CN113008655A - 用于收集汗液中血清淀粉样蛋白a的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用，所述浓缩装置包括阶梯式反应室，所述阶梯式反应室内套设有浓缩室，所述阶梯式反应室外的底部连接有真空泵；所述浓缩室的底部设有疏水膜，且所述浓缩室内卡设有标记膜；所述标记膜位于所述疏水膜的上方。本发明汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，样本反应浓缩之后加入其中的免疫层析检测卡后，无需长时间等待，即可进行样本检测，操作简单，样本处理时间短，降低了时间成本，适用于临床快速诊断检测。

Description

用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置及包括其的检 测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于体外诊断领域，涉及一种用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种急性时相反应蛋白，相对分子质量约为12kD。正常情况下血液中SAA的含量很少，炎症或感染急性期其在48～72h内即迅速升高，并且在疾病的恢复期迅速下降。已有研究表明，在细菌、病毒感染、动脉粥样硬化、冠心病、急性移植排斥反应等疾病中均可检测到血清SAA升高。与C-反应蛋白(CRP)相似，SAA有助于诊断炎症、评估其活性、检测其活动及治疗。在病毒感染性急性期，SAA水平明显升高，而CRP升高并不明显，因此SAA是诊断病毒感染灵敏而可靠的特异性指标，有助于患者细菌感染和病毒感染的鉴别诊断。
目前，大多是针对汗液收集装置的研究，但由于汗液量少，因此如果直接检测由于浓度低可能会造成灵敏度的降低，不易及时对人的健康进行监测。因此研发出一种能在汗液收集后进行浓缩加速反应的装置以提高灵敏度成为迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，所述浓缩装置包括阶梯式反应室，所述阶梯式反应室内套设有浓缩室，所述阶梯式反应室外的底部连接有真空泵；所述浓缩室的底部设有疏水膜，且所述浓缩室内卡设有标记膜；所述标记膜位于所述疏水膜的上方。
在本发明的一个具体方案中，其中所述阶梯式反应室包括连接为一体的第一反应室和第二反应室，所述第一反应室和第二反应室均为中空的圆柱形结构，且所述第一反应室的直径大于第二反应室的直径；这样设置可以使阶梯式反应室和浓缩室套设在一起，二者之间形成中空结构，可用于废液储存；并且外层的阶梯式反应室能压住浓缩室底部的疏水膜。
在本发明的一个具体方案中，其中所述浓缩室为中空的圆柱形结构，且所述浓缩室的直径小于第一反应室的直径，并大于第二反应室的直径；这样设置可以使阶梯式反应室和浓缩室套设在一起，二者之间形成中空结构，可用于废液储存；并且外层的阶梯式反应室能压住浓缩室底部的疏水膜。
在本发明的一个具体方案中，其中所述疏水膜的孔径小于200nm，这样设置的目的是防止缓冲液在反应阶段就下渗，孔径小于200nm是因为所使用标记的荧光微球直径大于200，可以防止被标记的抗体下渗到阶梯式反应室。
在本发明的一个具体方案中，其中所述标记膜上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:0.2～4，优选比例为1:1.2，这样优选后有利于提高液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的灵敏度和特异性；所述标记膜为硝酸纤维素膜。
在本发明的一个具体方案中，其中所述浓缩室、阶梯式反应室与真空泵的体积比为(1-10):(0.9-1.9):(0.9-1.9)，优选为1：0.9：0.9，综合不同稀释比例效果来看，这样优选后的稀释测值效果最好。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种用于检测汗液中血清淀粉样蛋白A的系统，所述系统包括上述的浓缩装置和免疫层析检测卡。
在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的加样垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线。
在本发明的一个具体方案中，其中所述另一株血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与羊抗兔多克隆抗体的划膜浓度比为(1-2)：(1-2)，优选为1:1，优选比例既不会浪费原料，测量结果也相对准确。
在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫层析检测卡还包括用于卡设试纸条的卡壳；所述卡壳包括：
底槽，其连接于所述PVC板；
上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述加样垫上加样的加样孔；
观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)将所采取的汗液加入所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的浓缩室，并与缓冲液按照1～10:10的比例进行混合，之后通过所述浓汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的的真空泵抽取，得到浓缩后的样本；
2)取30～100μL步骤1)中浓缩后的样本滴加到所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的加样孔(对应试纸条的加样垫)中，室温静置5～20min，然后将所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。
在本发明的一个具体方案中，其中所述汗液的收集为现有技术，在此不必赘述；例如，可通过可柔性汗液采集器收集汗液。
在本发明的一个具体方案中，其中所述汗液样本选自额头、脖颈或腋下等容易产生汗液且方便采集的部位。
本申请具体操作过程及原理：将通过现有技术采集到的汗液加入用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置的浓缩室内，加入缓冲液，通过真空泵向下抽取液体，控制浓缩装置的阶梯式反应室的体积以及通过疏水膜的分子直径，小分子水通过膜被负压抽到第二反应室，大分子荧光微球标记的抗体则留在了浓缩室的底部，多余的水被排到了第二反应室起到了浓缩作用。其中，浓缩室内的底部为疏水膜，膜的孔径小于200nm，利用最底部真空泵抽取相应浓缩倍数的体积，膜上剩余的液体则为浓缩液及荧光微球标记的抗体。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其可配合可柔性穿戴式汗液收集装置用于浓缩后汗液中SAA的检测，用于患者细菌感染和病毒感染的诊断。浓缩后灵敏度增加，极大地提高了检测效率。
2、本发明所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，其灵敏度高、稳定性强、具有优异的准确性和精密度。
