CN112999260A - 一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物及其制备方法和应用，涉及兽药领域。本发明通过碱水提取可使甘草中有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素、酚类等有效成分溶出，同时本方法具有操作简单，成本低、可以规模化生产等优点。用H2O2诱导哺乳动物细胞产生氧化应激，研究制备的甘草提取物对氧化应激损伤细胞的保护作用，从细胞存活率、LDH、ROS、细胞凋亡等与氧化应激损伤相关的指标来看，本发明制备的甘草提取物预先处理细胞能显著降低氧化应激对哺乳动物细胞的损伤。因此，本发明的甘草提取物可能在预防氧化应激对动物健康生长中发挥重要的作用。

Description

一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及兽药领域，具体为一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物及其制备方法和应用。
背景技术
氧化应激(oxidative stress)是指机体在遭受各种有害刺激时，体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基产生过多，氧化程度超出抗氧化防御系统的清除能力。氧化应激产生的过量ROS会损害细胞中脂类、蛋白质和DNA，最终导致细胞凋亡。在集约化养殖中，多种因素均能诱导动物产生氧化应激如断奶应激、冷热应激、运输应激等。氧化应激给动物健康生长带来严重的影响，严重甚至会造成动物死亡。
甘草是一种在人医临床上广泛应用的中药材，具有补中益气、润肺止咳、清热解毒、缓和药性的功效。甘草在临床上通常以煎煮的方式入药，这样会造成甘草中许多不溶于水的有效成分流失，不能充分发挥甘草的药性，还会造成资源的浪费和治疗成本的增加。在集约化养殖中，药物成本一直是企业关注的核心。由于中药制剂成本高、见效慢等原因无法在养殖企业广泛推广，许多养殖企业大量使用抗生素来降低氧化应激对动物的损伤，这样不仅不利于动物的健康，而且抗生素残留也严重威胁着人们的健康。治未病一直是中医药的特色和优势，要发挥中药预防疾病的优势并与现代科学技术结合。因此，为养殖企业提供安全、有效、低价的中药提取物意义重大。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于通过上述制备方法制备得到一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物。
本发明的再一目的在于提供上述降低动物氧化应激损伤的中药提取物的应用，为降低氧化应激对动物健康生长提供一种新的解决办法。
本发明通过碱水提取可使甘草中有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素、酚类等有效成分溶出，同时本方法具有操作简单，成本低、可以规模化生产等优点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)药材准备：称取甘草片，将甘草片粉碎并过筛，得到甘草粉末；
(2)前处理和碱水提取：将甘草粉末加入至氢氧化钠溶液中，浸泡；然后加热至沸腾状态，保温煎煮回流2～3次，每次1～2h；合并提取液；
(3)沉淀：调节提取液PH值至1.0～2.0，冷却至室温，静置，弃去上清液；再用盐酸进行洗涤，过滤得到沉淀；
(4)干燥：将步骤(3)得到的沉淀进行干燥，收集干燥后的粉末即为甘草提取物，即降低动物氧化应激损伤的中药提取物。
优选的，步骤(1)中，所述的过筛为过100～150目筛，进一步为过100目筛。
优选的，步骤(2)中，甘草粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1kg：8～20L；进一步为1kg：8L。
优选的，步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3～0.5mol/L；进一步为0.4mol/L。
优选的，步骤(2)中，所述的浸泡的时间为8～12h；进一步为12h。
优选的，步骤(3)中，PH值采用2mol/L盐酸溶液的进行调节。
优选的，步骤(3)中，静置的时间为8～12h；进一步为12h。
优选的，步骤(4)中，所述的干燥的条件为干燥温度55～60℃，真空度≦-0.08Mpa，干燥时间4～6h。
进一步，真空度为-0.08～-0.01Mpa。
一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物，通过上述制备方法制备得到。
上述降低动物氧化应激损伤的中药提取物在降低氧化应激对哺乳动物细胞的损伤中的应用。
优选的，所述的哺乳动物细胞为腹腔巨噬细胞，进一步为小鼠腹腔巨噬细胞。
优选的，氧化应激为H2O2诱导的氧化应激。
上述降低动物氧化应激损伤的甘草提取物在预防氧化应激对动物健康生长中的应用。
优选的，所述的动物为小鼠。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明用H2O2诱导哺乳动物细胞产生氧化应激，研究制备的甘草提取物对氧化应激损伤细胞的保护作用。从细胞存活率、LDH、ROS、细胞凋亡等与氧化应激损伤相关的指标来看，本发明制备的甘草提取物预先处理细胞能显著降低氧化应激对哺乳动物细胞的损伤。因此，本发明的甘草提取物可能在预防氧化应激对动物健康生长中发挥重要的作用。
附图说明
图1是甘草提取物对H2O2刺激细胞后ROS水平的影响。
图2是甘草提取物对H2O2诱导的细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂、设备等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂、材料和设备。
实施例1
1.甘草提取物的制备方法，具体步骤如下：
1.1.药材准备：称取20kg甘草片，用粉碎机将甘草片粉碎并过100目筛网，得到甘草粉末。
