CN113008654B - 用于收集汗液中全程c-反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

用于收集汗液中全程c-反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于收集汗液中全程C‑反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用，所述浓缩装置包括封闭型壳体，所述壳体内安装有恒温室，所述恒温室内套设有废液收集室，所述废液收集室内套设有离心室，所述离心室的侧壁为疏水膜，所述恒温室与废液收集室之间设有硝酸锌晶体保温层，所述离心室内卡设有标记膜。本发明的用于收集汗液中全程C‑反应蛋白的检测试剂盒，样本反应浓缩之后加入附带的C‑反应蛋白免疫层析检测卡后，无需长时间等待，即可进行样本检测，操作简单，样本处理时间短，降低了时间成本，适用于临床快速诊断检测。

Description

用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测 试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于体外诊断领域，涉及一种用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用。
背景技术
C-反应蛋白(CRP)是一种急性相蛋白，且是在历史上首先被认识的急性相蛋白之一。其血清或血浆浓度的增加是由炎性细胞因子如IL-6释放所致，它几乎恒定不变地显示有炎症存在。由于C-反应蛋白通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高，所以测定人血中CRP含量对于有鉴别细菌和病毒感染重要意义。传统检测都是基于采用血液作为样本进行检测，对于场地要求较高，汗液就很好的避免了对于场地的限制性要求，但由于汗液量较血液含量来说量少不易采集，因此设计一款能够对汗液进行浓缩的装置以便于检测成为市场迫切需求。
目前，大多是针对汗液收集装置的研究，但由于汗液量少，因此如果直接检测由于浓度低可能会造成灵敏度的降低，不易及时对人的健康进行监测。因此研发出一种能在汗液收集后进行浓缩加速反应的装置以提高灵敏度成为迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置及包括其的检测试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，所述浓缩装置包括封闭型壳体，所述壳体内安装有恒温室，所述恒温室内套设有废液收集室，所述废液收集室内套设有离心室，所述离心室的侧壁为疏水膜，所述恒温室与废液收集室之间设有硝酸锌晶体保温层，所述离心室内卡设有标记膜。
在本发明的一个具体方案中，其中所述标记膜与所述疏水膜固定连接；所述离心室内卡设有可恰好浸泡于缓冲液中的标记膜；还包括动力机构，所述动力机构通过轴承连接于所述壳体；这样设置不仅可以使废液在离心后沿着管壁流下，又能使整个离心室置于恒温室中充分地进行反应。
在本发明的一个具体方案中，其中所述恒温室、废液收集室和离心室均为中空的圆柱形结构，且所述废液收集室的直径小于恒温室的直径，且大于离心室的直径；这样设置可以使离心后的液体进入废液收集室，设置的直径可以使离心室及废液收集室卡好，避免离心时废液收集室因直径不合而相互碰撞。
在本发明的一个具体方案中，其中所述疏水膜的孔径小于200nm；具体地，所述疏水膜为ML-QF系列双疏微孔膜，材质为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，孔径为10微米，膜厚度为70-100微米，这样设置的目的是防止缓冲液在反应阶段就下渗。孔径小于200nm是因为所使用标记的荧光微球直径大于200，可以防止被标记的抗体下渗到阶梯式反应室。
在本发明的一个具体方案中，其中所述标记膜上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:0.2～4，优选比例为1:1.2，这样优选后有利于提高汗液中C-反应蛋白的检测试剂盒的灵敏度和特异性；所述标记膜为硝酸纤维素膜。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种用于检测汗液中C-反应蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括上述的浓缩装置和免疫层析检测卡。
在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的加样垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线。
在本发明的一个具体方案中，其中所述另一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体与羊抗兔多克隆抗体的划膜浓度比为(1-2)：(1-2)，优选为1:1；这样优选后既不会浪费原料，测量结果也相对准确。
在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫层析检测卡还包括用于卡设试纸条的卡壳；所述卡壳包括：
底槽，其连接于所述PVC板；
上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述加样垫上加样的加样孔；
观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)将所采取的汗液与缓冲液按照1～10:10的比例进行混合；
