CN113005178A - 一种rna文库的构建方法及试剂盒 - Google Patents
一种rna文库的构建方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113005178A CN113005178A CN202110493902.3A CN202110493902A CN113005178A CN 113005178 A CN113005178 A CN 113005178A CN 202110493902 A CN202110493902 A CN 202110493902A CN 113005178 A CN113005178 A CN 113005178A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- reverse transcription
- probe
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 34
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请属于基因检测技术领域，具体公开一种RNA文库的构建方法，包括如下步骤：向片段化的总RNA中加入能够与rRNA特异性结合的探针，孵育，所述探针不带接头序列；加入逆转录体系进行第一次逆转录；加入带有接头序列的随机引物进行第二次逆转录，得到逆转录产物；加入连接引物和连接酶将所述逆转录产物进行连接，得到连接产物；加入扩增引物，对所述连接产物进行PCR扩增，得到所述RNA文库。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的构建方法通过先加入能够与rRNA特异性结合的探针，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，使核糖体RNA无法进行扩增，从而达到了去除的目的。
Description
技术领域
本申请属于基因测序技术领域，更具体地说，它涉及一种RNA文库的构建方法及试剂盒。
背景技术
转录组测序技术，RNA-seq是研究生物基因表达的重要工具，该技术广泛应用于不同物种的基因表达图谱分析中。近年来出现的RNA-seq建库试剂盒主要侧重于RNA链特异性研究，文库建库过程需要提取总RNA并富集mRNA，通过逆转录合成第一链cDNA，使用dUTP合成第二链cDNA，随后进行双链cDNA的末端补平、加腺嘌呤A碱基再进行接头连接，消化含尿嘧啶U碱基的cDNA后通过PCR扩增完成建库。
其具体的建库过程如下：
(1)添加dUTP合成双链cDNA，通过尿嘧啶U碱基区分链特异性；
(2)对cDNA进行末端补平修复及对cDNA的3’端加腺嘌呤A碱基，保证cDNA双链的3’端含有A碱基悬挂进而配合接头的3’端胸腺嘧啶T碱基实现TA连接完成建库；
(3)需要设计两条单链接头并退火形成双链，且含有硫代硫酸酯键修饰，保证接头T碱基不会脱落，才能进行有效接头连接；
(4)最后，在进行PCR之前还需对含有尿嘧啶U碱基的cDNA第二链进行消化才能实现链特异性建库。
在病原微生物的检测中，由于无法对病毒和原核生物进行mRNA富集，所以其中大量的片段为人源宿主的rRNA，通常比例在80-90%。此外，非人源的物种，真核和原核生物的核糖体区域保守性较高，物种间差异通常在个位数碱基，通常难以用于短片段进行物种的分型。因此，在病原微生物检测过程中，使用核糖体去除试剂盒，对核糖体进行特异性的探针结合，并使用RNaseH酶进行消化，反应结束后，使用DNaseI酶进行DNA探针消化，反应产物再进行磁珠纯化。
由于核糖体去除流程需要两次酶反应，并需要纯化后进行后续试验，整体流程需要1~2h，且成本较高；对设备和操作要求较高，如果反应不全，结果影响较大。
发明内容
为了降低成本，本申请提供一种RNA文库的构建方法，该方法通过将能够与rRNA特异性结合的探针先加入片段化的总RNA中，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，使得对于探针以及随机引物的设计不再受到序列的限制，可以在保守区域设计探针，不用覆盖非保守区域，避免了物种间序列的差异导致的探针结合效果不佳，设计更加简单。
本申请是通过以下方案实现的：
本申请提供了一种RNA文库的构建方法，包括如下步骤：
向片段化的总RNA中加入能够与rRNA特异性结合的探针，孵育，所述探针不带接头序列；
加入逆转录体系进行第一次逆转录；
加入带有接头序列的随机引物进行第二次逆转录，得到逆转录产物；
加入连接引物和连接酶将所述逆转录产物进行连接，得到连接产物；
加入扩增引物，对所述连接产物进行PCR扩增，得到所述RNA文库。
本申请通过先加入能够与rRNA特异性结合的探针，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，然后再加入带有接头序列的随机引物，使得随机引物无法与rRNA结合，在逆转录过程中，探针生成不带接头序列的DNA链，而随机引物生成带有接头序列的DNA链，在后期建库过程中，不带接头序列的DNA链，无法进行扩增，从而达到了去除的目的。
相较于设计经dU修饰的探针，本申请中只设计能够与核糖体结合的特异性探针，无需dU修饰，其设计难度大大降低，可以说引物的设计不再受到限制。而且所需引物的长度减少，所需的引物对也减少，因此探针的设计成本大大降低。
在本申请的一个具体实施方式中，所述探针的长度为5-45bp。优选地，所述探针的长度为7-35bp。更优选地，所述探针的长度为7-28bp。进一步优选地，所述探针的长度为7-22bp。
在本申请的一个具体实施方式中，所述片段化的总RNA通过以下步骤得到：使用Mg2+进行RNA片段化，Mg2+的终浓度为15~60mM，70~95℃，处理时间为3-12min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述孵育的条件为60℃ 5min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第一次逆转录条件为：42℃ 10min。
本申请中，通过加入探针的孵育使得探针特异性地结合在核糖体RNA上，通过第一次逆转录使得核糖体RNA逆转录为完整的双链，无法与随机引物相结合，由于探针不含有接头序列，因此，探针所扩增出核糖体RNA无法被建成文库。
本申请中，所述随机引物的接头序列可以根据实际需要进行设计。例如，本申请中采用Illuminate公司提供的平台进行测序，因此本申请中的随机引物序列为ACGCTCTTCCGATCT+NNNNNN，其中ACGCTCTTCCGATCT为接头序列。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第二次逆转录的条件为25℃ 10min；42℃30min；70℃ 15min；4℃ hold。