3、本发明所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，样本反应浓缩之后加入其中的免疫层析检测卡后，无需长时间等待，即可进行样本检测，操作简单，样本处理时间短，降低了时间成本，适用于临床快速诊断检测。
附图说明
图1为本发明所提供的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置的结构示意图，
图2为本发明所提供的SAA免疫层析检测卡的结构示意图；
图3A为本发明所提供的SAA免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；
图3B为本发明所提供的SAA免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；
图4为本发明实施例1中SAA的标准曲线示意图；
其中，1a-标记膜，2a-阶梯式反应室，21a-第一反应室；22a-第二反应室；3a-浓缩室，4a-真空泵，5a-疏水膜，6a-针头，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-加样垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。
以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
实施例1 SAA(血清淀粉样蛋白A)免疫层析检测试剂盒的制备
1.SAA免疫层析检测试剂盒的制备
1)用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置
如图1所示，将浓缩室3a套设入阶梯式反应2a室内，之后在所述阶梯式反应室2a外的底部通过针头6a(内径为1mm)连接真空泵4a；在浓缩室3a的底部设置疏水膜5a(孔径为150nm)，同时在所述浓缩室3a内卡设标记膜1a，使得所述标记膜1a位于所述疏水膜5a的上方，即可得到浓缩装置；其中所述阶梯式反应室2a包括连接为一体的第一反应室21a和第二反应室22a，所述第一反应室21a和第二反应室22a均为中空的圆柱形结构，且所述第一反应室21a的直径大于第二反应室22a的直径，例如第一反应室21a的直径为2.5cm，第二反应室22a的直径为1.8cm。所述浓缩室3a为中空的圆柱形结构，且所述浓缩室3a的直径小于第一反应室21a的直径，并大于第二反应室22a的直径，例如浓缩室3a的直径为2cm。所述标记膜1a上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:1.2；所述浓缩室3a、阶梯式反应室2a与真空泵4a的体积比为1：0.9：0.9。
2)荧光微球标记鼠抗人血清淀粉样蛋白A(SAA)单克隆抗体
取0.1g乳胶荧光微球，用离心机离心30min(转速为10000r/min)，离心完后弃上清液，用10mL标记缓冲液复溶，再加入2mg的SAA标记抗体混匀，另加入10mg碳化二亚胺，室温搅拌反应1h，然后离心15min(转速为10000r/min)，弃上清液，用20mL的标记物稀释液稀释复溶混匀后备用。
3)荧光微球标记兔IgG
取0.05g乳胶荧光微球，用离心机离心30min(转速为10000r/min)，离心完后弃上清液，用5mL标记缓冲液复溶，再加入1mg的兔IgG混匀，另加入5mg碳化二亚胺，室温搅拌反应1h，然后离心15min(转速为10000r/min)，弃上清液，用10mL的标记物稀释液稀释复溶混匀后备用。
4)检测线和质控线的制备
将另一株SAA包被抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)进行稀释，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜2(NC膜)上按照1mg/mL的浓度进行划膜。含有另一株SAA包被抗体的作为检测线5(T线)，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线6(C线)，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成标记物垫3。
5)SAA免疫层析检测卡的组装
首先在PVC板1上粘接硝酸纤维膜2，然后在靠近硝酸纤维膜2上质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近硝酸纤维膜2的检测线5的一端搭接加样垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条，将试纸条放入卡壳中制备成SAA免疫层析检测卡(见图2所示)。
所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图3A、图3B所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述加样垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。
如图3B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；
如图3A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。
所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述加样垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于加样垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。
2.缓冲液的制备
将5.79g的柠檬酸钠、9.54g的柠檬酸三钠、1g的Proclin300及2g的牛血清白蛋白加入到烧杯中，边加水边搅拌至全部溶解，然后用水定量至1000mL，得到含有0.06M的柠檬酸钠、0.06M的柠檬酸三钠、0.1％(v/v)的Proclin300和0.2wt％的牛血清白蛋白的缓冲液，备用。
3.检测
1)将所采取的汗液加入所述浓缩装置的浓缩室3a，并与缓冲液按照1:1的比例进行混合，之后通过所述浓缩装置的真空泵4a抽取，得到样本混合液(浓缩后的样本)；
2)取60μL步骤1)中的样本混合液，滴加到所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的加样孔中，室温静置15min，然后然后将汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。
检测原理：往加样垫9上加入浓缩后的待测汗液缓冲液，由于抗原在浓缩室3a内已与标记物混合，混合液体沿着硝酸纤维素膜层析，分别与检测线5和质控线6反应。当测试结果有效时，质控线6显示一定光强度。这时检测线5上的光信号强度比质控线光信号强度的比值(T/C)与样本浓度成正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。