2)取30～100μL步骤1)中稀释后的样本滴加到C-反应蛋白免疫层析检测卡的加样孔中，室温静置5～20min，然后将C-反应蛋白免疫层析检测卡插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。
在本发明的一个具体方案中，其中所述汗液的收集为现有技术，在此不必赘述；例如，可通过可柔性汗液采集器收集汗液。
在本发明的一个具体方案中，其中所述汗液样本选自额头、脖颈或腋下等容易产生汗液且方便采集的部位。
本发明的具体操作过程及原理：将可柔性汗液收集器或直接采集到的汗液加入本发明用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩反应装置内，加入缓冲液，混合均匀(汗液与标记膜上标记的抗体发生反应)，通电后进行充分反应，待加热后硝酸锌晶体达到熔点融化后接触到底部反应片触发离心室开始离心；通过控制离心室外侧的废液收集室的体积以及通过疏水膜的分子的直径，小分子的水则通过疏水膜被离心到废液收集室，大分子的荧光微球标记的抗体则留在了疏水膜的上层。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，可配合可柔性穿戴式汗液收集装置用于浓缩后汗液中C-反应蛋白的检测，用于患者细菌感染的诊断，用来与病毒感染进行区分；浓缩后灵敏度增加，极大地提高了检测效率。
2、本发明的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其灵敏度高、稳定性强、具有优异的准确性和精密度；由于其具有恒温室，能够提前加速样本与含有用荧光微球标记的另一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体标记物与兔IgG标记物充分混合，反应更彻底。
3、本发明的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，样本反应浓缩之后加入其中的C-反应蛋白免疫层析检测卡后，无需长时间等待，即可进行样本检测，操作简单，样本处理时间短，降低了时间成本，适用于临床快速诊断检测。
4、本发明的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其增加了离心装置，反应完全后自动离心，减少操作步骤。废液收集装置可以根据浓缩倍数大小进行不同型号的反应管更换。由于硝酸锌晶体的熔点为37度，使得该检测试剂盒的反应温度为37度，因此当通电时，温度升高到37度，晶体融化触发离心装置进行自动离心。
附图说明
图1为本发明所提供的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置的结构示意图之一；
图2为本发明所提供的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置的结构示意图之二；
图3为本发明所提供的C-反应蛋白免疫层析检测卡的结构示意图；
图4A为本发明所提供的C-反应蛋白免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；
图4B为本发明所提供的C-反应蛋白免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；
图5为本发明实施例1中C-反应蛋白的标准曲线示意图；
其中，1a-壳体，2a-恒温室，3a-废液收集室，4a-离心室，4b-疏水膜，5a-硝酸锌晶体保温层，6a-标记膜，7a-电动机，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-加样垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。
以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
实施例1C-反应蛋白(CRP)免疫层析检测试剂盒的制备
1.C-反应蛋白(CRP)免疫层析检测试剂盒的制备
1)用于收集汗液中C-反应蛋白(CRP)的浓缩装置
如图1-图2所示，将离心室4a套入废液收集室3a内，之后将废液收集室3a套入恒温室2a内，随后将恒温室2a套入封闭型壳体1a内，同时在恒温室2a与废液收集室3a之间设置硝酸锌晶体保温层5a，并在离心室4a卡设标记膜6a以使其可恰好浸泡于缓冲液中，之后通过轴承将壳体1a与电动机7a连接；其中所述离心室4a的侧壁为疏水膜4b(孔径为150nm)，所述标记膜6a与所述疏水膜4b固定连接；所述恒温室2a、废液收集室3a和离心室4a均为中空的圆柱形结构，且所述废液收集室3a的直径小于恒温室2a的直径，且大于离心室4a的直径，例如废液收集室3a的直径为2cm，恒温室2a的直径为2.5cm，离心室4a的直径为1.8cm；所述疏水膜的孔径小于200nm，材质为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，孔径为10微米，膜厚度可以为70-100微米，例如100nm；所述标记膜6a上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:1.2；所述标记膜6a为硝酸纤维素膜。
2)荧光微球标记鼠抗人全程C-反应蛋白(CRP)单克隆抗体
取0.05g乳胶荧光微球，用离心机离心30min(转速为10000r/min)，离心完后弃上清液，用5mL标记缓冲液复溶，再加入1mg的兔IgG混匀，另加入5mg碳化二亚胺，室温搅拌反应1h，然后离心15min(转速为10000r/min)，弃上清液，用10mL的标记物稀释液稀释复溶混匀后备用。
