培养24h时，计算菌落数来比较抗菌肽的抑菌效率(图8)。结果表明，BMAPM对霉菌的24h抑菌率为68％，高于BMAP-27对霉菌的抑菌率(14％)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用

<130> 100

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 抗菌肽BMAPM序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys

1 5 10 15

Phe Lys Lys Leu Ser

20

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 抗菌肽BMAPM的基因序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagattta aacgtttcag aaaaaagttt aagaaattat tcaaaaagtt caagaagctg 60

agt 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 对照序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtagattta aaagatttag aaaaaaattt aaaaaacttt ttaaaaaatt taaaaaactt 60

tct 63

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> 简并引物F序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggncgnttma aycgnttmcg naayaayttm aayaaymtnt tmaayaaytt maayaaymtn 60

tcnggaggag gaggatcc 78

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 简并引物R序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatcctcct cctcc 15

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> mBMAPM1序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggagattta aaagatttag aaagaaattt aagaaattat ttaaaaaatt caaaaaatta 60

tca 63

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> mBMAPM3序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtagattca aacgtttcag gaaaaaattc aagaagttgt tcaagaaatt taagaaattg 60

tct 63

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> mBMAPM4序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggacggttca agaggttccg aaagaagttt aagaaactgt tcaagaagtt caaaaagctc 60

tca 63

Claims

1.一种抗菌肽BMAPM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的抗菌肽BMAPM的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中的任一所示。

3.一种制备权利要求1所述抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于：采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM；或直接采用人工合成的方式来制备抗菌肽BMAPM。

4.根据权利要求3所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM的具体方法是：以荧光蛋白为筛选标记，利用简并引物构建抗菌肽BMAPM的编码核苷酸随机突变库，进行诱导表达，通过检测荧光强度筛选荧光强度强的突变株为表达菌株，对表达菌株进行诱导表达，获得抗菌肽BMAPM。

5.根据权利要求4所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，利用简并引物通过PCR的方法随机突变抗菌肽BMAPM的N端编码核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，所述筛选标记是在抗菌肽C端融合荧光蛋白。

7.根据权利要求4所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，所用宿主为毕赤酵母或酿酒酵母。

8.根据权利要求4所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、樱桃红色荧光蛋白中的一种或几种。

9.根据权利要求4所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，其特征在于，选择荧光强度超过了10⁵的突变株为表达抗菌肽BMAPM的菌株。

10.权利要求1所述的抗菌肽BMAPM作为抗菌剂在制备食品、卫生用品、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂或天然食品防腐剂中的应用。