CN113005087B - 小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法。本发明对贴壁用细胞外基质进行了筛选，获得适合小鼠耳蜗螺旋器贴壁的基质。采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被，获得了更好的贴壁效果，可使得小鼠耳蜗螺旋器细胞存活至8天。并且，在贴壁培养的过程中，使用添加凝血酶敏感蛋白‑1（TSP‑1）的无血清培养基作为补料，可获得更佳的细胞贴壁培养效果，包含小鼠耳蜗螺旋器的基底膜在贴壁培养的第8天内外毛细胞仍然保持良好的形态，且培养至10天细胞仍然存活。

Description

小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法。

背景技术

听觉异常是人类发生率最高的残疾之一，大多数听力丧失的病例都存在基因缺陷。有数十个基因位点分别和显性与隐性耳聋有关，这些耳聋基因许多表达于耳蜗毛细胞和支持细胞，所以毛细胞所导致的听力丧失是耳聋的主要原因。螺旋器，又称柯蒂氏器、柯替氏器(organ of Corti)。螺旋器内含有特殊的感觉上皮细胞，即毛细胞，可以将通过外耳和中耳传入内耳基底膜的声能转化为神经冲动传入大脑。耳蜗螺旋器是一个高度组织化的镶嵌体结构，由于内耳很小，而且组织细胞有限，非常难以分离和纯化，这严重妨碍和限制了对听觉、耳蜗的分子细胞生物学和遗传学的研究。因此，对于包含毛细胞的螺旋器的体外培养对于进一步研究听觉异常是非常有意义的，是一种理想的耳科实验造模方法。

在进行体外培养试验时，一般采用小鼠作为实验对象，为了获得稳定的实验材料，需要对小鼠包含耳蜗毛细胞的螺旋器进行体外培养，因此快速获得体外培养细胞，并且可以在体外条件下保证螺旋器的生物活性非常重要。但小鼠耳蜗较小，进行细胞分离及培养难度较大。

现有的耳蜗螺旋器体外培养方法包含贴壁培养法和立体培养法，贴壁培养法更便于操作。然而现有的贴壁培养法仍存在诸多不足之处。原代细胞体外培养成功的第一步有赖于细胞是否及时贴壁生长。为使培养的细胞很好地贴覆于培养皿上，就必须在培养皿表面涂一层细胞外基质，在耳蜗螺旋器培养过程中，一般采用鼠尾胶包被培养皿，但是往往包被效果并不理想，因此本领域存在寻求更好包被基质的需求。此外，贴壁效果对于耳蜗螺旋器体外培养非常重要，其影响了毛细胞的生长状态、存活时间等指标，因此探索更好地提升贴壁效果、进而提高螺旋器细胞培养效果的包被基质是非常必要的。

对于贴壁用细胞外基质，在耳蜗螺旋器的体外培养中，各种基质的粘附效果不尽相同，而且基质本身也影响耳蜗螺旋器细胞的生长状态。需要筛选适合耳蜗螺旋器细胞粘附和生长的基质。本发明将鼠尾胶与纤维粘连蛋白、多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸进行组合筛选，以期筛选出最适合耳蜗螺旋器体外培养的包被基质。

此外，在耳蜗螺旋器培养的培养过程中，仍需要保持细胞较好的贴壁和生长状态，添加适当培养物质作为补料非常有必要。对现有技术检索发现，凝血酶敏感蛋白-1(thrombin-sensitive protein，Thrombospodin-1，TSP-1) （序列信息见UniProtKB -P07996）主要存在于血小板α颗粒中，在许多正常细胞及肿瘤细胞中均有广泛的表达。TSP-1是一种重要的细胞外基质糖蛋白。TSP-1的生物学功能很复杂，有报道称在体内，TSP-1可以促进细胞的粘附、增殖、血管新生及肿瘤生长。但现有技术并没有公开或暗示TSP-1在体外对细胞培养的作用，特别是对于耳蜗螺旋器体外贴壁培养的作用。本发明通过实验发现，将TSP-1作为培养基补料成分，在体外培养小鼠耳蜗螺旋器时使用，可达到更好的细胞贴壁和生长状态更优效果，且进一步对细胞存活时间具有正向作用。

发明内容

针对如上所述现有技术中耳蜗螺旋器体外贴壁培养方法的不足，本发明的目的是提供一种改进的新生小鼠耳蜗螺旋器体外贴壁培养方法.