在本申请的一个具体实施方式中，所述逆转录酶可以采用商业化的试剂盒。例如，逆转录酶为M-MLV 逆转录酶（Invitrogen™）。
在本申请的一个具体实施方式中，所述的连接酶为5’App DNA/RNA热稳定连接酶。5’App DNA/RNA热稳定连接酶可以高效特异性的连接带有腺苷酸化5’端的单链DNA和带有3’端羟基的单链DNA，避免了cDNA片段的自连以及cDNA连接到接头引物的3’端等错误连接模式。
在本申请的一个具体实施方式中，所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、第一文库标签序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、第二文库标签序列以及下游测序引物序列，其中，所述下游测序引物序列与所述随机引物的5’端的至少部分序列相同或互补，所述上游测序引物序列与所述连接引物的5’端的至少部分序列相同或互补。
在本申请的一个具体实施方式中，所述扩增引物序列为：
上游引物：
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
下游引物：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，
其中XXXXXXXX为index序列。
本申请另一方面提供一种试剂盒，其包括上述所述的探针、随机引物、连接引物和扩增引物中的一种或多种。
本申请提供的构建方法至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的构建方法通过先加入能够与rRNA特异性结合的探针，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，然后再加入带有接头序列的随机引物，使得随机引物无法与rRNA结合，在逆转录过程中，探针生成不带接头序列的DNA链，而随机引物生成带有接头序列的DNA链，在后期建库过程中，不带接头序列的DNA链，无法进行扩增，从而达到了去除的目的。
附图说明
图1为本申请实施例中提供的构建RNA文库的流程示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 RNA文库的构建
如图1所示为本实施例中RNA文库的构建流程示意图。图中，“×”表示，无法结合或无法进行反应。
如图1所示，本实施例中RNA文库的构建过程如下：
1. 采用RNA片段化试剂盒（Invitrogen，货号：AM8740）打断总RNA（1ng/uL）。
按照下表1配制打断mix。
表1：打断mix
在冰盒上配制mix，使用移液器进行混匀，94℃加热5min，完成RNA片段化反应，形成片段化RNA。
2.逆转录：采用逆转录试剂盒（SuperScript IV 逆转录酶 Invitrogen，货号:18090200）进行逆转录反应。
2.1 按照下表2配制逆转录mix。
表2 逆转录mix
Probe mix中的探针（probe）的序列如下表3所示：
表3 探针序列
2.2 将逆转录mix在PCR仪上进行60℃孵育5min后，降温至42℃，加入1ul逆转录酶，延伸10min，进行第一次逆转录，此时，特异性的探针与rRNA结合，通过逆转录酶延伸rRNA，也即图1中的封闭。
2.3第一次逆转录完成之后，在逆转录mix中再加入1ul带有接头的随机引物，按照如下表4中的程序进行第二次逆转录得到逆转录产物。
表4 第二次逆转录程序
| 温度 | 时间 |
| 25℃ | 10min |
| 42℃ | 30min |
| 70℃ | 15min |
| 4℃ | Hold |
随机引物的序列为：ACGCTCTTCCGATCT+NNNNNN，其中，ACGCTCTTCCGATCT为接头序列，N为A、T、C、G四种碱基的兼并碱基。
如图1所示，带有接头的随机引物无法与rRNA结合，只能与目标RNA结合，并在逆转录酶的作用下，延伸目标RNA。
2.4 采用VAHTS DNA Clean Beads（VAHTS DNA磁珠）试剂盒（诺唯赞，货号：N411）纯化逆转录产物。
在逆转录产物中加入30ul Nuclear Free水，再加入1.8倍体积DNA磁珠90ul，吸打混匀后静置5min，置于磁力架上至澄清，弃去上清。
使用200ul新鲜的80%乙醇清洗磁珠，清洗两次后，使用12ul Low TE洗脱磁珠得到纯化后的逆转录产物，备用。
2.5 采用DNA/RNA连接酶（NEB M0319）进行接头连接。
按照表5配制连接mix。
表5 连接mix
| 组分 | 体积ul |
| 连接引物 | 2 |
| Buffer | 2 |
| 连接酶 | 2 |
| MnCl<sub>2</sub> | 2 |
| 逆转录产物 | 12 |
连接引物：caagcagaagacggcatacgagat，其中5’端腺苷酸化。
取纯化后的逆转录产物10ul，置于95℃ 预热的PCR仪上，处理2min，反应结束后，迅速转移至冰上静置2min；其后加入连接mix，吸打混匀，按照表6的程序进行PCR反应得到连接产物。
表6 PCR反应程序：
| 温度 | 时间 |
| 65℃ | 30min |
| 95℃ | 3min |
| 4℃ | Hold |
如图1所示，目标RNA与rRNA均进行连接。
2.6 PCR扩增
向连接产物中加入1ul UDI引物（Swift Unique Dual Indexing UDI Kit, Cat.No. X9096）和4ul 水，25ul PCR master mix，吸打混匀，按照表7程序进行PCR扩增。
表7 PCR扩增运行程序
UDI引物中：
上游引物：
gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacxxxxxxxxatctcgtatgccgtcttctgcttg；
下游引物：
aatgatacggcgaccaccgagatctacacxxxxxxxxacactctttccctacacgacgctcttccgatc；
其中xxxxxxxx为index序列。
Index序列如表8所示。
表8 index序列
如图1所示，由于用于扩增rRNA的引物不含有接头序列，因此，扩增时无法扩增，只有目标RNA被扩增，而且由于其不含有接头序列，因此也无法进行后续的测序。
实施例2 应用
采用实施例1中的RNA文库构建方法构建人源RNA文库。构建三个不同的样本（分别为肺泡灌洗液标记为1、胸腔积液标记为2、血液标记为3）的RNA文库。三个不同的样本的index分别对应于表8中的1，2和3（见表9所示），与不去核糖体建库方法和RNaseH酶建库方法进行比较，其实验结果如下表10所示。
