CN113015809A

CN113015809A - 利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法

Info

Publication number: CN113015809A
Application number: CN201980074829.7A
Authority: CN
Inventors: 金且英; 朴秀贤; 郑洧汀; 郑在哲; 柳永培; 金锡源; 李地英; 朴成喆
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-06-22
Also published as: KR20200055683A; EP3882352A1; KR102369065B1; EP3882352A4

Abstract

本发明涉及利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体(dimeric stilbene)生产方法，更具体地，涉及利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法及用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其包含植物愈伤组织培养液作为有效成分。

Description

利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法

技术领域

背景技术

主要表现为白藜芦醇化合物的二苯乙烯为小类植物二次代谢产物，其源自于从苯丙氨酸开始的普通苯丙烷途径。白藜芦醇(resveratrol；3，4’，5-transtrihydroxystilbene)是一种作为对诸如紫外线照射或霉感染之类的环境应激反应而从葡萄、花生及霉果等一些植物中天然产生的植物抗毒素(phytoalexin)。白藜芦醇及其衍生物不仅在植物防御反应中作为植物抗毒素及抗氧化物质而起到重要作用，而且可具有包括抗炎症效果、抗肿瘤活性及抗老化效果在内的多种有益的特性。但是，由于在暴露于光和氧或在具有强pH条件的环境中的不稳定性，反式白藜芦醇(transresveratrol)的潜在用途受到限制。

葡萄素(viniferin)作为白藜芦醇的二聚体(dimer)中的一种，具有与白藜芦醇类似的多种生理活性，例如，抗癌、抗病毒、抗炎症、抗老化、抗氧化等，因此用于保健功能食品、化妆品、药品、染料和功能性家畜饲料等，尤其，葡萄素对肝脏保护、抗癌、抗氧化及皮肤美白具有显著效果，并具有抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化、抑制血管平滑肌细胞的增殖和移动的效果。更具体地，酪氨酸调节用于转化黑色素细胞的酪氨酸酶，并在黑斑的形成步骤中中和细胞氧化，活性氧的攻击刺激酪氨酸酶。在此情况下，通过葡萄素的强力的抗氧化活动来防止活性氧转化成黑色素细胞，因此有利于获得干净且清洁的皮肤。并且，通过停止氧化应激的循环反应来防止皮肤的细胞炎症。

欧洲授权专利EP1519709公开了从葡萄树树液中提取具有如此高利用率的葡萄素的生产方法。但是，为了提取1kg的葡萄素需要1吨的葡萄树液。

并且，已知利用过氧化物酶(peroxidase)对反式白藜芦醇进行生物转化(bioconversion)来获得葡萄素中的δ-葡萄素(δ-viniferin)的方法(J.Agric.FoodChem.2003，51，51.5488-5492)。但该方法具有此时使用的过氧化物酶的价格昂贵的缺点。

因此，需要一种在成本和时间层面上有效生产葡萄素的方法。

本发明根据上述需求导出，本发明人通过悬浮培养植物愈伤组织来获得了培养液，并确认到可利用所获得的培养液生产二苯乙烯二聚体。由此，本发明人通过公开如下内容来完成了本发明，即，可通过本发明大量生产二苯乙烯二聚体，并且可以减少成本昂贵的增溶剂的使用量，从而可以减少成本及时间。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供利用植物愈伤组织培养液生物转化(bioconversion)二苯乙烯单体(monomeric stilbene)来生产二苯乙烯二聚体(dimeric stilbene)的方法。

本发明的再一目的在于，提供利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法。

本发明的另一目的在于，提供用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其包含植物愈伤组织培养液作为有效成分。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体(dimeric stilbene)生产方法，其包括：步骤1，在培养基中悬浮培养植物愈伤组织并收集培养液；以及步骤2，向在上述步骤1中收集的培养液添加二苯乙烯单体(monomericstilbene)及氧化剂并搅拌。

并且，本发明提供用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其包含植物愈伤组织培养液及氧化剂作为有效成分。