本发明一方面提供一种小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）将小鼠断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出耳蜗，获得带前庭底座的小鼠耳蜗；

（2）去除耳蜗顶后侧及顶转薄层骨壁，得到去除局部骨壁后的耳蜗，由耳蜗顶转至底转剥除耳蜗表面骨壁，可得去除外周骨质耳蜗膜迷路；

（3）去除螺旋韧带、血管纹、盖膜周边组织，去除耳蜗蜗轴的螺旋神经节，沿蜗顶螺旋向下，分段分离出基底膜，即得包含螺旋器的基底膜；

（4）培养：以鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质，包被培养皿；在包被好的培养皿中加入无血清培养基，将步骤（3）分离得到的小鼠耳蜗基底膜移入，37℃、5 %CO₂培养箱中培养，次日补加适量包含TSP-1的补料培养基，之后隔日更换补料培养基，培养8-10天。

在一个优选实施方案中，步骤（4）中补料培养基中TSP-1的终浓度为5mM，优选地，补料培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1%的N2补料，体积百分比为2%的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为5mM的TSP-1。

在一个优选实施方案中，步骤（4）中无血清培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1%的N2补料，体积百分比为2%的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素。

在一个优选实施方案中，步骤（4）中培养天数为10天。

在一个优选实施方案中，步骤（4）中培养天数为8天。

在一个优选实施方案中，步骤（4）具体为：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，与100μg/ml多聚鸟氨酸等体积混合，混合均匀，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置1小时后，吸干培养皿内液体，再以PBS冲洗，自然晾干，备用；取适量无血清培养液加入到包被好的培养皿中，将步骤（3）分离得到的小鼠耳蜗基底膜移入，使其网状面朝上且平铺，下沉到培养皿底部，最后将培养皿缓慢移入 37℃、5 %CO₂培养箱，进行培养，次日补加适量包含终浓度为5mM的TSP-1补料培养基，以后隔日更换补料培养基，总计培养10天。

在一个优选实施方案中，所述小鼠是出生后3-5天的新生小鼠。

在一个优选实施方案中，步骤（2）在解剖显微镜下进行。

在一个优选实施方案中，所述方法在耳蜗螺旋器的培养阶段，采用免疫染色标记Myo7a方法观察耳蜗基底膜螺旋器组织以及毛细胞活性。

在一个优选实施方案中，所述免疫染色标记Myo7a方法包括：

1）将培养的耳蜗螺旋器移除培养液，加入2ml 4% 的福尔马林固定液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

2）加入2ml 0.1%的PBS配制的Triton x-100溶液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

3）加入2ml 2.5%的PBS配制的BSA溶液，室温放置30分钟后用PBS洗去；

4）一抗孵育，其为Rabbit anti-Myo7a 1:200，2.5% BSA于PBS中，4°C过夜；

5）用PBS洗去一抗，加入二抗，其为Alexa Fluor 546 goat-anti Rabbit IgG 1:1000, 2.5% BSA于PBS中，室温放置2小时；

6）用PBS洗去二抗，后用荧光显微镜进行观察、拍照。

本发明的有益效果：

（1）本发明的小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法，采用的分离小鼠耳蜗螺旋器步骤操作容易；

（2）本发明对多种贴壁用细胞外基质进行了组合、筛选，实验证明采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被，获得了更好的贴壁效果，可使得小鼠耳蜗螺旋器在体外进行无血清培养时，毛细胞存活至8天；

（3）在采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被的基础上，在小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养的过程中，使用添加凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）的无血清培养基作为补料，可获得更佳的细胞贴壁培养效果，包含小鼠耳蜗螺旋器的基底膜在贴壁培养的第8天内外毛细胞仍然保持良好的形态，且培养至10天细胞仍然存活。

附图说明

图1 包含螺旋器的耳蜗基底膜。

图2 正常贴壁的基底膜显微镜图（Scale bar: 50μm）。

图3 贴壁生长效果更优的基底膜显微镜图（Scale bar: 50μm）。

图4 实验1组培养的基底膜Myo7a染色显微镜图（Scale bar: 20μm）。

图5 实验1组培养第8天的毛细胞Myo7a染色显微镜图（Scale bar: 20μm）。

图6 实验1组培养第10天的毛细胞Myo7a染色显微镜图（Scale bar: 20μm）。

图7 实验2组培养第6天的毛细胞Myo7a染色显微镜图（Scale bar: 20μm）。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 小鼠耳蜗螺旋器的分离