1.2.前处理：将15kg甘草粉末置于提取罐中并加入120L的0.4mol/L氢氧化钠溶液中浸泡12h。
1.3碱水提取：打开提取罐的蒸汽阀门加热至沸腾状态，保温煎煮回流2次，每次2h，合并两次提取液。
1.4沉淀：用2mol/L盐酸溶液调节提取液PH值至1.0～2.0，冷却至室温，静置12h，弃去上清液。再用盐酸进行洗涤，过滤得到沉淀。
1.5干燥：将步骤1.4得到的沉淀进行干燥，干燥温度(55～60℃)，真空度≦-0.08Mpa，干燥时间：4h。收集干燥后的粉末即为甘草提取物，即降低动物氧化应激损伤的中药提取物。
2.H2O2诱导细胞氧化应激损伤所需浓度的确定
采用MTT法检测细胞的活性。将细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞，市售)稀释至1×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组和H2O2处理组，H2O2处理组即在细胞中加入H2O2浓度分别为1200、1000、800、600、400、200μmol/L的DMEM培养基，空白组即在细胞中加入不含H2O2的DMEM培养基，每组设置6个重复。H2O2处理细胞4h后，在每孔中加入20μL的MTT检测液。将96孔板放到培养箱中继续培养4h后，去除上清液，每孔加入150μL DMSO并用酶标仪在490nm的检测波长下检测每孔吸光度，然后计算细胞的存活率。
3.甘草提取物给药浓度的确定
采用MTT法检测细胞的活性。细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞)培养于含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞用胰酶消化处理并将细胞悬液稀释至1×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组和药物处理组，药物处理组即在细胞中加入含甘草提取物分别为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56μg/mL的DMEM培养基，空白组即在细胞中加入不含甘草提取物的DMEM培养基，每组设置6个重复，药物处理24h后，在每孔加入20μL的MTT检测液。将96孔板放到培养箱中继续培养4h后，去除上清液，每孔加入150μL DMSO并用酶标仪在490nm的检测波长下检测每孔吸光度，然后进行分析计算。
4.甘草提取物对H2O2损伤的细胞存活率的影响
将细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞)稀释至1×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组、模型组和药物处理组。药物处理组即先加入含甘草提取物12.5、25.0、50.0μg/mL的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的培养基处理细胞4h；模型组即在细胞中加入不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；空白组即用不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入不含H2O2的DMEM培养基处理细胞4h。每组设置6个重复。在每孔加入20μL的MTT检测液。将96孔板放到培养箱中继续培养4h后，去除上清液，每孔加入150μL DMSO并用酶标仪在490nm的检测波长下检测每孔吸光度，然后进行分析计算。
5.甘草提取物对H2O2损伤的细胞LDH释放量的检测
将细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞)稀释至1×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组、模型组和药物处理组。药物处理组即先加入含甘草提取物12.5、25.0、50.0μg/mL的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；模型组即在细胞中加入不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；空白组即用不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入不含H2O2的DMEM培养基处理细胞4h。每组设置6个重复。在分别取各孔的上清液至新的96孔板相应孔中，然后在各孔中加入LDH检测工作液混匀，避光孵育30min。用酶标仪在490nm的检测波长下检测每孔吸光度，然后进行分析计算。
6.甘草提取物对H2O2损伤的细胞内ROS水平的检测
将细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞)稀释至1×105个/mL，每孔2mL接种于六孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组、模型组和药物处理组。药物处理组即先加入含甘草提取物12.5、25.0、50.0μg/mL的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；模型组即在细胞中加入不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；空白组即用不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入不含H2O2的DMEM培养基处理细胞4h。每组设置6个重复。在弃去每组上清液并加入含DCFH-DA荧光探针的无酚红的DMEM在37℃培养箱中培养30min，然后用流式细胞仪检测。
7.流式细胞仪检测甘草提取物对H2O2损伤的细胞凋亡的影响