并且，本发明提供利用植物愈伤组织培养液的作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法，其包括向作为植物愈伤组织的葡萄愈伤组织培养液中添加提取溶剂来提取作为二苯乙烯二聚体的Maackin的步骤。

而且，本发明提供用于生产作为二苯乙烯二聚体的Maackin的组合物，其包含作为植物愈伤组织的葡萄愈伤组织培养液作为有效成分。

发明的效果

本发明通过悬浮培养植物愈伤组织来获得培养液，并确认到可利用所获得的培养液生产二苯乙烯二聚体，更具体地，可生产δ-葡萄素(δ-viniferin)、白皮杉醇二聚体(piceatannol dimer)、Maackin。因此，本发明的方法可有效用作二苯乙烯二聚体的生产方法。

并且，本发明的方法具有如下优点，即，可通过减少成本昂贵的增溶剂的使用来减少成本及时间，由于仅回收培养液来用于反应，因此可通过回收未用于反应的愈伤组织并将其继代以用于下一次培养，从而可以连续使用，由此可节省用于反应的时间及成本。

附图说明

图1示出过氧化物酶(peroxidase)利用过氧化氢作为氧化剂对底物进行脱氢的催化过程。

图2示出两个白藜芦醇(resveratrol)单体通过过氧化物酶生物转化(bioconversion)成作为白藜芦醇二聚体的δ-葡萄素(δ-viniferin)的过程。

图3示出对于作为本发明的植物愈伤组织培养液来利用苦参的愈伤组织培养液生物转化白藜芦醇而获得的结果物的高效液相色谱(HPLC)分析结果。

图4示出对于作为本发明的植物的愈伤组织培养液来分别利用苦参、北美沙果、葡萄的愈伤组织培养液生物转化白藜芦醇而获得的结果物的高效液相色谱分析结果。

图5示出对于作为本发明的植物愈伤组织培养液来利用苦参的愈伤组织培养液生物转化白藜芦醇并通过进一步反应而获得的结晶物的高效液相色谱分析结果。

图6示出对于作为本发明的植物愈伤组织培养液来利用葡萄的愈伤组织培养液生物转化白皮杉醇(piceatannol)单体而获得的结果物的高效液相色谱分析结果。

图7示出对于作为本发明的植物愈伤组织培养液来利用葡萄的愈伤组织培养液生物转化白皮杉醇(piceatannol)单体而获得的结果物的液相色谱-质谱联用(LC/MS)分析结果。

具体实施方式

以下，进一步详细说明本发明。

本发明提供利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体(dimeric stilbene)生产方法，其包括：步骤1，在培养基中悬浮培养植物愈伤组织并收集培养液；以及步骤2，向在上述步骤1中收集的培养液添加二苯乙烯单体(monomeric stilbene)及氧化剂并搅拌。

在本发明的方法中，上述步骤1中的植物可以为苦参、葡萄、北美沙果或大豆，但不限于此。

在本发明的方法中，上述步骤1中的植物愈伤组织可通过将产生伤口的植物组织切片放入愈伤组织诱导培养基并诱导植物组织愈伤组织来获得，或者，可从保藏机构购买使用。

并且，上述愈伤组织诱导培养基可以为如下的培养基，即，作为生长调节剂添加有0.05mg/L～0.2mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA，indole-3-acetic acid)、0.05mg/L～0.2mg/L的1-萘乙酸(NAA，1-naphthaleneacetic acid)、1mg/L～2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸及0.2mg/L～0.3mg/L的激动素，更具体地，可以为添加0.1mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA，indole-3-acetic acid)、0.1mg/L的1-萘乙酸(NAA，1-naphthaleneacetic acid)、1.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸及0.25mg/L的激动素的培养基，但不限于此。

在本发明的方法中，上述步骤1中的培养基可以为包含0.5mg/L～2.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS(Murashige&Skoog)培养基，更具体地，可以为包含1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS(Murashige&Skoog)培养基，但不限于此。