选择出生后3-5天的C57BL/6J小鼠作为实验材料，断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出带前庭底座的小鼠耳蜗。

解剖显微镜下去除耳蜗顶后侧及顶转薄层骨壁，得到去除局部骨壁后的耳蜗，其顶转血管纹螺旋韧带暴露清晰可见。由耳蜗顶转至底转剥除耳蜗表面骨壁，即可得去除外周骨质耳蜗膜迷路，去除螺旋韧带、血管纹、盖膜等周边组织，去除耳蜗蜗轴的螺旋神经节，沿蜗顶螺旋向下，分段分离出包含螺旋器的基底膜，如图1即为包含螺旋器的基底膜。

实施例2 适合基底膜贴壁的基质筛选

将小鼠耳蜗基底膜进行培养，获得细胞球，将细胞球细胞贴壁于不同的基质上，观察基质对于细胞球粘附及生长作用。

试剂：DMEM/F12、N2、B27添加剂购买于美国Gibco公司。鼠尾胶购买于BD公司。多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸以及牛纤维粘连蛋白购买于美国Sigma公司。

基质包被与分组：为了观察不同基质对细胞球贴壁的影响，先将盖玻片用不同的基质包被，盖玻片的包被方法是：将洗净的盖玻片进行高压灭菌消毒后，在超净台内，置于35mm培养皿内，上面分别滴加不同的基质，再均匀涂于盖玻片表面，在室温下自然晾干，立即接种细胞球。依据盖玻片表面包被基质的不同，分为以下4个实验组：

表1 基质包被与分组

	实验组1（鼠尾胶）	实验组2（鼠尾胶+纤维粘连蛋白）	实验组3（鼠尾胶+多聚鸟氨酸）	实验组4（鼠尾胶+多聚赖氨酸）
					基质	将鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，取稀释液滴加30μl包被。	取实验组1的稀释液15μl+0.1%牛纤维粘连蛋白15μl，滴加包被。	取实验组1的稀释液15μl+100μg/ml多聚鸟氨酸15μl，滴加包被。	取实验组1的稀释液15μl+100μg/ml多聚赖氨酸15μl，滴加包被。

耳蜗基底膜细胞球的获得：将小鼠耳蜗基底膜进行无血清培养基培养（DMEM/F12+N2、B27添加剂）细胞培养，培养至第3天即可见细胞球形成。将细胞球收集，用培养液重悬细胞球，将混匀后的细胞球悬浮液等量地接种于实验组1-4基质包被的盖玻片上。每组接种6张盖玻片，置于培养箱内，37℃，5%CO₂培养16h，吸去培养液，PBS漂洗后，换入新的无血清培养液，在显微镜下定量计数每张盖玻片上贴壁细胞球的数量。

不同基质的细胞球贴壁效果观察，将每张玻片上的细胞球进行计数，计算平均值，并观察细胞生长状态，结果如下：

表2 细胞球贴壁计数及细胞生长状态

	实验组1（鼠尾胶）	实验组2（鼠尾胶+纤维粘连蛋白）	实验组3（鼠尾胶+多聚鸟氨酸）	实验组4（鼠尾胶+多聚赖氨酸）
					细胞球贴壁个数	15±2	25±2	44±3	10±1
细胞生长状态	正常	良好	良好	不良

由上述结果可知，实验组3的基质对于基底膜贴壁培养的效果最好，以其作为包被介质进行下面的小鼠耳蜗螺旋器的贴壁培养，与常规的鼠尾胶包被进行对比，加以验证。

实施例3 小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养的基质验证。

包被培养皿：

实验组1：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置约1小时后，吸干培养皿内鼠尾胶，再以PBS冲洗，自然晾干，备用。

实验组3：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍获得稀释液，与100μg/ml多聚鸟氨酸等体积混合，混合均匀，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置约1小时后，吸干培养皿内鼠尾胶与多聚鸟氨酸的混合溶液，再以PBS冲洗，自然晾干，备用。