表9 不同样本的UDI引物
表10 不同建库方法的对比
| 不去核糖体建库 | RNaseH酶建库 | 实施例1 | |
| 1 | 66.14 | 8.13 | 10.93 |
| 2 | 72.81 | 2.5 | 6.65 |
| 3 | 62.71 | 5.65 | 8.69 |
由表10可知，实施例1中提供的RNA文库的构建方法，可以有效降低人源核糖体比例，其去除效率略低于RNaseH酶，但是实验时间大幅缩短（无需酶切，整个建库时间节约了约1-2h）。
综上，本申请提供的RNA文库的构建方法，其通过利用特异性引物与核糖体RNA特异性地结合进而封闭核糖体RNA，使得带有接头序列的随机引物无法与核糖体RNA结合，以达到去除核糖体RNA的目的。该方法对于探针的要求更低，探针的设计不再受到序列的限制，无需对探针进行修饰等，而且所需的探针数量减少，探针的长度变短，整个建库所需的时间缩短，有利于后期的推广应用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 探因医学科技（浙江）有限公司
<120> 一种RNA文库的构建方法及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 1
<400> 1
tggttttgat ctgataaatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 2
<400> 2
gcgcgcctgc tgccttcctt 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 3
<400> 3
ggcctgcttt gaacactcta at 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 4
<400> 4
cttccgtcaa ttcctttaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 5
<400> 5
tccgcaggtt cacctacgga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 6
<400> 6
acctcttaac ggtttcacgc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 7
<400> 7
gctccagcgc catccatttt c 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 8
<400> 8
acggatccgg cttgccga 18
<210> 9
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 9
<400> 9
cgggggg 7
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Probe 10
<400> 10
gcggcgctgc cgtatcgt 18
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 11
acgctcttcc gatct 15
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接引物
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物1
<400> 13
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccaacaca gatctcgtat gccgtcttct 60
gcttg 65
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物1
<400> 14
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgtgaagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 15
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物2
<400> 15
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacacacctc aatctcgtat gccgtcttct 60
gcttg 65
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物2
<400> 16
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttgggtgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 17
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物3
<400> 17
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacaccatag gatctcgtat gccgtcttct 60
gcttg 65
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物3
<400> 18
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc acttcgaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
Claims (10)
1.一种RNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
向片段化的总RNA中加入能够与rRNA特异性结合的探针，孵育，所述探针不带接头序列；
加入逆转录体系进行第一次逆转录；
加入带有接头序列的随机引物进行第二次逆转录，得到逆转录产物；
加入连接引物和连接酶将所述逆转录产物进行连接，得到连接产物；