在本发明的方法中，在上述步骤1中可进行2天至6天的悬浮培养，具体地，可进行3天至5天，更具体地，可进行4天，但不限于此。

在本发明的方法中，上述步骤2中的二苯乙烯单体可以为白藜芦醇(resveratrol)或白皮杉醇(piceatannol)。

在本发明的方法中，上述步骤2中的氧化剂用于脱氢反应，上述脱氢反应用于将二苯乙烯单体生物转化为二苯乙烯二聚体，更具体地，上述氧化剂可以为过氧化氢，但不限于此。

在本发明的方法中，上述步骤2中的搅拌可进行3分钟至7分钟，具体地，可进行4分钟至6分钟，更具体地，可进行5天，但不限于此。

在本发明的方法中，上述步骤2还包括通过向搅拌的培养液添加提取溶剂来提取二苯乙烯二聚体的步骤，其中，提取溶剂可以为醋酸乙脂，但不限于此。

在本发明的方法中，上述二苯乙烯二聚体可以为δ-葡萄素(δ-viniferin)或白皮杉醇二聚体(piceatannol dimer)。

并且，在本发明的方法中，在上述步骤2之后，还可包括步骤3。

在上述步骤3中，使在上述步骤2中搅拌的培养液进一步反应5分钟至20分钟，具体地，反应7分钟至20分钟，更具体地，反应10分钟至20分钟来获得结晶物。

通过上述步骤3的反应析出的结晶物为具有难溶于水的性质且已被生物转化的二苯乙烯二聚体。

在本发明的方法中，还可包括向通过上述步骤3获得的结晶物添加提取溶剂来提取二苯乙烯二聚体的步骤，其中，提取溶剂可以为甲醇或甲醇水溶液，更具体地，可以为甲醇水溶液，但不限于此。并且，上述二苯乙烯二聚体可以为δ-葡萄素。

在本发明的具体实施例中，本发明人根据本发明将苦参、葡萄、北美沙果或大豆的愈伤组织作为植物愈伤组织进行悬浮培养来收集培养液。接着，向上述收集的培养液添加作为二苯乙烯单体的白藜芦醇及作为氧化剂的过氧化氢并通过搅拌来生物转化(bioconversion)白藜芦醇，从而确认到可生产作为二苯乙烯二聚体的δ-葡萄素。

并且，向上述收集的培养液添加作为二苯乙烯单体的白藜芦醇及作为氧化剂的过氧化氢并搅拌后，通过进一步反应10分钟以上来获得结晶物。提取并分析上述结晶物的结果，在结晶物中确认到δ-葡萄素。

并且，本发明人根据本发明通过将葡萄愈伤组织作为植物愈伤组织进行悬浮培养来收集培养液。接着，向上述收集的培养液添加作为二苯乙烯单体的白皮杉醇及作为氧化剂的过氧化氢并通过搅拌来生物转化白皮杉醇，从而确认到可生产作为二苯乙烯二聚体的白皮杉醇二聚体。

因此，在本发明中，通过悬浮培养植物愈伤组织来回收培养液，与回收的培养液一同利用过氧化氢作为氧化剂来生物转化二苯乙烯单体，从而确认到可生产二苯乙烯二聚体。

并且，确认到可通过进一步反应被生物转化的培养液来获得结晶物，并从上述获得的结晶物中可提取二苯乙烯二聚体。

由此，可将本发明的方法有效用作二苯乙烯二聚体的生产方法。并且，本发明的方法具有如下优点，即，可通过减少成本昂贵的增溶剂的使用来减少成本及时间，由于仅回收培养液来用于反应，因此可通过回收未用于反应的愈伤组织并将其继代以用于下一次培养，从而可以连续使用，由此可节省用于反应的时间及成本。