无血清培养液的配置：DMEM/F12培养液(Gibco/Invitrogen cat# 11320-033)，体积百分比为1%的N2补料(Gibco/Invitrogen, cat # 17502-048)，体积百分比为2%的B27补料(Gibco/Invitrogen, cat # 12587-010)，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素(Sigma,cat # A5354-10ml)。

贴壁培养：

培养液取 1 ml无血清培养液加入到包被好的实验1组、实验3组培养皿中，将小鼠耳蜗基底膜移入，使其网状面朝上且平铺，下沉到培养皿底部。最后将培养皿缓慢移入37℃、5 %CO₂培养箱，进行培养，次日补加 0.5 ml无血清培养液，以后隔日更换培养液。总计培养3天。

结果：在显微镜下观察，实验组1包含小鼠耳蜗螺旋器的基底膜正常贴壁，如图2所示。实验组3基底膜形态完整，贴壁较实验组1更优，贴壁成功后基底膜附着牢固不易从培养皿上脱落，取出后可得到完整培养的基底膜，且贴壁的外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出，如图3所示。可见，采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被培养皿的实验组3更佳，采用其包被，小鼠耳蜗螺旋器体外培养取得了更好的贴壁效果，相应地细胞生长也更好。以下实验采用实验组3包被。

实施例4 小鼠耳蜗螺旋器体外贴壁培养。

（1）试剂配制

无血清培养液的配置：DMEM/F12培养液，体积百分比为1%的N2补料，体积百分比为2%的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素。

补料培养基的配置：在上述无血清培养液的基础上添加，使得TSP-1（人Thrombospondin-1多肽，购买于abcam）其终浓度为5mM。

补料对照培养基：即不添加TSP-1的上述无血清培养液。

（2）贴壁培养

实验1：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，与100μg/ml多聚鸟氨酸等体积混合，混合均匀，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置约1小时后，吸干培养皿内液体，再以PBS冲洗，自然晾干，备用。培养液取 1 ml无血清培养液加入到包被好的培养皿中，将小鼠耳蜗基底膜移入，使其网状面朝上且平铺，下沉到培养皿底部。最后将培养皿缓慢移入 37 ℃、5 %CO₂培养箱，进行培养，次日补加 0.5 ml补料培养基，以后隔日更换补料培养基。总计培养10天。

实验2：培养过程与实验1一致，差别仅在于使用补料对照培养基替换补料培养基，即使用不添加TSP-1的无血清培养液进行更换补料。

实施例5 螺旋器组织及毛细胞的形态学观察

获取基底膜后，用上述实验1、实验2方法培养24 小时后于倒置显微镜下，观察各实验组下，轮廓形状，以及细胞生长状况。

结果表明：实验1组、实验2组的包含螺旋器的基底膜形态轮廓结构保持正常，状态良好。高倍镜下可见耳蜗内、外毛细胞及支持细胞等结构。

实施例6 螺旋器组织及毛细胞的活性鉴定

采用免疫染色标记Myo7a方法观察耳蜗基底膜螺旋器组织以及毛细胞活性。

免疫染色试剂如下：

福尔马林固定液： Sigma, #HT501128-4L；

PBS：Corning, #21-040-CV；

TritonX-100：Sigma, #X100-100ML；

EDTA：Sigma, #E5134-250G；

BSA：Sigma, #A1933-25G；

Rabbit anti-Myo7a: Proteus Bioscience, #25-6790；

Alexa Fluor 546 Goat anti-Rabbit IgG: Invitrogen, #A11035。

免疫染色步骤：

1）耳蜗螺旋器培养48小时后，移除培养液，加入2ml 4% 的福尔马林固定液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

2）加入2ml 0.1%的Triton x-100（ PBS配制）溶液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

3 ）加入2ml 2.5%的BSA（PBS配制）溶液，室温放置30分钟后用PBS洗去；

4 ）一抗孵育（Rabbit anti-Myo7a 1:200 2.5% BSA in PBS），4°C过夜；

5）用PBS洗去一抗，加入二抗（Alexa Fluor 546 goat-anti Rabbit IgG 1:1000,2.5% BSA in PBS）室温放置2小时；

