CN113004200A

CN113004200A - 基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针及其制备和应用

Info

Publication number: CN113004200A
Application number: CN202110152375.XA
Authority: CN
Inventors: 周戚; 周弈宇; 李娜; 林恩勇; 杨仲毅; 谢振达
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN113004200B

Abstract

本申请公开了一种基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针，结构式如式(I)所示：

Description

基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及活性小分子和pH检测应用领域，具体而言，涉及一种基于萘酰亚胺衍生物的甲醛和pH双响应型探针及其制备和应用。

背景技术

作为典型的D-π-A荧光染料，萘酰亚胺衍生物具有良好的共轭体系、较好的光稳定性、大的斯托克斯位移/反斯托克斯位移等优点。另外，萘酰亚胺衍生物经济易得，可修饰位点多，易于设计并制备各类性能优异的探针。具体来说，以萘酰亚胺衍生物为信号基团的探针已被广泛用于环境、食品和生命科学等领域的酶、活性碳簇、活性氧簇、活性氮簇、生物硫醇、离子和内环境参数等的可视化。然而，多数基于萘酰亚胺衍生物的探针只能特异性识别单一分析物，不符合当下提高化合物的“原子经济性”和高密度集成的主流学术观点。因此，开发以萘酰亚胺衍生物为探针母核的具有双响应型性能的探针对拓展萘酰亚胺在分析检测领域的应用具有重要的科学价值和应用价值。

作为活性碳簇中最小的成员，甲醛在室内或室外有诸多来源。长时间暴露在高浓度甲醛环境下可引发多种疾病。在许多坏死或者凋亡的细胞和组织中发现过高的甲醛浓度，随之可引发各种病理特征，例如白血病、神经退行性疾病、阿尔兹海默症、慢性肝脏和心脏疾病。

pH是生态平衡的重要参数之一。从宏观层面看，生活用水、土壤、河流等样品的pH也影响着动植物的生长状态。2006年，我国颁布《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)，规定饮用水的pH值应为6.5-8.5之间，保障人体的饮食健康。土壤中的pH直接影响植物根部细胞的新陈代谢活动，从而影响植物根部的渗透压，可能导致植物失水，已有文献证明，最适合植物生长的pH值范围一般在5-8之间。另外，土壤或河流中的pH还会影响其中微生物的种类和数量。

综上所述，检测环境中甲醛浓度和pH值具有十分重要的实际意义。

发明内容

本申请提供一种基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针及其制备和应用，探针具有甲醛浓度和pH值双响应特征。

本申请的第一个目的是提供一种基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针，所述甲醛浓度和pH值双响应型探针的结构式如式(I)所示：

本申请的第二个目的是提供一种所述甲醛浓度和pH值双响应型探针的制备方法，包括：

在0℃条件下，将如式(II)所示化合物、溶剂、如式(III)所示化合物、乙酸及还原剂依次加入反应器中，随后应置于20℃～30℃下反应；待反应结束后，将反应液进行分离纯化，获得所述式(I)所示的双响应型探针；

反应式如下：

可选的，式(II)所示化合物、式(III)所示化合物、还原剂与乙酸的物质的量比为1:1～1.5:4:10；所述溶剂为四氢呋喃；所述还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠；反应时间为8～12h。

可选的，所述分离纯化为：反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行柱层析分离，以体积比40:1的二氯甲烷甲醇混合液为展开剂，洗脱目标产物，获得式(I)所示的双响应型探针。

本发明所用式(II)所示化合物为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Xie Z,Ge J,Zhang H,et al.A highly selective two-photon fluorogenic probe forformaldehyde and its bioimaging application in cells and zebrafish[J].Sens.Actuators B,2017,241,1050～1056)。

本发明所用式(III)所示化合物为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Liu C,Zhang R,Zhang W,et al.“Dual-Key-and-Lock”ruthenium complex probe forlysosomal formaldehyde in cancer cells and tumors[J].J.Am.Chem.Soc.,2019,141,8462～8472)。

本申请的第三个目的是提供所述双响应型探针在甲醛浓度和pH值检测中的应用，具体的：

本申请提供一种所述甲醛浓度和pH值双响应型探针在制备检测甲醛浓度的试剂中的应用。

本申请提供一种所述甲醛浓度和pH值双响应型探针在制备检测pH值的试剂中的应用。

本申请提供一种所述甲醛浓度和pH值双响应型探针在制备既可检测甲醛浓度又可检测pH值的试剂中的应用。

本申请还提供一种甲醛浓度或pH值的定量检测方法，用于环境样品等非诊断与治疗目的检测，包括：

(1)将所述甲醛浓度和pH值双响应型探针加入待测溶液中，混匀；

(2)在激发波长为440nm，发射波长为555nm下采集待测溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的甲醛浓度；和/或：在吸收波长为460nm下采集待测溶液的吸光度，根据标准曲线计算得到待测溶液的pH值。