4.标准曲线的建立
配置不同浓度的SAA标准品(0、3、10、30、60、156μg/mL)，用本发明中制备的SAA试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，采用Logistic四参数进行曲线拟合，标准曲线如图4所示。表1为标准品不同浓度下T/C测值结果，图4为四参数曲线拟合，R2＝0.99926，从表1和图4的数据可以看出，SAA的标准曲线拟合程度较好。
表1检测数据
标准浓度μg/mL 0 3 10 30 60 156
T/C值 0.032 0.065 0.176 0.456 0.715 1.339
实施例2测值结果与临床诊断信息比对
采用实施例1所得到的检测结果与临床诊断信息进行比对。通过采集40汗液样本，其中正常人24例，临床诊断为细菌感染的汗液16例，检测结果如下表2所示。
表2
Figure BDA0002945496870000071
Figure BDA0002945496870000081
从表2的检测结果中可以看出，本发明的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置在配合SAA免疫层析检测卡的所测结果与临床诊断信息比对结果如下：
灵敏度＝87.50％(95％CI 63.98％-96.50％)，
特异性＝95.83％(95％CI 79.76％-99.26％),
因此本发明的浓缩装置结合SAA免疫层析检测卡可以汗液检测辅助临床诊断的需求。
选取20例样本(表2的1-20号样本)分别通过本发明实施例1的浓缩装置进行浓缩(浓缩比例为10倍)与直接测值，将结果和临床诊断结果进行比对，见表3；表3的结果表明未浓缩的测值整体低于浓缩后的测值结果，这说明浓度是会进一步影响测值结果。
表3
样本编号 样本 浓缩后测值结果 未浓缩测值结果 临床诊断结果
1 正常人 12.81 12.13 阴性
2 患者 36.44 27.19 阳性
3 患者 56.23 51.02 阳性
4 正常人 1.77 1.29 阴性
5 正常人 2.10 1.62 阴性
6 正常人 3.84 3.15 阴性
7 正常人 5.63 4.18 阴性
8 正常人 2.06 2.02 阴性
9 患者 5.87 3.34 阳性
10 患者 61.26 49.29 阳性
11 正常人 6.61 5.17 阴性
12 正常人 4.01 3.26 阴性
13 患者 47.21 37.12 阳性
14 正常人 4.32 3.87 阴性
15 患者 33.10 30.09 阳性
16 正常人 3.16 2.21 阴性
17 正常人 1.22 0.96 阴性
18 患者 91.02 67.23 阳性
19 患者 62.30 36.21 阳性
20 患者 36.33 29.32 阳性
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其特征在于，所述浓缩装置包括阶梯式反应室，所述阶梯式反应室内套设有浓缩室，所述阶梯式反应室外的底部连接有真空泵；所述浓缩室的底部设有疏水膜，且所述浓缩室内卡设有标记膜；所述标记膜位于所述疏水膜的上方。
2.如权利要求1所述的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其特征在于，所述阶梯式反应室包括连接为一体的第一反应室和第二反应室，所述第一反应室和第二反应室均为中空的圆柱形结构，且所述第一反应室的直径大于第二反应室的直径。
3.如权利要求1所述的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其特征在于，所述浓缩室为中空的圆柱形结构，且所述浓缩室的直径小于第一反应室的直径，并大于第二反应室的直径；所述疏水膜的孔径小于200nm。
4.如权利要求1所述的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其特征在于，所述标记膜上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:0.2～4；所述标记膜为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求1所述的用于收集汗液中血清淀粉样蛋白A的浓缩装置，其特征在于，所述浓缩室、阶梯式反应室与真空泵的体积比为(1-10):(0.9-1.9):(0.9-1.9)。
6.一种汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1-5任一项所述的浓缩装置和SAA免疫层析检测卡。
7.如权利要求6所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，其特征在于，所述SAA免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有另一株血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的加样垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线。
8.如权利要求6所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，其特征在于，所述另一株血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与羊抗兔多克隆抗体的划膜浓度比为(1-2)：(1-2)。
9.如权利要求6所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒，其特征在于，所述SAA免疫层析检测卡还包括用于卡设试纸条的卡壳；所述卡壳包括：
底槽，其连接于所述PVC板；
上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述加样垫上加样的加样孔；
观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
10.一种权利要求6-9任一项所述的汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所采取的汗液加入所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的浓缩室，并与缓冲液按照1～10:10的比例进行混合，之后通过所述浓汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的真空泵抽取，得到浓缩后的样本；
2)取30～100μL步骤1)中浓缩后的样本滴加到所述汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的加样孔中，室温静置5～20min，然后将汗液中血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果；
所述汗液样本选自额头、脖颈或腋下。
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