在本发明中，上述植物可以为苦参、葡萄、北美沙果或大豆，但不限于此。

在本发明中，上述植物愈伤组织可通过将产生伤口的植物组织切片放入愈伤组织诱导培养基并诱导植物组织愈伤组织来获得，或者，可从保藏机构购买使用。

在本发明中，可通过在培养基中将植物愈伤组织悬浮培养2天至6天来收集上述培养液，具体为3天至5天，更具体为4天，但不限于此。

在本发明中，上述氧化剂用于脱氢反应，上述脱氢反应用于将二苯乙烯单体生物转化为二苯乙烯二聚体，更具体地，上述氧化剂可以为过氧化氢，但不限于此。

在本发明中，上述二苯乙烯二聚体可以为δ-葡萄素或白皮杉醇二聚体，但不限于此。

本发明人通过悬浮培养植物愈伤组织来回收培养液，与回收的培养液一同利用过氧化氢作为氧化剂来生物转化二苯乙烯单体，从而确认到可生产二苯乙烯二聚体。由此，可将上述植物愈伤组织培养液及氧化剂有效用作用于生产二苯乙烯二聚体的组合物的有效成分。

在本发明中，上述葡萄愈伤组织可通过将产生伤口的葡萄组织切片放入愈伤组织诱导培养基并诱导葡萄组织愈伤组织来获得，或者，可从保藏机构购买使用。

在本发明中，可通过在培养基中将葡萄愈伤组织悬浮培养2天至6天来收集上述培养液，具体为3天至5天，更具体为4天，但不限于此。

并且，上述培养基可以为包含0.5mg/L～2.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS(Murashige&Skoog)培养基，更具体地，可以为包含1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS(Murashige&Skoog)培养基，但不限于此。

在本发明中，上述培养液可通过添加提取溶剂来提取Maackin，在此情况下，提取溶剂可以为醋酸乙脂，但不限于此。

在本发明中，上述Maackin由以下化学式1表示。

化学式1

在本发明的具体实施例中，本发明人根据本发明通过悬浮培养葡萄愈伤组织来收集培养液。接着，确认到可将上述收集的培养液通过提取溶剂提取并生产作为二苯乙烯二聚体的Maackin。由此，可将上述葡萄愈伤组织培养液有效用于作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法并有效用作用于生产Maackin的组合物的有效成分。

以下，通过实施例详细说明本发明。

但是，以下实施例仅为本发明的例示，本发明的内容并不限于以下实施例。

实施例1.用于苦参愈伤组织的悬浮培养及生物转化的培养液的回收

本发明使用苦参愈伤组织以进行生物转化。上述苦参愈伤组织为从KCTC菌种保藏中心(生物资源中心)购买使用的苦参愈伤组织(BP1429378)。

对从上述KCTC菌种保藏中心购买后稳定化的苦参愈伤组织进行悬浮培养。当进行悬浮培养时，使用作为MS(Murashige&Skoog)培养基的MS1D(MS4.4g、蔗糖30g、MES(2-吗啉乙磺酸)0.5g、肌肉肌醇0.1g、盐酸硫胺0.4mg、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L)液体培养基。向含有20mL的MS1D培养基的125mL锥形烧瓶中接种2g的苦参愈伤组织并在黑暗、25℃、90rpm的条件下悬浮培养4天。在培养的第四天，利用过滤网对试样进行过滤来分离愈伤组织和愈伤组织培养液，并将第一次分离的培养液试样以3000rpm离心分离2分钟，从而完全分离愈伤组织与培养液并将其用于生物转化实验。

实施例2.利用苦参愈伤组织培养液的白藜芦醇(resveratrol)的生物转化

通过上述实施例1中准备的苦参愈伤组织培养液和1mM过氧化氢及二苯乙烯单体将1mM白藜芦醇(resveratrol)添加到2mL的电子管(e-tube)并通过在旋转式振荡器中搅拌5分钟来诱导白藜芦醇的二聚体反应。作为对照组，以存在于苦参愈伤组织培养液内的蛋白质的总定量值为准，将在MS1D培养基中相同量的辣根过氧化物酶(HRP，Horseradishperoxidase)和1mM过氧化氢、1mM白藜芦醇添加到电子管(e-tube)并通过在旋转式振荡器中搅拌5分钟来诱导白藜芦醇的生物转化。作为阴性对照组使用了向MS1D培养基仅添加白藜芦醇和过氧化氢的试样。