将细胞(RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞)稀释至1×105个/mL，每孔2mL接种于六孔板中。细胞培养24h后，将细胞分为空白组、模型组和药物处理组。药物处理组即先加入含甘草提取物12.5、25.0、50.0μg/mL的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；模型组即在细胞中加入不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入含600μmol/L H2O2的DMEM培养基处理细胞4h；空白组即用不含甘草提取物的DMEM培养基处理细胞12h，去除上清液后，再加入不含H2O2的DMEM培养基处理细胞4h。每组设置6个重复。在收集各组细胞，用预冷的PBS重悬细胞，2000rpm离心5min，弃去上清液，加入300μL的1×Binding buffer悬浮细胞并加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min。在上机前5min再加入5μL的PI染色。
8.统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件分析，所得数据以
Figure BDA0002982459200000061
表示，组间比较采用单因素方差分析。
9.实验结果
1)H2O2诱导细胞氧化应激损伤所需浓度的确定
由表1可知，与空白组相比，400μmol/L的H2O2刺激细胞4h有显著的细胞毒性，当1000μmol/L的H2O2刺激细胞4h，细胞活力几乎丧失。因此，后续实验选择600μmol/L的H2O2刺激细胞4h。
表1不同浓度H2O2对细胞存活率的影响
组别(μmol/L) 细胞存活率(％)
Con(空白组) 97.63±10.76<sup>A</sup>
1200 5.07±0.52<sup>B</sup>
1000 4.94±0.77<sup>B</sup>
800 15.08±3.24<sup>C</sup>
600 56.48±8.40<sup>D</sup>
400 69.07±8.59<sup>D</sup>
200 100.76±16.36<sup>A</sup>
注：标有不同大写字母上标者表示差异极显著(P＜0.01)。
2)甘草提取物对细胞存活率的影响
由表2结果显示，与空白组相比，100μg/mL甘草提取物显著降低了细胞的存活率(p<0.05)，具有一定的细胞毒性。其他浓度的甘草提取物无细胞毒性，因此选择12.5、25.0、50.0μg/mL的甘草提取物进行以下实验。
表2不同浓度甘草提取物对细胞存活率的影响
组别(μg/mL) 细胞存活率(％)
Con(空白组) 100.00±11.40<sup>a</sup>
100.00 67.64±14.04<sup>b</sup>
50.00 87.47±15.13<sup>a</sup>
25.00 97.66±16.34<sup>a</sup>
12.50 99.75±6.52<sup>a</sup>
6.25 98.57±12.06<sup>a</sup>
3.13 95.98±14.22<sup>a</sup>
1.56 95.17±7.81<sup>a</sup>
注：同列数据标有不同小写字母上标者表示差异显著(P＜0.05)。
3)甘草提取物对H2O2损伤的细胞存活率的影响
由表3可知，与空白组相比，经600μmol/L H2O2处理后的模型组，细胞的活力显著降低(p<0.01)。与模型组相比，加入12.5μg/mL甘草提取物显著增加了细胞的存活率(p<0.05)，且随着甘草提取物浓度的增加，细胞的存活率显著增加。
表3甘草提取物对H2O2损伤的细胞存活率的影响
组别 细胞存活率(％)
Con(空白组) 104.97±6.35<sup>A</sup>
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(模型组) 49.39±5.58<sup>B</sup>
低浓度(12.5μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 64.05±4.85<sup>C</sup>
中浓度(25.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 58.64±6.44<sup>D</sup>
高浓度(50.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 67.02±7.88<sup>D</sup>
注：标有不同大写字母上标者表示差异极显著(P＜0.01)。
4)甘草提取物对H2O2损伤的细胞LDH释放的影响
LDH(乳酸脱氢酶)释放被看做细胞膜完整性的重要指标。由表4可知，与空白组相比，经600μmol/L H2O2处理后的模型组，细胞LDH释放显著增加(p<0.01)。与模型组相比，加入低(12.5μg/mL)、中(25.0μg/mL)、高浓度(50.0μg/mL)的甘草提取物均能显著降低细胞LDH的释放(p<0.01)。
表4甘草提取物对H2O2损伤的细胞LDH释放的影响
组别 LDH活力(OD 490nm)
Con(空白组) 0.133±0.013<sup>A</sup>
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(模型组) 0.363±0.017<sup>B</sup>
低浓度+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 0.210±0.026<sup>C</sup>
中浓度+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 0.207±0.027<sup>C</sup>
高浓度+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 0.214±0.017<sup>C</sup>
注：标有不同大写字母上标者表示差异极显著(P＜0.01)。
5)甘草提取物对H2O2损伤的细胞中ROS的影响