本发明提供的双响应型探针，可对溶液中的甲醛进行定量检测，检测方法包括：

将所述双响应型探针加入待测溶液中，混匀后，在激发波长为440nm，发射波长为555nm下采集待测溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的甲醛浓度。

可选的，待测溶液中加入的双响应型探针的终浓度为0.01mM，与待测溶液的甲醛浓度值为0～4mM时呈良好的线性关系，能够实现对该浓度范围内的待测溶液的甲醛浓度的定量检测。

可选的，标准曲线的制备如下：

将0.01mM荧光探针分别与甲醛浓度在0～4mM内的溶液反应，激发波长为440nm，发射波长为555nm下采集待测溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标、待测溶液甲醛浓度为横坐标，绘制即得线性标准曲线。

本发明提供的双响应型探针，可对溶液中的pH进行定量检测，检测方法包括：

将所述双响应型探针加入待测溶液中，混匀后，在吸收波长为460nm下采集待测溶液的吸光度，根据标准曲线计算得到待测溶液的pH值。

可选的，待测溶液中加入的双响应型探针的终浓度为0.01mM，与待测溶液的pH值为7.25～8.5时呈良好的线性关系，能够实现对该pH值范围内待测溶液中的pH值的定量检测。

可选的，标准曲线的制备如下：

将0.01mM荧光探针分别与pH在7.25～8.5内的溶液反应，吸收波长为485nm下采集待测溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标、待测溶液pH为横坐标，绘制即得线性标准曲线。

相比于现有技术，本申请至少具有如下有益效果之一：

(1)开发具有双/多响应性能的探针可拓展萘酰亚胺衍生物在环境、食品、生命科学等领域的应用，符合当下提高化合物的“原子经济性”和高密度集成的主流学术观点。

(2)本发明的实施拓展了萘酰亚胺衍生物的应用范围，在检测领域具有较好的科研价值和实际应用价值。

(3)本申请提供的双响应型探针的合成机制成熟，制备方法简单，选择性好，可实现溶液中甲醛浓度和pH值进行精准的定量检测。

附图说明

图1为实施例1制备的探针(I)的核磁氢谱。

图2为实施例1制备的探针(I)的高分辨质谱图。

图3为实施例1制备的探针(I)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝4.0，v/v＝1/50)条件下识别甲醛的荧光滴定图及工作曲线图(激发波长440nm，发射波长555nm)。

图4为实施例1制备的探针(I)对常见生物活性分子的抗干扰性图(1-7分别为甲醛、甲基乙二醛、乙醛、高半胱氨酸、半胱氨酸、葡萄糖和丙酮酸钠；激发波长440nm，发射波长555nm)。

图5为实施例1制备的探针(I)加入到不同pH的DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/50)中的紫外-可见光谱图，以及吸光度与pH的线性关系(吸收波长460nm)。

图6为实施例1制备的探针(I)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝9，v/v＝1/50)条件下、不同活性分子参与下的吸光度柱状图。(1-7分别为甲醛、甲基乙二醛、乙醛、高半胱氨酸、半胱氨酸、葡萄糖和丙酮酸钠；吸收波长460nm)。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

以下以具体的实施例进行说明：

实施例1：探针(I)的制备

在0℃条件下，将化合物(II)、无水四氢呋喃、化合物(III)、乙酸以及三乙酰氧基硼氢化钠依次加入到25mL圆底烧瓶中，化合物(II)、化合物(III)、乙酸与三乙酰氧基硼氢化钠按物质的量比1:1.2:10:4，其中化合物(II)为0.2mmol，无水四氢呋喃的用量为5mL。随后在反应温度25℃下搅拌10h。减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇＝40:1，v/v，得到黄色固体51mg，产率为49.2％。其核磁氢谱参见图1，高分辨质谱图参见图2。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃-d)δ8.75(d,J＝2.3Hz,1H),8.57(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),8.33–8.29(m,2H),8.09(d,J＝8.7Hz,1H),7.87(s,1H),7.55(t,J＝7.8Hz,1H),5.91–5.81(m,1H),5.30–5.24(m,2H),4.62(dd,J＝7.8,5.6Hz,1H),4.16–3.93(m,5H),2.83–2.65(m,2H),1.69–1.62(m,2H),1.45–1.39(m,2H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(ESI)calcd.forC₂₇H₂₆N₄O₇[M]^-517.1801,found517.1735.