实施例3.在生物转化培养基中的δ-葡萄素(δ-viniferin)提取及高效液相色谱(HPLC)分析

通过等量的醋酸乙脂在上述实施例2中反应的各个试样中依次萃取水和醋酸乙脂。向所获得的醋酸乙脂层注入空气(air)来进行干燥，并将所获得的干燥物溶解于400μl的80％甲醇并利用0.2μm的PTFE过滤器(hydrophilic，ADVANTEC，日本)进行高效液相色谱分析。使用高效液相色谱仪(Agilent Technology 1200series)进行高效液相色谱分析。作为泵系统使用了四元泵(quaternary pump)，作为柱使用了Agilent公司的ZORBAX SB-18(5mm，4.6×150mm)，作为流动相使用了水(A，0.05％三氟乙酸)和乙腈(B，0.05％三氟乙酸)，而利用梯度洗脱进行分析。使用二极管阵列检测器(DAD，Diode Aray Detector)在300nm的波长中确认到二苯乙烯化合物。虽然在上述阴性对照组中未观察到作为白藜芦醇单体的二苯乙烯二聚体的δ-葡萄素(δ-viniferin)，但是，在苦参愈伤组织培养液或添加有辣根过氧化物酶的试样提取物中检测到类似水平的δ-葡萄素(图3)。在上述实施例2中所使用的培养基(0.9mL)的成本为5.2韩元，与其包含的苦参愈伤组织培养液含有的蛋白质总量的等量的辣根过氧化物酶(12.48mg)成本为23212韩元，考虑到这一点便可知，使用苦参愈伤组织培养液生产等量的δ-葡萄素是非常有利的。

实施例4.多种植物愈伤组织的悬浮培养及培养液回收

为了确认利用除苦参愈伤组织外的其他植物愈伤组织培养液是否能够生物转化，使用了北美沙果愈伤组织、大豆愈伤组织、葡萄(Vitis vinifera L.cv Campbell Early)愈伤组织。上述愈伤组织分别为通过上述实施例所记载的方法和从KCTC中购买使用的。随后，通过与上述实施例1中所记载的方法相同的方法向20mL的MS1D液体培养基分别接种2g的北美沙果愈伤组织、大豆愈伤组织、葡萄愈伤组织，随后，通过悬浮培养并进行离心分离来获得各个愈伤组织培养液，从而用于生物转化实验。

实施例5.利用多种植物愈伤组织培养液的白藜芦醇的生物转化

分别将在上述实施例4中准备的北美沙果愈伤组织培养液、大豆愈伤组织培养液、葡萄愈伤组织培养液与1mM的过氧化氢、1mM的白藜芦醇一同添加到2mL的电子管并在旋转式振荡器中搅拌5分钟来诱导白藜芦醇的生物转化。接着，分别通过与上述实施例3中所记载的方法相同的方法提取诱导生物转化的培养液后，进行高效液相色谱分析来确认白藜芦醇的二聚体的生产。其结果，虽然其效率根据植物的种类存在差异，但确认到在诱导生物转化的北美沙果愈伤组织培养液、大豆愈伤组织培养液、葡萄愈伤组织培养液内也可检测到δ-葡萄素(图4)。

实施例6.在多种植物愈伤组织培养液的反应物中的δ-葡萄素提取及高效液相色谱分析

将在上述实施例2中回收的苦参愈伤组织培养液通过与上述实施例3中所记载的方法相同的方法进行生物转化后进一步进行10分钟以上的反应，其结果，确认到析出黄色的结晶物。将包含上述结晶物的培养液以12000rpm离心分离10分钟来分离沉淀物(pellet)和上清液后，向去除上清液来获得的沉淀物中注入空气(air)来进行干燥。将干燥物放入80％甲醇来将其溶解成1mg/ml浓度并利用0.2μm的PTFE过滤器(hydrophilic，ADVANTEC，日本)进行高效液相色谱分析。其结果，确认到所析出物质的75％为δ-葡萄素。当利用上述析出方法时，相比于现有方法，在获得生产物的过程中可减少提取步骤(图5)。