由表5及图1可知，与空白组相比，加入600μmol/L H2O2引起细胞中ROS显著上升(p<0.01)。与模型组相比，预先加入中浓度和高浓度的甘草提取物能显著抑制H2O2诱导的ROS的产生(p<0.01)。
表5甘草总黄酮对H2O2损伤的细胞中ROS的影响
组别 ROS相对含量(％)
Con(空白组) 1.12±0.74<sup>a</sup>
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(模型组) 5.65±0.37<sup>b</sup>
低浓度(12.5μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 4.73±0.75<sup>b</sup>
中浓度(25.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 2.65±0.48<sup>a</sup>
高浓度(50.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1.61±0.40<sup>a</sup>
注：同列数据标有不同小写字母上标者表示差异显著(P＜0.05)。
6)甘草提取物对H2O2损伤的细胞凋亡的影响
由表6及图2可知，与空白相比，加入600μmol/L H2O2引起细胞凋亡率显著上升(p<0.01)。与模型组相比，预先加入中浓度和高浓度的甘草提取物能显著降低H2O2诱导的凋亡(p<0.01)。
表6甘草提取物对H2O2损伤的细胞凋亡的影响
组别 细胞凋亡率(％)
Con(空白组) 2.39±0.28<sup>A</sup>
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(模型组) 5.79±0.27<sup>B</sup>
低浓度(12.5μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 5.41±0.18<sup>B</sup>
中浓度(25.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 3.47±0.15<sup>C</sup>
高浓度(50.0μg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 2.99+0.09<sup>D</sup>
注：标有不同大写字母上标者表示差异极显著(P＜0.01)。
从上述实验数据可以看出，本发明制备的甘草提取物能显著降低氧化应激对哺乳动物细胞(腹腔巨噬细胞)的损伤。用H2O2刺激细胞建立细胞氧化应激损伤模型，600μmol/LH2O2刺激细胞4h显著降低细胞的活力并增加细胞凋亡率和细胞中ROS、LDH释放的水平，表明600μmol/L H2O2刺激细胞4h可以引起细胞氧化应激损伤。加入H2O2细胞前用低、中、高浓度的甘草提取物预处理细胞12h能抑制H2O2诱导的细胞活力下降，加入中和高浓度甘草提取物能显著降低H2O2诱导的细胞凋亡、细胞LDH的释放和细胞中ROS的产生。这表明本发明制备的甘草提取物预处理细胞12h能降低氧化应激对细胞的损伤，有一定的预防氧化应激损伤的效果，同时也体现了中药制剂治未病的特点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)药材准备：称取甘草片，将甘草片粉碎并过筛，得到甘草粉末；
(2)前处理和碱水提取：将甘草粉末加入至氢氧化钠溶液中，浸泡；然后加热至沸腾状态，保温煎煮回流2～3次，每次1～2h；合并提取液；
(3)沉淀：调节提取液PH值至1.0～2.0，冷却至室温，静置，弃去上清液；再用盐酸进行洗涤，过滤得到沉淀；
(4)干燥：将步骤(3)得到的沉淀进行干燥，收集干燥后的粉末即为甘草提取物，即降低动物氧化应激损伤的中药提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中，甘草粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1kg：8～20L；
步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3～0.5mol/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中，甘草粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1kg：8L；
步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.4mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述的过筛为过100～150目筛；
步骤(2)中，所述的浸泡的时间为8～12h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中，PH值采用2mol/L盐酸溶液的进行调节；
步骤(3)中，静置的时间为8～12h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中，所述的干燥的条件为干燥温度55～60℃，真空度≦-0.08Mpa，干燥时间4～6h。
7.一种降低动物氧化应激损伤的中药提取物，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的降低动物氧化应激损伤的中药提取物在降低氧化应激对哺乳动物细胞的损伤中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述的哺乳动物细胞为腹腔巨噬细胞；
氧化应激为H2O2诱导的氧化应激。
10.权利要求7所述的降低动物氧化应激损伤的甘草提取物在预防氧化应激对动物健康生长中的应用。
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