3)荧光微球标记兔IgG
取0.05g乳胶荧光微球，用离心机离心30min(转速为10000r/min)，离心完后弃上清液，用5mL标记缓冲液复溶，再加入1mg的兔IgG混匀，另加入5mg碳化二亚胺，室温搅拌反应1h，然后离心15min(转速为10000r/min)，弃上清液，用10mL的标记物稀释液稀释复溶混匀后备用。
4)检测线和质控线的制备
将另一株C-反应蛋白包被抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)进行稀释，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜2(NC膜)上按照1mg/mL的浓度进行划膜。含有另一株C-反应蛋白包被抗体的作为检测线5(T线)，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线6(C线)，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成标记物垫3。
5)免疫层析检测卡的组装
首先在PVC板1上粘接硝酸纤维膜2，然后在靠近硝酸纤维膜2上质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近硝酸纤维膜2的检测线5的一端搭接加样垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条，将试纸条放入卡壳中制备成C-反应蛋白(全程C-反应蛋白)免疫层析检测卡(见图3)。
所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图4A，图4B所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述加样垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。
如图4B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；
如图4A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。
所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述加样垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于加样垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。
2.缓冲液的制备
将0.99g二水磷酸二氢钠、5.16g十二水磷酸氢二钠、1g的Proclin300及2g的牛血清白蛋白加入到烧杯中，边加水边搅拌至全部溶解，然后用水定量至1000mL，得到含有0.02M的磷酸盐、0.1％(v/v)的Proclin300和0.2wt％的牛血清白蛋白的缓冲液，备用。
3.检测
1)将所采取的汗液加入所述用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置的离心室4a，并与缓冲液按照1:1的体积比进行混合，得到样本混合液(浓缩后的样本)；其中以下检测只需将离心后离心室4a的底部剩余的浓缩液抽出，加入检测试剂盒加样孔即可。
2)取60μL步骤1)中的样本混合液，滴加到C-反应蛋白免疫层析检测卡的加样孔中，室温静置15min，然后将C-反应蛋白免疫层析检测卡插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。
检测原理：往加样垫9上加入浓缩后的待测汗液缓冲液，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与检测线5和质控线6反应。当测试结果有效时，质控线显示一定光强度。这时检测线5上的光信号强度比质控线6光信号强度的比值(T/C)与样本浓度成正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。
4.标准曲线的建立
配置不同浓度的C-反应蛋白标准品(0.5、2.5、10、50、200μg/ml)，用本发明中制备的C-反应蛋白试剂盒进行检测，采用Logistic四参数进行曲线拟合，标准曲线如图2所示。表1为标准品不同浓度下T/C测值结果，图5为四参数曲线拟合，R2＝0.99755，从表1和图5的数据可以看出，C-反应蛋白的标准曲线拟合程度较好。
表1检测数据
标准浓度μg/mL 0 0.5 2.5 10 50 200
T/C值 0.023 0.069 0.288 0.925 1.834 2.988
实施例2测值结果与临床诊断信息比对
采用实施例1所得到的检测结果与临床诊断信息进行比对。通过采集50汗液样本，其中正常人27例，临床诊断为细菌感染的汗液23例，检测结果如下表2所示。
表2
Figure GDA0003169252510000071
Figure GDA0003169252510000081
从表2的检测结果中可以看出，本发明的用于收集汗液中C-反应蛋白的浓缩装置在配合C-反应蛋白免疫层析检测卡的所测结果与临床诊断信息比对结果如下：
灵敏度＝86.96％(95％CI 67.87％-95.46％)，
特异性＝96.30％(95％CI 81.72％-99.34％),
因此本发明的浓缩装置结合C-反应蛋白免疫层析检测卡可以汗液检测辅助临床诊断的需求。