并且，通过与上述实施例5中所记载的方法相同的方法分别对在上述实施例4中回收的北美沙果愈伤组织培养液、大豆愈伤组织培养液及葡萄愈伤组织培养液进行生物转化后，进一步进行10分钟以上的反应，其结果，确认到析出黄色的结晶物。通过与上述相同方法对包含上述结晶物的培养液进行高效液相色谱分析，结果，在所析出的物质中确认到δ-葡萄素(不包括分析结果)。

实施例7.利用葡萄愈伤组织培养液的白皮杉醇(piceatannol)的生物转化

将在上述实施例4中准备的葡萄愈伤组织培养液与2mM的过氧化氢、1mM的作为二苯乙烯单体的白皮杉醇(piceatannol)添加到2mL的电子管并在旋转式振荡器中搅拌5分钟来诱导白皮杉醇的生物转化。接着，通过与上述实施例3中所记载的方法相同的方法提取诱导生物转化的培养液后，进行高效液相色谱分析来确认白皮杉醇二聚体的生产。其结果，除通过底物放入的白皮杉醇外，还确认到4个新的峰(peak)(图6)。

实施例8.在利用葡萄愈伤组织培养液的白皮杉醇生物转化培养液的白皮杉醇二聚体提取及液相色谱-质谱联用分析

为了确认在上述实施例7中生产的新的峰(peak)，通过等量的醋酸乙脂在上述实施例7中反应的葡萄愈伤组织培养液中依次萃取水和醋酸乙脂。向所获得的醋酸乙脂层注入空气(air)来进行干燥，并将干燥物溶解于100％甲醇并利用0.2μm的PTFE过滤器(hydrophilic，ADVANTEC，日本)进行液相色谱-质谱联用分析。使用UPLC-Q-TOF MS(XevoTMG2-S，Waters，Miliford，MA，美国)进行液相色谱-质谱联用分析。作为柱使用了AcquityUPLC BEH C18 column(2.1mm×100mm，1.7μm；Waters)，作为流动相使用了添加有如添加0.1％FA的水(A)的物质的乙腈(B)。流动相变化率条件如下表1所示。其结果，确认到被推定为白皮杉醇二聚体的2个峰(peak)和被推定为白皮杉醇-2H-二聚体的1个峰(peak)(图7)。

表1

实施例9.在葡萄愈伤组织培养液中的Maackin分离及NMR分析

对将在上述实施例4中准备的葡萄愈伤组织培养液依次萃取水和醋酸乙脂获得的醋酸乙脂层进行减压浓缩。利用回收制备型液相层析设备(Recycling Preparative HPLC)以反相柱(20mm×500mm)对于所获得的浓缩物(300mg)进行第一步骤分离。在此情况下，洗脱溶剂以25：75的比例洗脱水-甲醇混合溶液来获得4个分馏物(A-D)。通过浓缩作为靶化合物的含有大量Maackin(以下化学式1)的分馏物C来获得140mg的浓缩物，在上述混合溶剂条件下，利用Recycling LC设备通过回收140mg的所获得的浓缩物来获得25mg的Maackin。获得的化合物结构利用1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、DEPT及质量分析器鉴定。

Maackin：yellow pale，1HNMR(500MHz，CD3OD)δ7.118(1H，d，θ＝2.0Hz)，7.050(1H，dd，θ，＝1.5，8.5Hz)，6.965(1H，d，θ＝15.5Hz)，6.934(1H，d，θ＝8.5Hz)，6.856(1H，d，θ＝16.5Hz)，6.640(1H，s)，6.636(1H，d，θ＝8.5Hz)，6.451(2H，s)，6.440(1H，d，θ＝2.5Hz)，6.158(2H，d，θ＝14.0Hz)，6.082(1H，s)，6.078(1H，s)，4.705(2H，d，θ＝2.5Hz)；13CNMR(125MHz，CD3OD)δ158.3(C-11a，13a)，157.9(c-11b，13b)，145.3(C-4a)，144.7(C-3a)，143.6(C-3b)，139.6(C-9a，4b)，138.7(C-9b)，131.2(C-1b)，128.0(C-1a)，127.7(C-7b)，127.0(C-8b)，119.7(C-6b)，119.3(C-6a)，116.8(C-5b)，114.6(C-5a)，114.4(C-2b)，114.2(C-2a)，106.0(C-10b，14b)，104.5(C-10a，14a)，102.2(C-12b)，101.5(C-12a)，80.9(C-7a)，80.504(C-8a)