加入扩增引物，对所述连接产物进行PCR扩增，得到所述RNA文库。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述孵育的条件为：60℃ 5min。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一次逆转录条件为：42℃10min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述探针长度为5-45bp。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述接头序列为ACGCTCTTCCGATCT。
6. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述连接酶为5’App DNA/RNA热稳定连接酶。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述连接引物为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT，其中，连接引物的5'端腺苷酸化。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、第一文库标签序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、第二文库标签序列以及下游测序引物序列，其中，所述下游测序引物序列与所述随机引物的5’端的至少部分序列相同或互补，所述上游测序引物序列与所述连接引物的5’端的至少部分序列相同或互补。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述扩增引物序列为：
上游引物：
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
下游引物：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，
其中XXXXXXXX为index序列。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1-9中任一项所述的探针、随机引物、连接引物和扩增引物中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110493902.3A CN113005178B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110493902.3A CN113005178B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113005178A true CN113005178A (zh) | 2021-06-22 |
| CN113005178B CN113005178B (zh) | 2023-08-11 |
Family
ID=76380692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110493902.3A Active CN113005178B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113005178B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667481A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法 |
| CN108350492A (zh) * | 2015-11-05 | 2018-07-31 | 通用电气公司 | 连接酶辅助的核酸环化和扩增 |
| CN109563541A (zh) * | 2016-06-30 | 2019-04-02 | 格里尔公司 | 用于制备无细胞dna/rna定序库的rna差异性标记方法 |
| CN112176422A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-05 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | Rna文库的构建方法 |
| CN112626176A (zh) * | 2021-03-10 | 2021-04-09 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 用于rna建库中快速去除靶rna的逆转录阻碍探针及其应用 |
-
2021
- 2021-05-07 CN CN202110493902.3A patent/CN113005178B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667481A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法 |
| CN108350492A (zh) * | 2015-11-05 | 2018-07-31 | 通用电气公司 | 连接酶辅助的核酸环化和扩增 |
| CN109563541A (zh) * | 2016-06-30 | 2019-04-02 | 格里尔公司 | 用于制备无细胞dna/rna定序库的rna差异性标记方法 |
| CN112176422A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-05 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | Rna文库的构建方法 |
| CN112626176A (zh) * | 2021-03-10 | 2021-04-09 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 用于rna建库中快速去除靶rna的逆转录阻碍探针及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PETER H. CULVINER等: "A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies", 《MBIO》 * |
| 黄佳莹等: "食源性致病菌核糖体RNA高效去除体系的建立", 《南京农业大学学报》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113005178B (zh) | 2023-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106795514B (zh) | 泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用 | |