选取20例样本(表2的1-20号样本)分别通过本发明实施例1的浓缩装置进行浓缩(浓缩比例为10倍)与直接测值，将结果和临床诊断结果进行比对，见表3；表3的结果表明未浓缩的测值整体低于浓缩后的测值结果，这说明浓度是会进一步影响测值结果。
表3
样本编号 样本 浓缩后测值结果 未浓缩测值结果 临床诊断结果
1 正常人 12.81 12.13 阴性
2 患者 36.44 27.19 阳性
3 患者 56.23 51.02 阳性
4 正常人 1.77 1.29 阴性
5 正常人 2.10 1.62 阴性
6 正常人 3.84 3.15 阴性
7 正常人 5.63 4.18 阴性
8 正常人 2.06 2.02 阴性
9 患者 5.87 3.34 阳性
10 患者 61.26 49.29 阳性
11 正常人 6.61 5.17 阴性
12 正常人 4.01 3.26 阴性
13 患者 47.21 37.12 阳性
14 正常人 4.32 3.87 阴性
15 患者 33.10 30.09 阳性
16 正常人 3.16 2.21 阴性
17 正常人 1.22 0.96 阴性
18 患者 91.02 67.23 阳性
19 患者 62.30 36.21 阳性
20 患者 36.33 29.32 阳性
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，其特征在于，所述浓缩装置包括封闭型壳体，所述壳体内安装有恒温室，所述恒温室内套设有废液收集室，所述废液收集室内套设有离心室，所述离心室的侧壁为疏水膜，所述恒温室与废液收集室之间设有硝酸锌晶体保温层，所述离心室内卡设有标记膜；所述恒温室、废液收集室和离心室均为中空的圆柱形结构；
将可柔性汗液收集器或直接采集到的汗液加入用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩反应装置内，加入缓冲液，混合均匀，通电后进行充分反应，待加热后硝酸锌晶体达到熔点融化后接触到底部反应片触发离心室开始离心。
2.如权利要求1所述的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，其特征在于，所述标记膜与所述疏水膜固定连接；所述离心室内卡设有可恰好浸泡于缓冲液中的标记膜；还包括动力机构，所述动力机构通过轴承连接于所述壳体。
3.如权利要求1所述的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，其特征在于，所述疏水膜的孔径小于200nm。
4.如权利要求1所述的用于收集汗液中全程C-反应蛋白的浓缩装置，其特征在于，所述标记膜上标记有乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体、乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体；所述乳胶荧光微球标记的一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体和乳胶荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:0.2~4；所述标记膜为硝酸纤维素膜。
5.一种汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的浓缩装置和C-反应蛋白免疫层析检测卡。
6.如权利要求5所述的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述C-反应蛋白免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有另一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的加样垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线。
7.如权利要求5所述的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述另一株鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体与羊抗兔多克隆抗体的划膜浓度比为（1-2）：（1-2）。
8.如权利要求6所述的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述C-反应蛋白免疫层析检测卡还包括用于卡设试纸条的卡壳；所述卡壳包括：
底槽，其连接于所述PVC板；
上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述加样垫上加样的加样孔；
观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
9.一种权利要求5-8任一项所述的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将所采取的汗液与缓冲液按照1~10:10的比例进行混合；
2）取30~100 μL步骤1）中稀释后的样本滴加到C-反应蛋白免疫层析检测卡的加样孔中，室温静置5~20 min，然后将C-反应蛋白免疫层析检测卡插入到荧光免疫分析仪进行检测，可即时获得检测结果。
10.如权利要求9所述的汗液中全程C-反应蛋白的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述汗液样本选自额头、脖颈或腋下。
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