实施例2：探针(I)(10μM)对甲醛响应的荧光光谱测试。

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.05mM的探针母液，移液枪吸取一定量的探针溶液，加入到PBS缓冲液中，然后加入不同浓度的甲醛，使最终的混合液体系为DMSO/PBS缓冲液(1:50，v:v，pH 4.0)，探针终浓度10μM，甲醛的终浓度分别为0mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM，37℃下反应3h，最后加入到96孔板中用多功能酶标仪测定探针(I)的荧光光谱的变化情况，并做工作曲线图。激发波长440nm，发射波长555nm。

由图3中(a)可知，随着甲醛浓度的增加，探针(I)的荧光强度增强。由此可见，该探针(I)可以对甲醛具有响应能力。由图3中(b)可知，探针(I)在555nm处的荧光强度与甲醛浓度(0～4mM)成良好的线性关系(线性回归方程：y＝53.15x+79.52，R²＝0.99)。

实施例3：探针(I)(10μM)对甲醛的选择性研究

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.05mM的探针母液，移液枪吸取一定量的探针溶液，加入到PBS缓冲液中，然后加入不同活性分子(依次为甲醛、甲基乙二醛、乙醛、高半胱氨酸、半胱氨酸、葡萄糖和丙酮酸钠)，使最终的混合液体系为DMSO/PBS缓冲液(1:50，v:v，pH 4.0)，探针终浓度10μM，其中甲醛、乙二醛、乙醛、葡萄糖和丙酮酸钠的终浓度分别为5mM，高半胱氨酸、半胱氨酸浓度为1mM，37℃下反应3h，最后加入到96孔板中用多功能酶标仪测定探针(I)的荧光光谱的变化情况，并做荧光强度柱状图。激发波长440nm，发射波长555nm。

由图4所示，除甲醛之外的其它相关生物活性分子存在下探针(I)在555nm处的荧光强度基本没有变化，表明其抗干扰能力十分好，即探针(I)对甲醛具有的较好的荧光响应选择性。

实施例4：探针(I)(10μM)对pH响应的紫外-可见光光谱测试。

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.05mM的探针母液，移液枪吸取8μL加入到390μL PBS缓冲液中，配置成DMSO/PBS缓冲液(1:50，v:v，pH依次为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.25、7.5、8.25、8.5、9.0、9.5、11)，使探针终浓度10μM，为摇匀后加入到96孔板中用多功能酶标仪测定探针(I)的紫外-可见光光谱的变化情况，并做相关线性曲线。

由图5中(a)可知，随着pH的降低，探针(I)的吸光度不断增强，在460nm处的荧光强度与pH值在7.25-8.5范围内也呈现良好的线性关系(线性回归方程：Abs＝0.08*[pH]－0.519,R²＝0.99)(图5中(b))。根据Henderson-Hasselbalch方程计算，得出探针的pKa为7.81(图5中(c))。

实施例5：探针(I)(10μM)对pH的选择性研究

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.05mM的探针母液，移液枪吸取8μL加入到390μL含有生物活性分子(依次为甲醛、甲基乙二醛、乙醛、高半胱氨酸、半胱氨酸、葡萄糖和丙酮酸钠)，使最终的混合液体系为DMSO/PBS缓冲液(1:50，v:v，pH 4.0)，探针终浓度10μM，其中甲醛、甲基乙二醛、乙醛、葡萄糖和丙酮酸钠的终浓度分别为5mM，高半胱氨酸、半胱氨酸浓度为1mM，摇匀后加入到96孔板中用多功能酶标仪测定探针(I)的紫外-可见光光谱的变化情况。

荧光图谱见图6。数据表明，在pH为9.0的PBS缓冲液环境下，几个重要生物活性分子对探针(I)的荧光信号的影响不大。以上的实验数据表明探针具有良好的抗干扰能力。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于萘酰亚胺衍生物的甲醛浓度和pH值双响应型探针，其特征在于，所述甲醛浓度和pH值双响应型探针的结构式如式(I)所示：

2.如权利要求1所述甲醛浓度和pH值双响应型探针的制备方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式(II)所示化合物、式(III)所示化合物、还原剂与乙酸的物质的量比为1:1～1.5:4:10；所述溶剂为四氢呋喃；所述还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠；反应时间为8～12h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化为：反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行柱层析分离，以体积比40:1的二氯甲烷甲醇混合液为展开剂，洗脱目标产物，获得式(I)所示的双响应型探针。

5.如权利要求1所述甲醛浓度和pH值双响应型探针在制备检测甲醛浓度和/或pH值的试剂中的应用。

6.一种非诊断与治疗目的的甲醛浓度或pH值的定量检测方法，其特征在于，包括：

(2)在激发波长为440nm，发射波长为555nm下采集待测溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的甲醛浓度；

或：在吸收波长为460nm下采集待测溶液的吸光度，根据标准曲线计算得到待测溶液的pH值。

7.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，检测甲醛浓度时，所述待测溶液中所述甲醛浓度和pH值双响应型探针的终浓度与甲醛浓度比为0.01mM：0～4mM。

8.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，检测pH值时，所述待测溶液中加入的甲醛浓度和pH值双响应型探针的终浓度为0.01mM，待测溶液的pH值为7.25～8.5。