6）用PBS洗去二抗，后用荧光显微镜进行观察、拍照。

结果：如图4所示，实验1组的基底膜上外毛细胞、内毛细胞清晰可见，无缺损。

实施例7 螺旋器组织及毛细胞存活时间

培养的过程中在倒置显微镜下进行镜检观察耳蜗螺旋器组织以及毛细胞的排列情况。按照实验1组、实验2组的培养方法分别培养，在培养的4天、6天、8天以及10天记录螺旋器组织及毛细胞存活状态，结果如表1所示。

表3螺旋器组织及毛细胞存活状态

（+++代表细胞存活且形态良好，+代表细胞存活但形态不佳，-代表细胞死亡）

培养天数	实验1	实验2
			4天	+++	+++
6天	+++	+
			8天	+++	+
10天	+	-

采用免疫染色标记Myo7a方法染色以及显微镜观察，实验1组在培养的第6天、第8天细胞存活且形态良好。图5显示，在培养的第8天，仍然保持良好的形态，三排外毛细胞和一排内毛细胞排列整齐，细胞轮廓清晰可数。图6显示，虽然培养至10天毛细胞有少量缺失，但仍然存活。实验2组在培养的第6天开始，图7显示，毛细胞开始出现形态不佳，毛细胞有缺失，这种生长状态持续至贴壁培养的第8天，贴壁培养至第10天细胞死亡。

由上述结果可知，采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被，不采用TSP-1补料的实验2组，虽然其对螺旋器上毛细胞的生长和存活效果不如实验1组，但是其仍能使得小鼠耳蜗螺旋器细胞存活至8天，相对于现有技术中一般耳蜗螺旋器体外贴壁培养细胞存活至1周，仍然取得了较佳的培养效果。

由上述结果可知，采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被，并在培养过程使用TSP-1补料的实验1组，小鼠耳蜗螺旋器可获得更好的贴壁培养效果，且细胞生长状态良好，在贴壁培养的第8天仍然保持良好的形态，可以维持内耳毛细胞较好形态8天以上，且培养至10天仍然存活。

Claims (5)

1.一种小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将小鼠断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出耳蜗，获得带前庭底座的小鼠耳蜗；

(2)去除耳蜗顶后侧及顶转薄层骨壁，得到去除局部骨壁后的耳蜗，由耳蜗顶转至底转剥除耳蜗表面骨壁，可得去除外周骨质耳蜗膜迷路；

(3)去除螺旋韧带、血管纹、盖膜周边组织，去除耳蜗蜗轴的螺旋神经节，沿蜗顶螺旋向下，分段分离出基底膜，即得包含螺旋器的基底膜；

(4)培养：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，与100μg/ml多聚鸟氨酸等体积混合，混合均匀，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置1小时后，吸干培养皿内液体，再以PBS冲洗，自然晾干，备用；取适量无血清培养液加入到包被好的培养皿中，将步骤(3)分离得到的小鼠耳蜗基底膜移入，使其网状面朝上且平铺，下沉到培养皿底部，最后将培养皿缓慢移入37℃， 5％CO₂培养箱，进行培养，次日补加适量包含终浓度为5mM的TSP-1补料培养基，以后隔日更换补料培养基，总计培养10天；

步骤(4)中所述补料培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1％的N2补料，体积百分比为2％的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为5mM的TSP-1；

步骤(4)中所述无血清培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1％的N2补料，体积百分比为2％的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠是出生后3-5天的新生小鼠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)在解剖显微镜下进行。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在耳蜗螺旋器的培养阶段，采用免疫染色标记Myo7a方法观察耳蜗基底膜螺旋器组织以及毛细胞活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫染色标记Myo7a方法包括：

1)将培养的耳蜗螺旋器移除培养液，加入2ml 4％的福尔马林固定液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

2)加入2ml 0.1％的PBS配制的Triton x-100溶液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

3)加入2ml 2.5％的PBS配制的BSA溶液，室温放置30分钟后用PBS洗去；

4)一抗孵育，其为Rabbit anti-Myo7a 1:200，2.5％BSA于PBS中，4℃过夜；

5)用PBS洗去一抗，加入二抗，其为Alexa Fluor 546goat-anti Rabbit IgG1:1000,2.5％BSA于PBS中，室温放置2小时；

6)用PBS洗去二抗，后用荧光显微镜进行观察、拍照。

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