化学式1

产业上的可利用性

本发明的方法可有效用作二苯乙烯二聚体的生产方法。并且，本发明的方法具有如下优点，即，可通过减少增溶剂及用于生物转化的过氧化物酶等的使用来降低成本及时间。

Claims

1.一种利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，包括：

步骤1，在培养基中悬浮培养植物愈伤组织并收集培养液；以及

步骤2，向在上述步骤1中收集的培养液添加二苯乙烯单体及氧化剂并搅拌。

2.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述步骤1中的植物选自由苦参、葡萄、北美沙果及大豆组成的组。

3.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，在上述步骤1中，进行2天至6天的悬浮培养。

4.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述步骤2中的二苯乙烯单体为白藜芦醇或白皮杉醇。

5.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述步骤2中的氧化剂为过氧化氢。

6.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述步骤2中的搅拌进行3分钟至7分钟。

7.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，还包括向在上述步骤2中搅拌的培养液添加提取溶剂来提取二苯乙烯二聚体的步骤。

8.根据权利要求7所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述提取溶剂为醋酸乙脂。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述二苯乙烯二聚体为δ-葡萄素或白皮杉醇二聚体。

10.根据权利要求1所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，在上述步骤2之后，还包括步骤3，在上述步骤3中，使在上述步骤2中搅拌的培养液进一步反应5分钟至20分钟来获得结晶物。

11.根据权利要求10所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，还包括向在上述步骤3中获得的结晶物添加提取溶剂来提取二苯乙烯二聚体的步骤。

12.根据权利要求11所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述提取溶剂为甲醇或甲醇水溶液。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的利用植物愈伤组织培养液的二苯乙烯二聚体生产方法，其特征在于，上述二苯乙烯二聚体为δ-葡萄素。

14.一种用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其特征在于，包含植物愈伤组织培养液及氧化剂作为有效成分。

15.根据权利要求14所述的用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其特征在于，上述植物选自由苦参、葡萄、北美沙果及大豆组成的组。

16.根据权利要求14所述的用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其特征在于，上述培养液是通过在培养基中将植物愈伤组织悬浮培养2天至6天来收集的。

17.根据权利要求14所述的用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其特征在于，上述氧化剂为过氧化氢。

18.根据权利要求14所述的用于生产二苯乙烯二聚体的组合物，其特征在于，上述二苯乙烯二聚体为δ-葡萄素或白皮杉醇二聚体。

19.一种利用植物愈伤组织培养液的作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法，其特征在于，包括向作为植物愈伤组织的葡萄愈伤组织培养液中添加提取溶剂来提取作为二苯乙烯二聚体的Maackin的步骤。

20.根据权利要求19所述的利用植物愈伤组织培养液的作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法，其特征在于，上述培养液是通过在培养基中将葡萄愈伤组织悬浮培养2天至6天来收集的。

21.根据权利要求19所述的利用植物愈伤组织培养液的作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法，其特征在于，上述提取溶剂为醋酸乙脂。

22.根据权利要求19所述的利用植物愈伤组织培养液的作为二苯乙烯二聚体的Maackin生产方法，其特征在于，

上述Maackin由以下化学式1表示：

化学式1：

23.一种用于生产作为二苯乙烯二聚体的Maackin的组合物，其特征在于，包含作为植物愈伤组织的葡萄愈伤组织培养液作为有效成分。