| CN105400776B (zh) | 寡核苷酸接头及其在构建核酸测序单链环状文库中的应用 | |
| Van Dijk et al. | Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias | |
| Adey et al. | Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition | |
| EP3907296A1 (en) | Gene target region enrichment method and kit | |
| WO2021184146A1 (zh) | 一种待测样本rna的测序文库的构建方法 | |
| CN112176031A (zh) | 一种去核糖体rna测序文库的构建方法及试剂盒 | |
| CN113106145A (zh) | 用于制备核酸文库的组合物和方法 | |
| CN112251821A (zh) | 一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒 | |
| CN112941635A (zh) | 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 | |
| WO2023202030A1 (zh) | 一种小分子rna的高通量测序文库构建方法 | |
| WO2023098492A1 (zh) | 测序文库构建方法及应用 | |
| WO2023193748A1 (zh) | 基于crispr技术的靶基因捕获的方法 | |
| CN111005074A (zh) | 一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用 | |
| CN113249437A (zh) | 一种用于sRNA测序的建库方法 | |
| WO2021051665A1 (zh) | 基因目标区域的富集方法及体系 | |
| WO2017215517A1 (zh) | 测序文库构建中5'和3'接头连接副产物的去除方法 | |
| CN111433359B (zh) | 制备cDNA文库的方法 | |
| CN110846383B (zh) | 构建mRNA文库的方法及试剂盒 | |
| CN110951827B (zh) | 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用 | |
| CN113005178A (zh) | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 | |
| CN113201793A (zh) | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 | |
| CN112176422B (zh) | Rna文库的构建方法 | |
| Scacchetti et al. | A ligation-independent sequencing method reveals tRNA-derived RNAs with blocked 3’termini | |
| CN114808148A (zh) | 一种dna文库构建试剂盒、文库构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230914 Address after: 318000 Baita Industrial Cluster, Baita Town, Xianju County, Taizhou City, Zhejiang Province Patentee after: Tanyin medical technology (Zhejiang) Co.,Ltd. Patentee after: Shanghai Tanyin Medical Laboratory Co.,Ltd. Address before: 317300 Baita Industrial Cluster, Baita Town, Xianju County, Taizhou City, Zhejiang Province Patentee before: Tanyin medical technology (Zhejiang) Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Method and Kit for Constructing RNA Library Granted publication date: 20230811 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Shanghai Yangtze River Delta Integrated Demonstration Zone Sub branch Pledgor: Shanghai Tanyin Medical Laboratory Co.,Ltd. Registration number: Y2024310000181 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20230811 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Shanghai Yangtze River Delta Integrated Demonstration Zone Sub branch Pledgor: Shanghai Tanyin Medical Laboratory Co.,Ltd. Registration number: Y2024310000181 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method and kit for constructing an RNA library Granted publication date: 20230811 Pledgee: Bohai Bank Co.,Ltd. Shanghai Branch Pledgor: Shanghai Tanyin Medical Laboratory Co.,Ltd.|Tanyin medical technology (Zhejiang) Co.,Ltd.|Tanyin Medical Technology (Shanghai) Co.,Ltd. Registration number: Y2024310000703 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |