CN112996545A - 用于病原体、微生物和寄生虫灭活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于灭活或减少样品、介质、组合物、设施、装置、表面或生物体中的病原体、微生物或寄生虫的方法，这是通过用结构I的烷基化化合物处理，随后通过用中和剂处理以消除或减少残余的具有结构I的化合物来实现，所述中和剂消除或减少具有结构I的烷基化化合物的毒性或其它不合需要的特性。所述中和剂可以存在于处理溶液中或作为固相剂的一部分，并且优选地通过消除所述结构I的化合物的烷基化特性而起作用。

Description

用于病原体、微生物和寄生虫灭活的方法
技术领域
本发明涉及用于在工业中和研究中灭活或减少药品、生物剂、医学装置和化妆品中的病原体、微生物或寄生虫的组合物和方法。更特别地，本发明提供了用于灭活和/或减少样品、介质、组合物、设施、装置、表面或生物体中的病原体、微生物或寄生虫(例如，污染物)的组合物和方法，这是通过用烷基化化合物处理，随后消除或减少残余的烷基化化合物和/或其副产物来实现。
背景技术
现有病原体和感染性疾病生物体，以及新的和刚出现的那些，和其它非所需生物体(例如，污染物)，一般包括如生物膜的结构或生物淤积，在广泛范围的领域中造成重大问题，这些领域包括医学、制造业、医药品生产、生物学、化妆品、食品、医学装置、研究和其它行业。因此，在大范围的样品，包括生物体，或产品和组合物，包括食品、药物、植物、血液或血液产品、体液、源于真核生物或原核生物的介质、疫苗或疫苗制剂组合物、化妆品、生物剂和药物组合物中；或者家庭、工业或医学使用的器皿、装置或设施，包括流体管道、热交换器或水上船舶的表面中或表面上，灭活病原体或非所需生物体是重要的。
当前，不存在广泛适用于灭活样品和组合物或设施中的生物体的通用的病原体、非所需微生物或寄生虫减少技术。一些两亲性季铵盐是相当普遍的消毒剂，尤其在较高浓度下，而它们对无包膜病毒没有活性。小的反应性分子，例如氯气、次氯酸钠、氧化乙烯、甲基溴、甲醛或臭氧是广泛的抗微生物剂并且对所有生命有毒，而它们的高反应性，尤其对蛋白质的高反应性阻碍了它们广泛用于生物剂、输血产品和体内。同时，所述分子的化学反应性使它们往往不适于许多用途。
病原体核酸的靶向和灭活是防止病原体复制和感染的通用方法并且可以应用于所有种类的病原体-病毒、细菌、真菌、朊病毒、原生动物和其它寄生虫或不合需要的生物体。一些现有方法通过使用嵌入剂，例如亚甲基蓝、补骨脂素衍生物(美国专利第6,455,286号和第6,133,460号)和核黄素(美国专利第7,985,588号)来利用这种方法，所述嵌入剂选择性结合至核酸并且当光活化时破坏这些核酸，由此发挥广泛的抗病原体活性。举例来说，Estcourt等人、Jory等人、Magron等人和Yonemura等人描述了通过使用光敏化合物进行半透明血液组分，例如血浆和血小板中的病原体灭活(Estcourt LJ,Malouf R,Hopewell S,Trivella M,Doree C,Stanworth SJ,Murphy MF),Pathogen-reduced platelets for theprevention of bleeding.Cochrane Database Syst Rev.2017；7:CD009072,数字对象标识符:10.1002/14651858.CD009072.pub3,PubMed PMID:28756627；Jori G,BrownSB.Photosensitized inactivation of microorganisms.Photochem.Photobiol.Sci.2004；3(5):403-5,数字对象标识符:10.1039/b311904c.PubMed PMID:15122355；Magron A,Laugier J,Provost P,Boilard E.Pathogen reduction technologies:The pros andcons for platelet transfusion.Platelets.2018；29(1):2-8,数字对象标识符:10.1080/09537104.2017.1306046,PubMed PMID:28523956；Yonemura S,Doane S,Keil S,Goodrich R,Pidcoke H,Cardoso M.Improving the safety of whole blood-derivedtransfusion products with ariboflavin-based pathogen reductiontechnology.Blood Transfus.2017；15(4):357-64,数字对象标识符:10.2450/2017.0320-16,PubMed PMID:28665269)。这些方法的显著缺点是需要光活化，这限制了它们只能用于半透明组合物，并且阻碍了它们用于如全血或红血细胞制剂的重要生物剂。
通过核酸的烷基化来灭活病原体或其它污染物的烷基化化合物可以用于灭活病原体而不需要光活化。这种方法的挑战是开发有效穿透病原体的细胞壁、膜和包膜并且具有足够的选择性以避免生物基蛋白质改性的化合物。甚至烷基化病原体灭活剂的最具选择性的代表，例如PEN110(N-(2-氨乙基)氮丙啶)和烷基化嵌入剂S303，也已经显示出对核酸具有不足的特异性并且对其它生物化合物(例如，蛋白质)具有残余的反应性。当此类烷基化剂用于处理可输血的血液产品时，这可能导致新抗原形成(Sobral PM等人,Viralinactivation in hemotherapy:systematic review on inactivators with action onnucleic acids.Rev Bras Hematol.Hemoter.2012；34(3):231-235,数字对象标识符:10.5581/1516-8484.20120056,PubMed PMID:23049426；Conlan MG等人,Antibodyformation to S-303-treated RBCS in the setting of chronic RBCtransfusion.Blood 2004；104(11):382)。美国专利第6,617,157号中公开了作为抗细菌剂的其它单氮丙啶-聚胺缀合物，并且美国专利第6,410,219号和第5,691,132号中公开了用烷基化部分改性以选择性靶向病原体核酸的嵌入剂。所公开的结构和方法的缺点在于它们并未达成核酸靶向所必需的选择性并且并未避免蛋白质改性。
美国专利第10,173,976号，其公开内容借此通过引用并入，描述了具有两个或更多个通过聚胺构造互连的氮丙啶基的组合物和化合物，它们对核酸具有高度和选择性的亲和力，使蛋白质改性的倾向较低，并且可以高选择性地灭活样品中的病原体、原核生物或真核生物的核酸(例如，DNA和/或RNA)或者朊病毒相关的核酸。
这种烷基化剂和一般靶向核酸以用作病原体灭活剂的其它烷基化剂的缺点在于残余的烷基化化合物(例如，在生物体、组合物、样品、装置、器皿或设施中或上)可能有毒，并且在病原体灭活之后立即或在后续使用期间造成危害。可以通过在病原体灭活之后去除抗病原体剂，或通过抗病原体剂的灭活(淬灭)，即，转化成较低危害性或无危害性的物质来解决这一缺点。
美国专利第7,293,985号，其公开内容借此通过引用并入，描述了使用硫醇，优选谷胱甘肽，一种含有半胱氨酸残基的二肽，来体外淬灭包含连接至芥型烷基化基团的核酸嵌入剂的病原体灭活化合物，其中芥基团能够原位反应以形成亲电子基团。这种方法的缺点在于并未提供这种类型的核酸靶向烷基化剂的充分灭活，从而当在人类中输注通过这种方法处理的血液时会产生新抗原和自身免疫副作用(Conlan MG等人,Antibody formationto S-303-treated RBCS in the setting of chronic RBC transfusion.Blood 2004；104(11):382)。
美国专利申请第20040137419号，其公开内容借此通过引用并入，描述了通过使用阳离子交换树脂从所处理的组合物中去除带正电荷的杀微生物化合物，并且特别是PEN110，N-(2-氨乙基)氮丙啶的方法。
美国专利第6,544,727号，其公开内容借此通过引用并入，描述了从血液产品中去除补骨脂素和光照射之后形成的补骨脂素光产物的方法和装置。所述方法包括使补骨脂素和照射处理的血液产品与能够吸附补骨脂素和补骨脂素光产物的树脂接触。
在本领域中需要可以应用于广泛范围的领域和应用中的改善的病原体灭活方法，并且特别是不损害处理样品中的蛋白质和其它物质的病原体灭活方法；以及在所处理的样品中几乎不留下毒性化合物的方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于灭活和/或减少样品(包括生物样品、介质、组合物、设施、装置、表面、生物体等)中的病原体、微生物、感染物(例如，朊病毒)或寄生虫(例如，污染物)的组合物和方法，这是通过用烷基化化合物处理，随后消除或减少残余的烷基化化合物和/或其副产物来实现。可以通过用与烷基化化合物反应或以其它方式螯合烷基化化合物的固相剂处理，或者通过用中和化合物的溶液处理来进行残余的烷基化化合物的消除或减少，所述中和化合物消除或减少烷基化化合物的毒性或其它不合需要的特性，优选地通过消除烷基化化合物的烷基化特性，随后在一些情况下借助于螯合烷基化化合物的中和产物和/或过量的中和化合物的固相剂来去除所述中和产物和/或过量的中和化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于灭活或减少样品中的病原体、微生物、感染物或寄生虫(例如，污染物)的方法，所述方法包括：(i)用一种或多种具有结构I的化合物或所述化合物的化学上可接受的盐、水合物或溶剂化物处理所述样品：
Figure BDA0002994828660000051
其中：
每个R1在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基，
每个R2在每次出现时独立地选自H、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基或苯基，或结构II的部分：
Figure BDA0002994828660000052
每个R3在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基；
n在每次出现时独立地为3、4或5；
m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
以及
(ii)通过用与所述化合物反应或以其它方式螯合所述化合物的固相剂处理，或者通过用中和化合物的溶液处理来消除或减少残余的一种或多种具有结构I的化合物，所述中和化合物消除或减少具有结构I的化合物的毒性或其它不合需要的特性，优选地通过消除所述化合物的烷基化特性，随后在一些情况下借助于螯合具有结构I的化合物的中和产物和/或过量的中和化合物的固相剂来去除所述中和产物和/或过量的中和化合物。
结构I的化合物含有至少两个通过聚胺构造连接的氮丙啶基团，所述化合物以高亲和力结合至核酸并且通过高效率烷基化来灭活所述核酸。另外，化合物高效率地穿透病毒包膜和/或衣壳，并且由细菌和真核聚胺转运体主动吸收，并且显示出结合至蛋白质并使蛋白质改性的倾向较低。因为结构I的化合物对真核细胞具有细胞毒性，所以需要促使所述化合物无毒或从所处理的样品、组合物、设施或生物体中去除。
在一个实施方案中，本发明的方法描述了残余的结构I的化合物通过与中和化合物反应向较低毒性或无毒化合物的转化，所述中和化合物消除结构I的化合物的烷基化特性，例如，通过打开氮丙啶环进行。中和化合物是亲核化合物，例如硫代硫酸盐、硫代磷酸盐、硫脲、硫代羧酸、二硫代羧酸、硫代碳酸O-酯盐、二硫代碳酸O-酯盐，或巯或硫醇(优选具有介于6与8之间的pKa的巯或硫醇，或者其中巯基或硫醇基连接至sp2或部分sp2杂化的碳原子)。
在一些情况下，结构I的化合物的中和(也称为淬灭)产物或残余的中和(淬灭)化合物本身可能对所处理的样品或样品的未来用途具有非所需的影响。在另一个实施方案中，所述方法涉及通过使用固相剂来去除或减少中和产物和/或一种或多种中和化合物，所述固相剂不可溶于所处理的介质中，并且与中和产物和/或过量的一种或多种中和化合物发生化学反应并且共价结合、吸收或以其它方式螯合所述中和产物和/或过量的一种或多种中和化合物，随后去除固相剂。固相剂可以用硫代硫酸盐基团(-S-SO3 -Na+)或用环氧基官能化，所述固相剂与巯或硫醇型中和化合物反应并且螯合所述中和化合物；或固相剂是阳离子交换剂或阴离子交换剂，所述固相剂通过离子交换来螯合阳离子型中和产物或阴离子型中和化合物；或吸收性固相剂，例如，以高亲和力吸收聚胺或含硫有机部分的活性碳。
在所述方法的另一个实施方案中，用结构I的化合物处理含病原体的样品之后，通过用含有与一种或多种结构I的化合物反应并且共价结合所述化合物的反应基团的固相剂处理来去除残余的化合物，随后通过过滤或其它方式去除固相剂。此类反应基团的实例是硫代硫酸根基-OS(O)(O-)S-、硫代磺酸根基-S(O)(O-)S-、巯基或硫醇基、经取代的巯基或硫醇基、硫脲、硫代羧酸或二硫代羧酸、硫代碳酸根基或二硫代碳酸根基O-酯、硫代膦酸根基或硫代磷酸根基。硫醇基可以具有小于9或更优选小于8的pKa。在另一个实施方案中，固相剂不仅含有反应基团，而且含有其它基团，所述其它基团在不与结构I的化合物反应的情况下，通过使所述结构I的化合物质子化，或非共价结合所述结构I的化合物，增加所述结构I的化合物的局部浓度，或增强反应基团的反应性来增强所述结构I的化合物的反应性。在又一个实施方案中，固相剂含有非反应性亲水基团，例如聚乙二醇，从而改善所述固相剂在水性介质中的可湿润性并且减少所述固相剂对所处理的介质的组分的非所需的影响。
另一个实施方案描述了作为阳离子交换剂的固相剂，所述阳离子交换剂与残余的结构I的化合物形成多个离子对，由此以高度有效的方式保留所述化合物。
一些实施方案提供了一种用于灭活动物或人体内的病原体的方法，其中将优选经过配制的结构I的化合物施加于动物或人类，并且对体液，例如血浆或血液离体进行结构I的化合物的中和或去除，然后将所述体液返回(回输)至动物或人类。在另一个实施方案中，对优选通过单采术收集的动物或人类的体液，例如血液或血浆离体进行用结构I的化合物的处理和所述化合物的去除，或所述化合物的中和以及可能的中和产物和中和化合物的去除，然后将所述体液返回至动物或人类。
本文还描述了根据意图用于输血的全血、红血细胞或其它血液产品的病原体灭活方法使用的封闭系统。
附图说明
图1示出了结构I的化合物与固相剂的相互作用，所述固相剂具有通过连接子L连接的亲核硫醇基，并且其中辅助阴离子磺基直接连接至聚合物P基体。
图2示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用与血液收集袋中的抗凝血剂溶液配制在一起的结构I的化合物来实现病原体灭活，以及通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物。
图3示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用预装载于处理袋中的结构I的化合物的固体制剂来实现病原体灭活，以及通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物。
图4示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用结构I的化合物的液体制剂来实现病原体灭活，以及用灭活剂的液体制剂中和残余的化合物。
图5示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用结构I的化合物的液体制剂来实现病原体灭活，以及通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物。
图6示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用结构I的化合物的液体制剂来实现病原体灭活，用灭活剂的液体制剂中和残余的化合物，以及用固相剂去除结构I的化合物的中和产物。
图7示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，其中用结构I的化合物的液体制剂来实现病原体灭活，用固相剂去除残余的结构I的化合物，进行白细胞过滤，以及将去白细胞的血液分离成红血细胞浓缩液(RBCC)和血浆。
图8示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血和白细胞过滤，其中用去白细胞的全血的结构I的化合物的液体制剂来实现病原体灭活，用固相剂去除残余的结构I的化合物，以及将所处理的血液分离成红血细胞浓缩液(RBCC)和血浆。
图9示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，用结构I的化合物的液体制剂进行病原体灭活，用呈自由珠粒形式或预装填于半渗透材料中的固相剂分两个阶段去除残余的结构I的化合物，进行白细胞过滤，以及将去白细胞的血液分离成红血细胞浓缩液(RBCC)和血浆。
图10示出了全血单元加工封闭系统，所述系统用于收集全血，用结构I的化合物的固体制剂进行病原体灭活，以及用灭活剂的液体制剂中和残余的化合物。
图11示出了含有结构I的化合物的固体制剂的容器，所述容器通过易破密封件连接至用于溶解所述制剂的溶剂的容器并且通过另一个易破密封件连接至具有待处理样品的容器。
图12示出了用于无菌预湿润装填于筒中的固相剂的封闭系统。
图13示出了用于冲洗使用前的固相剂的封闭系统。所述系统集成于用于在无菌条件下根据所述方法处理样品的封闭系统中。
图14示出了在37℃下与200μM化合物X一起在PBS(pH 6.7)中孵育0小时(上)和6小时(下)的10μM 21聚体低聚脱氧核糖核苷酸(5'ATA CCT CAT GGT AAT CCT GTT 3')的HPLC分析。
图15示出了在添加化合物X(100μM)之前(上谱图)和之后6分钟(下谱图)，于PBS中的100μM 23聚体低聚核苷酸的质谱分析。所观测的离子(m/z 1845.22和1933.54)具有-4的电荷态，对应于质量为7384.9Da(低聚核苷酸，计算质量7384.0Da)和7738.2Da(低聚核苷酸与化合物X的共价单加合物，计算质量7737.3Da)的中性分子。
图16示出了在40℃下与化合物X(上，1mM；中，100μM；下，无化合物X，对照)一起孵育30小时后，8μM细胞色素C的ESI+质谱分析。从右至左的MS峰对应于细胞色素C的7x、8x、9x、10x带正电荷的分子离子。
图17示出了抗F蛋白质mAb与化合物VI和X灭活的呼吸道合胞病毒(RSV)的结合。图17A：mAb与未处理的(Ctr)以及用100μM化合物VI或化合物X灭活的RSV的结合(全部在40℃下孵育4小时)。图17B：mAb D25与未处理的(Ctr)以及用100或500μM化合物VI灭活的结合(全部在室温下孵育6小时)。
图18示出了在室温下由PBS中的2-巯基乙酸乙酯中和化合物X的动力学。化合物X的浓度以0.022min-1的一级速率常数下降，并且中间体Q1 XXI的浓度以0.026min-1的一级速率常数下降。
图19示出了在与1mM硫代硫酸钠一起孵育期间化合物VI的浓度的对数图。
图20示出了化合物X的中和速率的图。图20A示出了化合物X的中和速率以及化合物XXIV和XXV的形成速率。图20B示出了化合物X浓度的对数图，这揭示了线性依赖，从而指示一级速率常数K＝-0.0416min-1的一级反应动力学，对应于T1/2＝16.6min的化合物X半衰期。
图21示出了在100秒孵育之后用苯硫酚中和化合物X的LCMS分析的质量色谱图(左图)。对应于化合物X以及它的中和产物XXVI和XXVII的峰的质谱在右图中示出。分析揭示了在100秒之后，在很大程度上中和了化合物X。
图22示出了在48孔板中经过6-7天的时段测量，模拟处理和化合物VI处理的血清对四种不同细胞系的生长的影响。图22A，猪PT细胞；图22B，人A172细胞；图22C，人MCF-7细胞；图22D，在含FBS的介质中生长的牛BTT细胞；图22E，在含HS的介质中生长的牛BTT细胞。T0柱指示了在涂板时的细胞数；三个柱的阵列中的第一个柱(第1天至第7天)是含有补充有对照，即未处理的血清的介质的孔中的细胞数；三个柱的阵列中的第二个柱(第1天至第7天)是含有补充有模拟处理的血清的介质的孔中的细胞数；三个柱的阵列中的第三个柱(第1天至第7天)是含有补充有化合物VI处理的血清的介质的孔中的细胞数。每个时间点代表三个孔的平均值。误差条指示SD。
具体实施方式
如本文所用的术语“样品”是指介质、组合物、产品、装置、设施或生物体，它们可以是原核生物、单细胞或多细胞真核生物、植物、动物、血液或血液产品、体液、源于真核生物或原核生物的介质、疫苗制剂组合物、生物剂或生物制剂、临床样品、活检体、研究样品、化妆品、药物组合物、一次性用品、仪器、水生流体管道、导管、软管、热交换器或水上船舶和它们的表面。
术语中和剂、中和剂化合物或中和试剂当在一种或多种结构I的化合物的情形中使用时，指定一般可以与样品中的结构I的化合物的氮丙啶基反应并且打开氮丙啶基的分子。
在本文所描述的方法的情形中使用的术语“固相剂”定义为不可溶于样品的介质中，并且用于从样品中去除结构I的化合物，或结构I的化合物的灭活产物，或结构I的化合物的化学转变或降解产物或中和剂的固体。
如本文所用的术语“污染物”是指病原体，包括病毒、细菌或任何其它微生物；朊病毒；或真核生物、单细胞或多细胞真核生物，包括但不限于真菌、原生动物、单细胞或多细胞寄生虫(包括蠕虫、血吸虫或线虫或它们的卵)、单细胞或多细胞藻类和甲壳类；或任何其它不合需要的生物体或感染物。如本文所用的术语“污染物”还可以指不合需要的生物结构，包括但不限于细菌生物膜或其它微生物生物膜、苔癣、结垢或生物淤积积聚物。
本发明提供了一种用于样品中的污染物灭活/减少的方法，这是通过用结构I的化合物或所述化合物的化学上可接受的盐、水合物或溶剂化物处理，随后去除或中和(淬灭)残余的结构I的化合物来实现：
Figure BDA0002994828660000121
其中：
每个R1在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基，
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烷基、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的环烷基或经取代的苯基，或结构II的部分：
Figure BDA0002994828660000131
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基；
每个n在每次出现时独立地为3、4或5；
每个m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，结构I的化合物可以具有结构IA：
Figure BDA0002994828660000132
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基、苯基，或结构IIA的部分：
Figure BDA0002994828660000141
每个R3在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
每个b在每次出现时独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，结构I的化合物可以具有结构IB：
Figure BDA0002994828660000142
其中
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
b选自0、1、2、3、4、5或6。
术语“烷基”是指饱和脂族基的基团，包括直链烷基和支链烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有6个或更少碳原子(例如，对于直链，C1-C6；对于支链，C3-C6)。优选的烷基包括CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
术语“经取代的烷基”是指由1至3个取代基取代的如上文所提供的烷基，所述取代基独立地选自由F、Cl、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH(CH3)2、OC(CH3)3、OC6H5、OCOCH3组成的组。
术语“环烷基”是指在环中具有3至6个碳的饱和碳环基。优选的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“烯基”是指不饱和脂族基的基团，包括直链烯基和支链烯基，并且具有1至3个双键。在优选的实施方案中，直链或支链烯基在其主链中具有6个或更少碳原子(例如，对于直链，C2-C6；对于支链，C3-C6)。
术语“经取代的烯基”是指由1至3个取代基取代的如上文所提供的烯基，所述取代基独立地选自由F、Cl、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH(CH3)2、OC(CH3)3、OC6H5、OCOCH3组成的组。
术语“经取代的苯基”是指由1至3个取代基取代的苯基，所述取代基独立地选自由F、Cl、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH(CH3)2、OC(CH3)3、OC6H5、OCOCH3组成的组。
术语“烷氧基”是指通过氧原子连接的如上文所定义的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“酰氧基”是指具有结构-O-(C＝O)-R的基团，其中R是如上文所定义的烷基或经取代的烷基。
如本文所用，每个表述的定义，例如烷基、m、n、R1、R2、R3等，当在任何结构中出现一次以上时，意图与在相同结构中它在别处的定义无关。
将了解，“经取代”或“经……取代”包括以下隐含条件：此种取代是依据经取代的原子和取代基所允许的价数，并且取代产生稳定的化合物，例如，不会例如通过重排、环化、消除等自发地经历转变。
如上文所阐述，在某些实施方案中，结构I的化合物以盐形式存在。优选的盐是结构I的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒剂中原位制备，或通过独立地使呈游离碱形式的纯化的结构I的化合物与适合的有机酸或无机酸反应，并且在后续纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见例如Berge等人(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66:1-19)。优选地，阴离子具有低亲核性，例如硫酸根、高氯酸根、甲磺酸根或四氟硼酸根。
结构I的化合物具有聚胺性质，在它们的末端具有两个或更多个氮丙啶基。这些化合物具有各自可以体外或体内带正电荷的多个脂族氮原子。归因于化合物的聚阳离子性质和正电荷之间的适当间距，化合物选择性结合至优选在鸟嘌呤N7位置上的聚阴离子核酸并且使所述聚阴离子核酸烷基化。这引起交联，从而有效灭活病原体的基因组，消除病原体的感染性或杀死生物体。
具有结构I的化合物可以通过本文所公开的方法合成。以下流程，例如组合物和化合物的合成，出于说明的目的而提供并且决不意图限制本发明的范围。本领域普通技术人员可以容易地了解结构I的化合物的不同化学方法和合成流程。
以下流程中提供了结构I的化合物的合成方法。
流程1示出了用于制备化合物IV的方法：
Figure BDA0002994828660000161
流程2示出了用于制备化合物VI的方法：
Figure BDA0002994828660000171
流程3示出了用于制备化合物X的方法：
Figure BDA0002994828660000172
流程4示出了用于制备化合物XIV的方法：
Figure BDA0002994828660000173
流程5示出了用于制备化合物XVI的方法：
Figure BDA0002994828660000174
一般来说，结构I的化合物是粘性油，所述粘性油易溶于水、水性缓冲液和有机溶剂中。如果用酸处理，那么它们可以转化成盐形式。如果优选地在低温下用化学计算量的无水酸处理所述结构I的化合物于非极性非质子溶剂(例如，醚)中的溶液，那么它们的盐可以沉淀并且可以通过过滤进行分离。在本发明的一些实施方案中，盐形式代替游离碱的油形式用于长期储存。
结构I的化合物的游离碱的溶液是碱性的，并且可以吸收大气二氧化碳，大气二氧化碳能使溶液的稳定性受损并且加速它们的水解或其它降解。可以通过添加少量的碱性化合物，例如氢氧化钠来稳定结构I的化合物的游离碱。举例来说，通过添加0.1％氢氧化钠显著稳定化合物X的甘油溶液以供长期储存。
通过将结构I的化合物的溶液于室温下呈固体的化合物中冷却进行快速固化，可以使结构I的化合物转化成固溶体。举例来说，如果将化合物VI以至多3％的量添加至熔融聚乙二醇中，并且快速冷却所得溶液，优选地呈薄膜形式，那么就形成化合物VI的固溶体。这种溶液比纯化合物VI具有显著更高的储存稳定性。可以通过添加微量的强碱，例如氢氧化钠来进一步增强固溶体的稳定性。用于制备结构I的化合物的固溶体的优选固体具有高于40℃且低于120℃的熔点，充分溶于水性介质中，化学性质是中性的，并且对通过该工艺处理的样品或对它的预期用途没有不利影响。
我们的实验和本发明的实施例中所呈现的数据显示，在低浓度(100-500μM)下和不同温度(20至40℃)下，代表性结构I的化合物与RNA和DNA低聚核苷酸快速形成共价加合物，并且灭活不同种类的介质(例如，生长介质)、全血、红血细胞浓缩液、血浆和血清中的高效价的各种病原体(包膜和无包膜的DNA和RNA病毒、G+和G-细菌、支原体、真菌和原生动物)。
根据本发明的方法，用纯的结构I的化合物或用含有一种或多种结构I的化合物的组合物处理样品中的污染物，其中可以将所述组合物配制成液体、溶液、凝胶、固体、粉末、粒子，或可以囊封、溶解、分散、磨碎、微粉化或转化成纳米粒子，或其它配制形式或它们的组合。结构I的化合物的组合物的溶剂可以是水、水性缓冲液或水性盐溶液；有机溶剂，例如但不限于二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙醇、异丙醇、丙酮、不同分子质量的一种或多种聚乙二醇、甘油、丙二醇、苯甲醇或它们的混合物；液化气体，或它们的混合物。溶剂可以含有各种有机或无机添加剂、稳定剂、活化剂或佐剂。
在本发明的实施方案中，持续30秒至72小时、优选20分钟至24小时并且甚至更优选60分钟至8小时的时间段，并且在0至100℃、优选10至60℃并且甚至更优选20至40℃的温度下；以及在1至14、优选4至9并且甚至更优选6至8的pH值下；并且在10nM至10mM、优选1μM至1mM、再优选100μM至500μM的浓度下，用一种或多种结构I的化合物处理含有污染物的样品。
一种或多种结构I的化合物的污染物灭活作用随着化合物浓度、剂量或量、处理时间和温度的增加而增加。同时，对所处理的样品可能存在的非所需影响也可能随着化合物浓度、剂量或量、处理时间和温度而增加。基于所处理的介质的类型和特性以及其中存在的病原体或非所需生物体的性质和类型以及病原体或非所需生物体灭活的所需水平，所述方法的使用者可以确定一种或多种结构I的化合物的最佳浓度、剂量或量、处理时间和温度。举例来说，可以在高温，例如60℃和更高温度下，并且持续延长的时间段，例如24小时和更长时间来处理对温度稳定的设施，例如生物淤积热交换器。同时，敏感样品，例如血小板浓缩液的最佳处理温度可以是室温，并且处理时间可以限于1-2小时或更短时间；而对于耐热样品，例如经过热处理的动物血清，最佳温度可以是40℃或更高温度，处理时间是1-6小时。使用者可以使用本文所公开的方法和本领域技术人员已知的类似方法通过实验确定一种或多种结构I的化合物的最佳浓度、剂量或量以及处理时间和温度。
最佳处理参数(浓度、时间、温度)可以不仅取决于所处理的样品的特性以及其中存在的病原体或其它非所需生物体的类型和性质，而且取决于病原体或其它非所需生物体灭活/减少的所需程度，这可以取决于所处理的样品的预期用途。举例来说，如果所处理的样品是预期用作细胞生长介质的补充物的动物血清，那么可以感染细胞的病毒的所需水平可以是每个使用剂量低于一个感染粒子，这可能需要大于9对数的减少/灭活水平；而如果所处理的设施是目的在于控制生物膜形成或生物淤积的工业管道，那么微生物减少1或2对数可能是足够的。
本发明的方法通过选择一种或多种结构I的化合物和处理参数(浓度/剂量/量、时间、温度、pH值、配方)提供了用于一种或多种病原体或非所需生物体的方式，并且在一些情况下，使存在于样品中的所有病原体或非所需生物体达到所处理样品的50％至完全灭菌的灭活形式。
另一方面，结构、作用机理和我们的实验指示，结构I的化合物具有细胞毒性，并且为了所处理样品的安全使用或为了所处理生物体的安全性，它们应该被去除，或消除它们的细胞毒性。
在本发明的一些实施方案中，可以通过用小的亲核分子或离子处理其中存在残余的结构I的化合物的样品来减少或去除结构I的化合物的烷基化特性并且因此减少或去除所述化合物的由那些烷基化特性产生的细胞毒性，所述小的亲核分子或离子例如但不限于硫代硫酸盐，优选硫代硫酸钠；硫代磷酸盐，优选硫代磷酸钠；硫脲或经取代的硫脲，例如单甲基硫脲、N,N-二甲基硫脲或N,N'-二甲基硫脲、三甲基硫脲或四甲基硫脲；硫代羧酸，例如硫代乙酸(CH3C(O)SH)、硫代丙酸、硫代草酸、硫代丙二酸、硫代琥珀酸；二硫代羧酸，例如二硫代乙酸(CH3C(S)SH)；硫代碳酸O-酯盐，例如硫代碳酸乙酯盐；二硫代碳酸O-酯盐，例如二硫代碳酸乙酯盐；或巯或硫醇，例如但不限于2-巯基乙醇、3-巯基丙-1,2-二醇(1-硫代甘油)、2-硫代甘油、1,2-二硫代甘油或1,3-二硫代甘油、2-氨基乙硫醇、2-(甲氨基)乙硫醇、2-(二甲氨基)乙硫醇、2-巯基-N,N,N-三甲基乙铵盐、(甲基磺酰基)甲硫醇、(乙基磺酰基)甲硫醇、磺酰基二甲硫醇、硫代乙醇酸(HSCH2CO2H)、2-巯基琥珀酸；芳族或杂环硫醇，例如苯硫酚、呋喃-2-硫醇、2-硫代吡啶、1H-咪唑-2-硫醇、1H-咪唑-5-硫醇；硫代巴比妥酸、硫代水杨酸或4-巯基苯甲酸。下文呈现了优选硫醇化合物的一些实例：
Figure BDA0002994828660000211
如实施例中所示，小亲核分子通过打开氮丙啶环与具有结构I的化合物反应，由此消除它们使核酸烷基化的能力。这种反应的速率取决于温度、pH值和浓度，以及小亲核分子的亲核性。
硫醇的亲核性随着硫醇的去质子化而显著增加，即，硫醇的亲核性主要归因于硫醇的去质子化阴离子形式(Danehy,J.P.；Noel,C.J.The Relative NucleophilicCharacter of Several Mercaptans toward Ethylene Oxide.Journal of the AmericanChemical Society 1960,82,2511-2515)。一般来说，相同类型的阴离子亲核试剂的亲核性并且特别是硫醇亲核试剂的亲核性随着它们的碱度而增加，即，与具有更低pKa的亲核试剂(更强酸性的亲核试剂)相比，具有更高pKa的亲核试剂将具有更加亲核的阴离子形式。同时，去质子化(阴离子)形式的亲核试剂的浓度随着亲核试剂的pKa与介质的pH值之间的差异增加而降低，即，在高于介质的pH值下随着亲核试剂pKa的增加而降低。
在本发明的一些实施方案中，结构I的化合物的优选硫醇型中和剂的pKa接近于发生灭活的介质的pH值，即，如果中和在pH 7下或接近于pH 7下发生，那么优选的硫醇型中和剂具有接近于7的pKa，这将提供阴离子形式的中和剂的亲核性随着它的碱度增加而增加与阴离子形式的浓度随着高于介质pH值的它的pKa增加而降低之间的最佳折中。这个教示内容由我们的实验来支持，其中在10mM苯硫酚(pKa＝6.52)存在下具有式X的一种代表性的结构I的化合物的半衰期经确定小于1分钟，而在相同条件下在谷胱甘肽(SH基团的pKa＝8.75)存在下相同化合物的半衰期是450分钟。
在本发明的另一个实施方案中，结构I的化合物的优选硫醇型中和剂具有直接连接至碳原子的硫醇基，所述碳原子是双键或芳族体系的一部分，或具有完全或部分sp2型杂化。
在又一个实施方案中，结构I的化合物的优选硫醇型中和剂具有至少一个受电子基团，例如砜基(-S(O2)-R)或亚砜基(-S(O)-R)，或酯基(-C(O)OR)或酰胺基(-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NR2)，其中R是任何烷基或经取代的烷基，所述受电子基团连接至SH基团所连接的碳原子。
在本发明的一些实施方案中，持续发生所需中和或中和程度所必需的时间，优选持续小于72小时，更优选持续小于24小时并且甚至更优选持续小于8小时并且甚而更优选持续小于4小时，并且在0至100℃、优选10至60℃并且甚至更优选20至40℃的温度下以及在1至14、优选4至9并且甚至更优选6至8的pH值下，通过与一种或多种中和化合物或与一种或多种中和化合物于一种或多种适当溶剂中的溶液接触来中和所处理的样品、组合物、表面、装置或生物体中残余的一种或多种结构I的化合物，所述溶剂例如但不限于水、水性缓冲液或水性盐溶液；有机溶剂，例如但不限于二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙醇、异丙醇、丙酮、不同分子质量的一种或多种聚乙二醇、甘油、丙二醇、苯甲醇或它们的混合物。所处理的样品中的中和化合物的浓度可以是至多1M，优选至多0.1M，并且甚至更优选至多10mM。
应了解，所处理的介质中残余的结构I的化合物的最快和最有效中和的最佳条件是不同的并且取决于介质的类型和中和化合物的类型，并且可以由本领域普通技术人员通过使用在此所公开或类似的实验方法来合理地选择并以实验方式优化所述条件。
残余的一种或多种结构I的化合物的所需中和或量减少的程度是小于50％，优选大于2倍，甚至更优选大于10倍，即，1对数，并且甚至更优选大于2对数，再优选至少3对数，并且再优选至少4对数，再优选至少5对数，再优选至少6对数，再优选至少7对数，再优选至少8对数，再优选至少9对数，再优选至少10对数或更大。
在本发明的一些实施方案中，一种或多种具有结构I的化合物的一种或多种中和产物，即，所述化合物与一种或多种中和化合物反应的产物，或具有结构I的化合物与所处理样品的组分的反应产物，可能具有对于预期用途非所需的特性。在其它情况下，中和化合物可能具有不合需要的特性。在所有那些情况下，可以从所处理的样品中去除中和产物或反应产物或者中和化合物，或可以通过用不可溶于所处理的介质中的固相剂处理样品来减少它们的量，并且所述固相剂与一种或多种结构I的化合物的中和或反应产物和/或一种或多种中和化合物发生化学反应并且共价结合或吸收或以其它方式螯合所述中和或反应产物和/或中和化合物。处理之后，可以通过过滤、离心、沉降或其它适当的物理方式从所处理的介质中去除固相剂。或者，固相剂可以通过膜、囊或其它适当的物理屏障与所处理的介质接触，所述膜、囊或其它适当的物理屏障可被中和产物或一种或多种结构I的化合物与所处理样品的组分的反应产物或者一种或多种中和化合物渗透并且不可被固相剂渗透。
固相剂可以是微孔或大孔或凝胶型的多孔有机聚合物；或可以是有机或无机型的任何高度多孔固体，例如但不限于无定形碳、活性碳、木炭、硅胶、二氧化钛、氧化锆；或可以是具有高分散度的无孔固体，即，具有提供高表面容积比的小粒度。固相剂还可以是混合型，例如，覆盖有一层多孔材料的固体无孔粒子。
有机聚合物，优选地经过交联，可以是聚苯乙烯聚合物；或聚丙烯酸酯聚合物；或聚甲基丙烯酸酯聚合物；或聚氨酯聚合物；或聚酰胺聚合物；或葡聚糖聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000241
或琼脂糖聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000242
或基于纤维素的聚合物；或基于改性纤维素的聚合物，例如但不限于羧甲基纤维素或二乙氨基乙基纤维素或甲基纤维素；或其它多糖；或具有等规或无规构型或具有其它立构规整度的任何其它线性、支化或交联均聚物或杂聚物或嵌段共聚物；或可能是不可溶于所处理的介质中的任何其它适当的大分子。
对于基于水的介质的处理，亲水性有机聚合物或者可湿润的或可以在基于水的介质中扩张或膨胀的聚合物是高度优选的。
在一些实施方案中，固相剂与一种或多种结构I的化合物的中和或反应产物和/或一种或多种中和化合物发生化学反应并且共价结合所述中和或反应产物和/或一种或多种中和化合物。举例来说，环氧改性树脂，例如环氧改性聚丙烯酸酯树脂，例如LifetechTMECR8215M，或环氧改性琼脂糖树脂，例如
Figure BDA0002994828660000251
Epoxy300，两种树脂均由Purolite Ltd,Bala Cynwyd,PA,USA制造，容易与亲核化合物反应，并且特别与在本公开中用作结构I的化合物的中和剂的亲核化合物反应，例如，与Axen等人,Preparation ofmodified agarose gels containing thiol groups,Acta Chem.Scand.B 1975,29,471所公开的硫代硫酸钠反应。在这个反应中，亲核中和剂打开环氧基环并且共价连接至聚合物分子。在另一个实例中，用含有亲电子硫原子的官能团官能化的聚合物，例如S-甲磺酸酯(P-S-S(O2)CH3，其中P表示聚合物分子)或S-硫代硫酸酯(P-S-S(O2)O-M+，其中P表示聚合物分子，并且M表示金属阳离子)，容易与硫醇，例如结构I的化合物的硫醇型中和剂根据以下反应进行反应：
(P-S-S(O2)O-M-+RSH→P-S-SR+M-SO3 2-
使得硫醇型中和剂通过二硫键连接至聚合物。那些类型的聚合物、聚合物的制备和反应由Roth和Theato,RSC Polymer Chemistry,Ser.6(2013):Thiol-X in Polymer andMaterial Science,第4章:Thiol-Thiosulfonate Chemistry in Polymer Science,第76-94页以及其中引用的参考文献公开，所有文献都通过引用并入本文中。如果所处理的样品含有蛋白质或可以与固相剂的亲电子官能团反应的其它大分子，那么固相剂通过半渗透膜与基体接触，所述半渗透膜可被小分子渗透并且不可被大分子渗透，例如，具有1000至10000Da的截止值的透析膜。
在另一个实施方案中，固相剂吸收一种或多种结构I的化合物的中和产物或降解产物或与基体组分反应的产物和/或一种或多种中和化合物。此种类型的固相剂的实例是活性碳或木炭，它以高亲和力吸收聚胺型化合物(Cohen,S.S.,A Guide to thePolyamines,Oxford Univ.Press,1988)，而且以高亲和力吸收含硫有机化合物，例如硫醇型中和剂，例如但不限于苯硫酚、硫代苯甲醚、呋喃-2-硫醇、硫代水杨酸、4-硫代苯甲酸、二硫代乙酸或硫代乙醇酸。
在另一个实施方案中，固相剂通过与一种或多种结构I的化合物形成多个离子对来吸收所述化合物的中和或反应产物。结构I的化合物、它们的中和产物以及它们的分解产物或与基体组分反应的产物具有多个(大于3个)脂族氮原子，这些原子在中性或酸性pH值下质子化。因此，化合物是聚阳离子，即，它们在中性、近中性或酸性pH值下具有3个或更多个正电荷。
含有多个带负电荷的基团的固相剂可以与聚阳离子化合物形成多个离子对并且通过静电相互作用吸收所述聚阳离子化合物。此类固相剂可以是阳离子交换树脂，例如强阳离子交换树脂，优选含磺基或硫酸酯基的阳离子交换树脂；或弱阳离子交换树脂，优选含羧基的阳离子交换树脂。此类阳离子交换树脂的实例是Dow Chemicals的
Figure BDA0002994828660000261
50X2-200、
Figure BDA0002994828660000262
IR-120或Purolite的NRW160。
选择与阳离子交换树脂相关的可交换阳离子以与样品或其用途相容或对样品或其用途无害，并且优选钠用于生物材料。树脂的离子交换能力应为至少0.01meq/ml，优选至少0.1meq/ml，并且甚至更优选至少1meq/ml。
基于不同聚合物类型、交联程度、官能化程度和孔隙度以及纯度和浸出物释放的程度，存在众多类型的阳离子交换树脂。本领域普通技术人员能够选择与所处理的介质相容并对所处理的介质不存在有害影响，并且同时具有高官能化程度并保留中和的化合物的离子交换树脂。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用具有与其共价连接的多个阳离子基团的固相剂，例如阴离子交换树脂，从所处理的样品或介质中去除结构I的化合物的过量的阴离子型中和剂，例如硫代硫酸盐、硫代磷酸盐、硫代羧酸、硫代乙酸盐、硫代乙醇酸盐、硫代乳酸盐、二硫代羧酸盐、2-巯基乙酸盐、2-巯基琥珀酸盐、2-巯基丙酸盐、硫代水杨酸、4-巯基苯甲酸。阴离子交换剂可以是弱阴离子交换剂，但优选强阴离子交换剂，并且可以具有与其连接的伯氨基、仲氨基或叔氨基或季铵基，这些基团与适当阴离子基团(例如但不限于氯离子、硫酸根、琥珀酸根、乳酸根)或与所处理的样品相容并且对所处理的样品和样品特性无害的其它阳离子基团进行离子配对。
在本发明的一个实施方案中，通过用结构I的化合物处理进行污染物灭活之后，通过用与一种或多种结构I的化合物反应并且共价结合所述化合物的固相剂处理来从样品中去除残余的一种或多种结构I的化合物。固相剂可以含有与一种或多种结构I的化合物的氮丙啶环反应并且打开氮丙啶环的反应基团。固相剂具有一般结构XVII：
Figure BDA0002994828660000271
其中
Q是与一种或多种结构I的化合物发生化学反应并且共价结合所述化合物的反应基团；并且
P是固相剂基体，所述固相剂基体可以是微孔或大孔或凝胶型的多孔有机聚合物；或可以是有机或无机型的任何高度多孔固体，例如但不限于无定形碳、活性碳、木炭、硅胶、二氧化钛、氧化锆；或可以是具有高分散度的无孔固体，即，具有提供高表面容积比的小粒度；或可以是混合型，例如，覆盖有一层多孔材料的固体无孔粒子。
有机聚合物，优选地经过交联，可以是聚苯乙烯聚合物；或聚丙烯酸酯聚合物；或聚甲基丙烯酸酯聚合物；或聚氨酯聚合物；或聚酰胺聚合物；或葡聚糖聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000272
或琼脂糖聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000273
或基于纤维素的聚合物；或基于改性纤维素的聚合物，例如但不限于羧甲基纤维素或二乙氨基乙基纤维素或甲基纤维素；或其它多糖；或具有等规或无规构型或具有其它立构规整度的任何其它线性、支化或交联均聚物或杂聚物或嵌段共聚物；或可能是不可溶于所处理的介质中的任何其它适当的大分子。
对于基于水的介质的处理，亲水性有机聚合物或者可湿润的或可以在基于水的介质中扩张或膨胀的聚合物是高度优选的。
反应基团Q优选地是亲核基团，例如但不限于硫代硫酸根基-OS(O)(O-)S-、或硫代磺酸根基-S(O)(O-)S-、或巯基或硫醇基-SH、-CH2SH、-CH2CH2SH、-CF2CH2SH、-OCH2CH2SH、-NH2CH2CH2SH、-NH(Me)CH2CH2SH、-N(Me2)CH2CH2SH、-COCH2SH、-S(O2)CH2SH、硫脲-NHC(S)NH2或经取代的硫脲基、硫代羧酸-C(O)S-、二硫代羧酸-C(S)S-、硫代碳酸根基O-酯-OC(O)S-、二硫代碳酸根基O-酯、或黄原酸根基-OC(S)S-、硫代膦酸根基-PO(OH)SH和硫代磷酸根基-OPO(OH)SH、邻苯硫基、间苯硫基或对苯硫基-C6H4SH、硫代水杨酸根基团、间硫代苯甲酸根基团或对硫代苯甲酸根基团-O2CC6H4SH，或它们的盐形式。
在一个优选的实施方案中，Q是直接连接至双键或芳族结构或者完全或部分sp2杂化碳原子的-SH基团。
在另一个优选的实施方案中，-SH基团离解成-S-和H+的pKa小于10，优选小于9，并且最优选小于8。
在另一个实施方案中，固相剂具有一般结构XVIII：
Figure BDA0002994828660000281
其中：
P和Q如同XVII中一样，并且L是将基团Q与固相剂基体P连接的连接子或支化连接子，并且其中L可以是线性或支化或树枝状的并且可以含有一个或多于一个与其连接的Q基团。L的实例是二价原子，或线性连接的原子的基团，所述原子可以是相同或不同的，并且连接至基体P和一个或多个基团Q，并且可能或可能不连接至其它原子或原子的基团。L的特定实例可以是氧或硫原子、亚氨基(NH)基团、亚甲基、亚乙基、亚丙基、乙氧基亚乙基、低聚氧乙烯或聚氧乙烯、低聚酯或聚酯或者聚酰胺型连接子。长度为2至10000个单体单元、优选8至200个单体单元的聚氧化乙烯型连接子是尤其优选的。
在另一个实施方案中，固相剂不仅含有亲核基团Q，而且含有辅助基团K并且在一般结构XIX和XX中描绘。基团K不会与一种或多种结构I的化合物反应并且共价连接所述化合物。替代地，基团K帮助基团Q与一种或多种结构I的化合物反应。
Figure BDA0002994828660000291
基团K的功能可以是但不限于经由所谓的邻近效应或邻近电子对效应增强基团Q的亲核性；或增强亲核基团Q的去质子化，由此增加更加亲核的阴离子基团Q-的数目；或与亲核基团Q进行H键结；或与一种或多种结构I的化合物和亲核基团Q相互作用并降低一种或多种结构I的化合物与亲核基团Q之间形成的过渡态的能量；或与一种或多种结构I的化合物非共价结合或离子配对，由此增加所述化合物的局部浓度；或使一种或多种结构I的化合物的氮丙啶的氮质子化或与氮丙啶的氮络合，由此增加所述化合物的反应性。
下文描绘了结构I的化合物的一个实例与结构XVIII的固相剂的一个实例的反应：
Figure BDA0002994828660000301
图1说明了代表性结构I的化合物与固相剂的相互作用，所述固相剂具有通过连接子L连接的亲核硫醇基，和直接连接至聚合物P基体的辅助阴离子磺基。具有结构I的化合物通过多个静电相互作用与磺基结合并且最接近亲核SH基团，所述亲核SH基团攻击质子化并因此活化的氮丙啶环的碳原子，从而打开氮丙啶环并且使结构I的化合物的中和产物共价连接至固相剂。
在另一个实施方案中，结构XIX和XX中的辅助基团K是亲水基团，所述亲水基团具有增强聚合物P的基体在水性环境中的可湿润性或膨胀的功能。在许多情况下，含有病原体的样品可以具有高含水量。此类实例是血液、血液产品或组分、其它体液、间质液、细胞生长培养物或介质、疫苗产品或中间体、或其它生物剂。许多聚合物具有疏水性质，并且因此在未进行适当改性的情况下，可能从它们的内部孔隙空间中排除基于水的流体，即，这些聚合物在此种环境中是不可湿润的或无法膨胀，由此阻止反应基团Q与结构I的化合物反应。引入足够数目的亲水性辅助基团K可以增强多孔固相剂内部的可湿润性，由此使反应基团Q可被含有结构I的化合物的水溶液接近。此类亲水基团的实例可以是但不限于图1中所描绘的磺基或磺酰基，或者羧酸基，所述羧酸基具有可以通过离子配对而结合聚阳离子的结构I的化合物的额外优点。其它此类亲水基团可以是羟基或多元醇基，例如2-羟基乙氧基(HOCH2CH2O)、2,3-二羟基丙氧基(HOCH2CH(OH)CH2O-)，或具有不同数目的单体单元的低聚乙二醇和聚乙二醇部分。
具有结构XVII至XX的固相剂的聚合物基体P可能对一些样品的一些组分具有非所需的影响。举例来说，许多聚合物，例如聚苯乙烯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯和聚酰胺的表面可以结合来自生物剂和生物流体的蛋白质，或可以扰乱蛋白质的构象、结构和/或活性，活化凝血级联因子和血小板，或引发免疫反应。通过连接乙二醇低聚物或具有足够强度和密度的聚合物对此类聚合物进行改性可以改善或消除那些问题。如Harris M.J.(编)Poly(Ethylene Glycol)Chemistry.Biotechnical and Biomedical Applications,PlenumPress,New York and London,1992和其中引用的参考文献所描述，这种方法，本领域技术人员有时称之为“聚乙二醇化”，已经应用于许多生物聚合物，最常见的是治疗性蛋白质，以及体内或体外与生物流体接触的聚合物。
根据本发明的一个实施方案，固相剂是用如上文所描述的亲核反应基团Q并且用极性基团改性的二乙烯基苯交联聚苯乙烯，所述极性基团是乙二醇低聚物，或分子质量为150至100,000Da、优选2,000至40,000Da并且甚至更优选4,000至20,000Da并且密度为每个单体单元至多一个基团的聚乙二醇。
在另一个实施方案中，聚合物是含有亲核反应基团Q和极性基团的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物，所述极性基团是多元醇，例如但不限于2-羟乙基、2,3-二羟丙基、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、五乙二醇或低聚乙二醇或聚乙二醇，并且极性基团以足以达成所需亲水性或其它有利特性的密度连接至C-1，或丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物的羰基，所述特性可以是但不限于免疫原性缺乏，或致血栓性缺乏，或对蛋白质或受体或者所处理的样品或组合物或体液的其它组分的结合或亲和力缺乏。
在另一个实施方案中，通过用固相剂处理样品来去除残余的一种或多种具有结构I的化合物，所述固相剂具有多个与其连接的阴离子基团并且以静电方式通过与一种或多种具有结构I的化合物的带正电荷的氮原子形成多个离子对相互作用来结合具有结构I的化合物。本文公开了此类固相剂和此种方法用于去除结构I的化合物的中和产物。因为结构I的化合物在近中性、中性或酸性pH值下是聚阳离子，所以上述方法和固相剂可以用于从所处理的样品、介质、组合物、设施或生物体中去除残余的结构I的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，通过与吸收结构I的化合物的固相剂接触来从所处理的样品中去除残余的结构I的化合物。此种固相剂包括但不限于活性碳、木炭、无定形碳、无定形二氧化硅、硅胶、无定形氧化铝、二氧化钛或氧化锆，或对结构I的化合物具有吸收亲和力和能力的其它固相剂。用于吸收结构I的化合物的固相剂优选地具有高表面积质量比，这可以通过使用多孔、微孔或纳米孔固体或者高度分散的无孔固体来达成。多孔吸收性固相剂可以成形为粉末、散装固体，或微米尺寸至10mm尺寸的不同尺寸和形状的粒子。优选的粒度为50μm至5mm并且甚至更优选0.1mm至0.5mm，所述粒度范围提供了所吸收的化合物扩散至散体或粒子的足够短的扩散时间，以及对于粒子去除来说足够高的粒子过滤或沉降速率。
在另一个实施方案中，吸收性固相剂可以不直接但通过半渗透屏障与所处理的介质接触，所述半渗透屏障使得旨在被吸收的化合物穿过，并且不允许介质的组分穿过，因为这些组分与固相剂的相互作用是不合需要的，例如蛋白质或其它大分子。此种半渗透屏障的实例是具有允许一种或多种结构I的化合物扩散并防止具有更高分子量的分子(例如，生物聚合物)扩散的分子量截止值的改性纤维素膜或其它透析膜。
在本文所描述的方法的一个实施方案中，所述方法用于灭活病毒，所述病毒可以是包膜、无包膜、DNA或RNA病毒、逆转录病毒、噬菌体或任何其它病毒。此类病毒的实例包括但不限于乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV；1型和2型)、疟疾、梅毒、布鲁氏菌病、巴贝西虫病、钩端螺旋体病、虫媒病毒感染(例如，科罗拉多壁虱热(Coloradotick fever))、回归热、恰加斯病(Chagas disease)(克氏锥虫(Trypanosoma cruzi))、西尼罗河病毒(WNV)、I型人类嗜T淋巴细胞病毒和病毒性出血热(例如，埃博拉病毒(Ebolavirus)和马尔堡病毒(Marburg virus))。
在本文所描述的方法的一个实施方案中，所述方法用于灭活原核生物，例如古生菌或细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、产孢子细菌和细菌孢子、或支原体。可以用本文所提供的方法处理的病原体性细菌和抗微生物剂抗性细菌的实例包括但不限于：艰难梭菌(Clostridium difficile)(C.difficile)、肠杆菌科(CRE)细菌、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、弯曲杆菌(Campylobacter)、不动杆菌(Acinetobacter)、氟康唑抗性念珠菌(Fluconazole-Resistant Candida)、超光谱肠杆菌科(ESBL)、结核病(TB)、抗药性伤寒沙门氏菌血清型(Drug-Resistant Salmonella Serotype Typhi)、万古霉素抗性肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus)(VRE)、多重抗药性绿脓假单胞菌(Multidrug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa)、抗药性非伤寒沙门氏菌(Drug-Resistant Non-Typhoidal Salmonella)、抗药性肺炎链球菌(Drug-ResistantStreptococcus Pneumoniae)、抗药性志贺氏菌(Drug-Resistant Shigella)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus)(MRSA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus)、红霉素抗性A群链球菌(Erythromycin-Resistant Group A Streptococcus)、克林霉素抗性B群链球菌(Clindamycin-Resistant Group B Streptococcus)和其它细菌。
在另一个实施方案中，所述方法用于灭活真核生物、单细胞或多细胞真核生物，包括但不限于真菌、原生动物、单细胞或多细胞寄生虫(包括蠕虫、血吸虫或线虫或它们的卵)、单细胞或多细胞藻类和甲壳类。
本文所提供的方法可以用于处理不合需要的生物结构，包括但不限于细菌生物膜或其它微生物生物膜、苔癣、结垢或生物淤积积聚物。
本发明的方法可以用于不仅灭活病原性微生物，而且灭活非病原性细胞，例如白细胞，此时它们在所处理的样品中，例如可输血的血液或血液产品中的存在并不是需要的。
如Botsios,S.和Manuelidis,L."CJD and Scrapie Require Agent-AssociatedNucleic Acids for Infection",J.Cell Biochem.,2016,117,1947-58及Supattapone,S."Synthesis of high titer infectious prions with cofactor molecules",J.Biol.Chem.,2014,289,19850-4所公开，本文所提供的方法可以用于不仅灭活病毒、原核生物和真核生物，而且用于灭活其它感染物，例如朊病毒，特别是当朊病毒的病原活性或感染性依赖于核酸，尤其核糖核酸的存在或活性时。
本文所提供的方法可以用于处理样品、组合物、介质、设施或生物体。样品可以是人类或动物血液、去白细胞的血液、全血、血液产品，包括血浆、血清、红血细胞或红血细胞浓缩液、血小板或血小板浓缩液、血清或血浆组分、因子或酶、旨在用于输血的输血用血液和血液组分、单采血液组分、体液、动物血清(包括用作细胞培养物添加剂的血清)；源于真核生物或原核生物的介质、疫苗、疫苗制剂组合物、用于制备全病原体杀灭疫苗的微生物悬浮液；化妆品和药物组合物、饮料、食品；或设施、器皿、装置或它们的表面；或生物体，包括动物、哺乳动物或人类生物体和它们的部分，包括生物样品和活检体。所述方法可以用于处理生物剂，包括但不限于抗体、免疫球蛋白、激素、酶、生长因子、凝血因子、白蛋白或补体系统组分。设施可以是但不限于医学或兽医学装置，包括一次性装置、和仪器。设施包括但不限于工业或家用设备、器具、器械、机构、机器或材料，或者病原体或其它生物体的存在可能不合需要或需要加以控制的任何其它物品。设施还包括但不限于导管、通道、软管、管路、通风口、热交换器、污水管、沟道，或任何其它流体或气体管道，或与水性流体接触的任何表面，例如海上船舶、筛网或过滤器，其中病原体、微生物或其它生物体的存在是不合需要的或需要加以控制，例如在生物淤积中。
可以对输血用血液或血液产品进行用于病原体灭活的方法，其中用一种或多种结构I的化合物处理以及用于所述化合物的去除、灭活和灭活产物和/或灭活剂的去除的后续处理在无菌的部分或完全封闭系统中完成。
在一些实施方案中，如图2中所说明，将结构I的化合物与抗凝血剂溶液一起装载于血液收集袋中。
在其它实施方案中，如图3中所说明，将配制成液体或固体制剂的结构I的化合物装载于独立的血袋中。
在其它实施方案中，如图4至图9中所说明，将配制成液体或固体制剂的结构I的化合物预装载于小容器中，所述容器附接至血液收集或血液处理袋并且由易破密封件与所述袋隔开。
在其它实施方案中，如图10中所说明，将结构I的化合物装载于胶囊中，所述胶囊通过易破密封件连接至具有溶液的容器并且通过另一个易破密封件连接至血液处理袋。
在一些实施方案中，如图4和图6中所说明，将中和剂的溶液或液体制剂放置于容器中，所述容器通过易破密封件附接至血液处理袋，或可以直接放置于中和处理血袋中。如图2、图3、图5、图6、图7和图8中所说明，可以将用于去除残余的结构I的化合物或它的中和产物或中和剂的固相剂放置于筒中，其中所述筒通过易破密封件连接至处理袋和接收袋，或者如图9中所说明，可以呈自由珠粒形式放置于血袋中，或半渗透容器(囊)中。
使用图2中所说明的全血单元封闭加工系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂和结构I的化合物的收集袋中；步骤2-孵育以进行病原体灭活；步骤3-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物并且在纯化的血袋中收集纯化的血液。
使用图3中所说明的全血单元封闭加工系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的收集袋中；步骤2-将抗凝全血转移至含有结构I的化合物的固体制剂的处理袋中，混合并孵育以进行病原体灭活；步骤3-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物并且在纯化的血袋中收集纯化的血液。
使用图4中所说明的全血单元加工封闭系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至血液中；步骤3-孵育血液与结构I的化合物；步骤4-破开胶囊并且添加灭活剂的液体制剂，混合并孵育以中和结构I的化合物。
使用图5中所说明的全血单元封闭加工系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的收集袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至血液中；步骤3-混合并孵育血液与结构I的化合物；步骤4-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物并且在纯化的血袋中收集纯化的血液。
使用图6中所说明的全血单元加工封闭系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至血液中；步骤3-孵育血液与结构I的化合物；步骤4-破开胶囊并且添加灭活剂的液体制剂，混合并孵育以中和结构I的化合物；步骤5-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除结构I的化合物的中和产物。
使用图7中所说明的全血单元加工封闭系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至血液中；步骤3-孵育血液与结构I的化合物；步骤4-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒和白细胞过滤器来去除残余的结构I的化合物并进行白细胞过滤；步骤5-使纯化的去白细胞的血液离心至RBCC袋中；步骤6-将分离的血浆转移至血浆袋中；步骤7-将防腐液转移至红血细胞中并混合以制备血细胞浓缩液。
使用图8中所说明的全血单元加工封闭系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-通过经白细胞过滤器过滤至LF血袋中对全血进行去白细胞；步骤3-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至LF血袋中过滤白细胞的血液中；步骤4-混合并孵育血液与结构I的化合物；步骤5-通过使所处理的血液穿过含有固相剂的筒来去除残余的结构I的化合物；步骤6-使纯化的去白细胞的血液离心至RBCC袋中；步骤7-将分离的血浆转移至血浆袋中；步骤8-将防腐液转移至红血细胞中并混合以制备血细胞浓缩液。
在本发明的一些实施方案中，通过用固相剂单一处理可能不会达成残余的结构I的化合物减至所需水平。在此类情况下，如图9中所说明，可能需要用固相剂进行两个或更多个后续处理。
使用图9中所说明的全血单元加工封闭系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的液体制剂的胶囊并且将所述制剂添加至血液中；步骤3-混合并孵育血液与结构I的化合物；步骤4-通过将所处理的血液转移至含固相剂(呈自由流动的珠粒形式，或装填于半渗透囊中)的第一个袋中并孵育来去除残余的结构I的化合物；步骤5-在第一个去除步骤之后通过将血液转移至含固相剂(呈自由流动的珠粒形式，或装填于半渗透囊中)的第二个袋中并孵育来二次去除残余的结构I的化合物；步骤6-通过使所处理的血液穿过白细胞过滤器至RBCC袋中来进行白细胞过滤；步骤7-使纯化的去白细胞的血液离心至RBCC袋中；步骤8-将分离的血浆转移至血浆袋中；步骤9-将防腐液转移至红血细胞中并混合以制备血细胞浓缩液。
使用图10中所说明的全血单元加工系统的方法是：步骤1-用放血针将血液收集于含有抗凝血剂的袋中；步骤2-拆封含有结构I的化合物的制剂的胶囊并且将结构I的化合物溶解于来自溶剂袋的溶剂中；步骤3-将结构I的化合物的溶液添加于所收集的血液中，混合并孵育；步骤4-添加中和剂溶液并孵育以中和残余的结构I的化合物。
图11中说明了使用结构I的化合物的固体制剂的容器的另一个实例，所述容器通过易破密封件连接至用于溶解制剂的溶剂的容器并且通过另一个易破密封件连接至具有待处理样品的容器。
在另一个实施方案中，将固相剂装填于筒中并以干燥形式储存于所述筒中，并且在使用前用与所处理的样品和样品的使用方法相容的液体组合物预湿润和/或冲洗。举一实例，图12说明了包括装填有干燥固相剂的筒的封闭系统，所述固相剂容纳于两个过滤元件之间。所述筒通过易破密封件连接至含有湿润介质的容器并且通过另一个易破密封件连接至用于纯化的样品的容器。湿润介质容器通过易破密封件连接至用于一种或多种结构I的化合物处理样品的容器。破开筒与具有湿润介质的容器之间的密封件并且将介质转移至筒中提供了固相剂湿润。破开剩余密封件允许所处理的样品穿过湿润的固相剂。
在另一个实施方案中，使用前在无菌条件下冲洗固相剂。此种冲洗对于最小化或消除在储存时段期间可能积聚于固相剂中的浸出物可能是重要的。优选地用与固相剂、所处理的样品和样品的预期用途相容的组合物完成洗涤。图13说明了用容器中所含的溶剂冲洗装填于筒中的固相剂的封闭系统，所述容器通过易破密封件连接至固相剂筒。然后在破开筒与另一个集成容器之间的密封件之后，在所述容器中收集洗涤介质。然后用适当的夹具或再密封装置，例如T-密封件(Terumo管密封装置)将两个易破密封件再密封。破开剩余密封件允许所处理的样品穿过洗涤的固相剂。
在一些实施方案中，固相剂容纳于筒/柱中在筒/柱的两端或一端上的可渗透屏障之间。屏障允许所处理的样品穿过筒，但不允许固相剂穿过。此类屏障的实例是但不限于过滤器/筛网、由烧结材料制成的圆盘、网、筛或织物，或任何其它多孔材料，或具有尺寸小于固相剂粒子尺寸的开口或通道的材料。此类屏障在图12和图13中以虚线指示。
在另一个实施方案中，通过UV或γ照射、热处理、高或低pH值溶剂处理或其它化学处理，例如用氧化乙烯、臭氧、漂白、戊二醛、甲醛、过氧化氢、过乙酸或银化合物处理，或通过本领域技术人员已知的其它方法，将根据所述方法用于病原体灭活的所公开的封闭系统灭菌。可以通过过滤、UV或γ照射、热处理或本领域技术人员已知的其它方法，将结构I的化合物和它们的中和剂的液体制剂灭菌。在装填于筒或其它容器或半渗透囊中之前或之后，并且在集成于封闭系统中之前或之后，可以通过UV或γ照射、热处理、高或低pH值溶剂处理、化学处理将固相剂灭菌。
图2至图13中的病原体减少封闭系统的实例出于说明的目的而提供并且不意图限制本发明的范围。
在一些实施方案中，一种或多种病原体存在于生物体中，所述生物体可以是动物；哺乳动物，包括灵长类动物、啮齿动物、海洋哺乳动物；或任何野生或驯养动物或人类。在这些实施方案中，体内完成用结构I的化合物处理。通过静脉内、经口、局部、经直肠、皮下、肌肉内施用、通过吸入或通过它们的组合来完成这种体内处理，并且可以通过单次施用、通过多次施用或通过连续施用并且以足以达成所需的病原体减少的一个或多个剂量来完成处理。此种体内处理可以跟随或组合进行用结构I的化合物的灭活剂，例如但不限于硫代硫酸钠的体内处理。
在其它实施方案中，体内完成用结构I的化合物处理生物体；并且通过处理生物体的体液，例如血液或血浆来离体完成一种或多种结构I的化合物的中和和/或去除或它们的中和或降解产物的去除，随后将所述体液返回(回输)至生物体。可以通过定期移出体液的一部分、处理和输血，或通过连续抽取、处理和输血来分批完成此种离体处理。在后一种情况下，单采工艺的使用和单采血浆的连续处理是优选的。结构I的化合物的中和或去除可以通过穿过含有螯合一种或多种化合物的固相剂的筒，或通过与中和剂的溶液混合，随后孵育，继而可以穿过具有用于螯合中和产物和/或中和剂的固相剂的筒来完成。
在其它实施方案中，通过离体处理含有病原体的生物体的体液来完成所述生物体的处理。可以通过定期移出体液的一部分、处理和输血，或通过连续抽取、处理和输血来分批完成这种处理。在后一种情况下，单采工艺的使用和单采血浆的连续处理是优选的。通过将适量的一种或多种结构I的化合物的制剂添加至体液中并孵育，优选地随后可以进行去除或中和残余的一种或多种结构I的化合物的处理，和/或任选地进行去除结构I的化合物的灭活或降解产物的处理来完成离体处理，随后将纯化的体液回输至生物体。如上文对于用一种或多种结构I的化合物进行体内处理所描述来完成用于去除或中和一种或多种结构I的化合物和/或去除所述化合物的中和产物的处理。
在用一种或多种结构I的化合物对生物体进行体内或离体处理的方法的一个优选实施方案中，存在于生物体中并且旨在通过处理而灭活的至少一种病原体对一种或多种抗病原体处理具有抗性。
实施例
实施例1
合成化合物VI，N1,N4-双(3-(氮丙啶-1-基)丙基)-N1,N4-二甲基丁烷-1,4-二胺
A.合成氮丙啶：将58.4g(0.503mol)2-氯乙胺盐酸盐溶解于100ml水中。在搅拌下将溶液逐滴添加至56.4g氢氧化钠于20mL水中的溶液中。在50℃下再搅拌2.5小时后，通过在部分真空下蒸馏来纯化氮丙啶。在剧烈搅拌并且在0-8℃的温度下冷却时，将固体NaOH逐份添加至蒸馏物中。在这个温度下搅拌混合物30分钟。从固体NaOH倾析液体，并且分离上层，得到22.5g湿氮丙啶。通过添加小份的粉末状KOH并且在每份之后倾析来干燥这种物质，直至KOH保持干燥的外观。在-20℃下将所得干燥的氮丙啶储存于KOH托盘下方。产量16.02g，74％透明液体。
B.合成2-(1-氮丙啶基)丙醛单甲基乙缩醛，IV：将6.65g(7.93ml，0.120mol)丙烯醛添加至100ml MeOH中。用Ar吹扫溶液，并且在Ar下于干冰浴中冷却。逐滴添加4.99g(6.00ml，0.124mol)氮丙啶并且同时搅拌。去除干冰浴，并且将反应混合物放至室温。在Ar下和-20℃下密封储存由此获得的2-(1-氮丙啶基)丙醛单甲基乙缩醛IV的溶液。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ:4.66(t,J＝5.54Hz,1H),3.36(s,3H),2.30-2.44(m,2H),1.79-1.93(m,2H),1.76-1.79(m,2H),1.30-1.33(m,2H)。13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:97.9,57.5,36.5,26.6。
C.合成N1,N4-双(3-(氮丙啶-1-基)丙基)-N1,N4-二甲基丁烷-1,4-二胺，VI：在冰浴中冷却来自步骤B的化合物IV的甲醇溶液。逐滴添加5.85g(50.4mmol)N,N'-二甲基丁烷-1,4-二胺并且同时搅拌。去除浴，并且在30分钟后，在搅拌并在-4-+4℃下冷却时逐份添加10g硼氢化钠。在室温下4小时并且进行水性处理并用乙醚萃取之后，通过硅胶色谱法纯化产物。蒸发含有产物的部分并且对残余物进行真空蒸馏，得到3.84g呈淡黄色油状的化合物VI。1H NMR(300MHz,C6D6)δ:2.43(t,J＝7.2Hz,4H),2.30(m,4H),2.13(t+s,J＝6.7Hz,10H),1.75(m,4H),1.55(m,4H),1.51(m,4H),0.79(m,4H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:60.74,58.55,56.49,42.52,28.77,27.50,26.11。MS(电喷雾，正模式)m/z:283.1，计算值[M+H]+283.2。
实施例2
合成化合物XVI，3-(氮丙啶-1-基)-N-(3-(氮丙啶-1-基)丙基)-N-甲基丙-1-胺
使用3.91g(4.35ml)甲胺于水中的40％溶液代替N,N'-二甲基腐胺，如实施例1合成化合物XVI。分级真空蒸馏之后，获得2.48g呈轻油状的化合物XVI。1H NMR(500MHz,C6D6)δ:2.43(t,J＝7.0Hz,4H),2.12(s,3H),2.11(t,J＝7.0Hz,4H),1.74(m,4H),1.54(m,4H),1.51(m,4H),0.77(m,4H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:60.00,55.72,41.78,28.01,27.50,26.79。MS(电喷雾，正模式)m/z:198.1，计算值[M+H]+189.2。
实施例3
合成化合物X，N1-(3-(氮丙啶-1-基)丙基)-N4-(3-((3-(氮丙啶-1-基)丙基)(甲基)氨基)-丙基)-N1,N4-二甲基丁烷-1,4-二胺
A.合成N1,N5,N10-三甲基亚精胺：将5.70g(6.16ml，39.3mmol)亚精胺与61.1g(66.6ml，0.824mol)甲酸乙酯混合，并且使混合物回流30小时，然后在真空下蒸发，得到9.32g呈油状的N1,N5,N10-三甲酰基亚精胺。将9.00g氢化铝锂添加至300ml无水四氢呋喃中。在Ar下和搅拌下逐滴添加9.00g N1,N5,N10-三甲酰基亚精胺。使反应混合物回流4小时，然后冷却至室温。在冷却和有效机械搅拌下逐滴添加22ml水(起泡)，随后添加90ml 50％氢氧化钾水溶液。剧烈搅拌1小时后，添加150ml四氢呋喃并且分离各层。用150ml四氢呋喃萃取下层，并且将萃取物与上层合并。在真空下蒸发合并的有机层，并且将残余物溶解于75ml乙醚中，并且经固体氢氧化钾干燥过夜。蒸发无水乙醚溶液并且对残余物进行分级真空蒸馏，得到5.30gN1,N5,N10-三甲基亚精胺。H NMR(300MHz,C6D6)δ:2.53(t,J＝6.7Hz,2H),2.45(t,J＝6.6,2H),2.22-2.35(m,4H),2.30(s,3H),2.28(s,3H),2.12(s,3H),1.58(m,2H),1.46(m,4H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:58.28,56.52,52.44,51.03,42.21,36.83,28.21,28.19,25.67。MS(电喷雾，正模式)m/z:188.1，计算值[M+H]+188.2。
B.合成化合物X：使用3.71g(4.43ml，67mmol)丙烯醛；56ml甲醇；2.79g(3.35ml，69mmol)氮丙啶；5.30g(28.1mmol)N1,N5,N10-三甲基亚精胺代替N,N'-二甲基腐胺；和5.58g硼氢化钠，按照实施例1合成化合物X。处理和分级真空蒸馏之后，获得2.99g呈灰白色油状的化合物X。1H NMR(300MHz,C6D6)δ:2.39-2.45(m,4H),2.32-2.38(m,4H),2.27-2.31(m,4H),2.14(s,6H),2.13(s,3H),2.10-2.15(m,4H),1.73(五重峰,J＝7.0Hz,4H),1.58-1.68(m,2H),1.54-1.56(m,4H),1.47-1.53(m,4H),0.80-0.82(m,4H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:60.74,58.59,58.55,56.60,56.56,56.51,56.48,42.65,42.54,28.76,27.50,26.43,26.14,26.10。MS(电喷雾，正模式)m/z:354.1，计算值[M+H]+354.3。
实施例4
合成化合物XIV，N1,N4-二(3-((3-(氮丙啶-1-基)丙基)-(甲基)氨基)丙基)-N1,N4-二甲基丁烷-1,4-二胺
A.合成N1,N5,N10,N14-四甲基精胺：按照实施例3A，从1.60g(7.86mmol)精胺至四甲酰基精胺，随后用50ml无水四氢呋喃中的2.00g氢化铝锂还原来制备N1,N5,N10,N14-四甲基精胺，并且在水性处理和分级真空蒸馏之后分离出1.59g灰白色油状物。H NMR(300MHz,C6D6)δ:2.53(t,J＝6.7Hz,4H),2.34(t,J＝6.9,4H),3.30(s,6H),2.28(m,4H),2.13(s,6H),1.59(五重峰,J＝6.8Hz,4H),1.50(m,4H),0.87(bs,2H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:57.92,56.25,50.75,41.94,36.53,27.88,25.37。MS(电喷雾，正模式)m/z:258.1，计算值[M+H]+258.3。
B.合成化合物XIV：使用9ml甲醇中的10mmol 3-(氮丙啶-1-基)丙醛；0.80g(3.1mmol)N1,N5,N10,N14-四甲基精胺代替N,N'-二甲基腐胺；和0.77g硼氢化钠，按照实施例1合成化合物XIV。水性处理、分级真空蒸馏和硅胶色谱法纯化之后，获得0.398g呈灰白色油状的化合物XIV。1H NMR(300MHz,C6D6)δ:2.44(t,J＝7.0Hz,4H),2.34-2.40(m,8H),2.31(m,4H),2.15(s,6H),2.14(s,6H),2.11-2.16(m,4H),1.75(五重峰,J＝7.0Hz,4H),1.65(五重峰,J＝7.4Hz,4H),1.53(m,4H),1.47-1.53(m,4H),0.79-0.81(m,4H)。13C NMR(75MHz,C6D6)δ:60.77,58.64,56.64,56.60,56.54,42.65,28.78,27.51,26.46,26.18。MS(电喷雾，正模式)m/z:425.2，计算值[M+H]+425.4。
实施例5
对核酸的反应性
通过在37℃下于PBS(pH 6.7)中10μM 21聚体合成性低聚脱氧核糖核苷酸-5'ATACCT CAT GGT AAT CCT GTT-3'(在它的序列中包含所有四个核碱基)与200μM化合物X反应来追踪对核酸的反应性。图14说明了在37℃下0小时(上色谱图)和6小时(下色谱图)孵育之后孵育混合物的HPLC分析。对应于低聚核苷酸的峰减小并且具有更高保留时间的化合物出现，清楚地证实了化合物X与低聚核苷酸的共价加合物的出现。
通过质谱法研究在pH 7下和室温下于PBS中100μM合成性23聚体低聚核糖核苷酸(UGG ACU CCG AUA ACG GAG UAU GU)与100μM化合物X的反应。结果在图15中示出，其中上图是处理之前低聚核苷酸的质谱，并且下图是添加化合物X之后反应6分钟的质谱。上图中的1845.22m/z峰应归于具有-4电荷态的低聚核苷酸离子(M-4H)/4，并且对应于具有7384.9Da质量(低聚核苷酸计算质量7384.0Da)的中性分子。在下谱图中，与化合物X一起孵育6分钟后出现额外的峰，1933.54的m/z对应于具有7738.2Da质量的中性分子。化合物X与低聚核苷酸的共价单加合物的分子质量是7737.3Da。
实施例6
结构I的化合物与细胞色素C的反应性缺乏
使用烷基化分子以灭活血液产品中的病原体具有潜在有害的副作用-它们与蛋白质的反应可能产生新抗原，即，它们可能会变成半抗原。为了评估结构I的化合物的半抗原潜在性，研究所述化合物将细胞色素C改性的能力。选择细胞色素C(12384Da的MW)作为模型蛋白质，这是因为它含有许多具有亲核侧链的氨基酸：19Lys、2Cys、3Asp、9Glu、3His和4Tyr，这些氨基酸是由结构I的化合物烷基化的潜在标靶。在40℃下将0.1mg/mL(8μM)细胞色素C于磷酸盐缓冲盐水中的溶液与0(对照)、0.1、1和10mM化合物VI或X一起在pH 7.0下孵育30小时。在1小时、4小时和30小时通过电喷雾质谱法以正电离模式并且直接输注至LCQAdvantage质谱仪(Thermo-Finnigan,San Jose,CA)中用于形成蛋白质与测试化合物的共价加合物来分析孵育混合物的等分试样。结果明确地显示在任何浓度和时间点下测试化合物VI和X两者与细胞色素C的共价加合物都不存在(对于代表性质谱，参见图16)。
实施例7
结构I的化合物与病毒表面蛋白质的反应性缺乏
使用呼吸道合胞病毒(RSV)作为模型病原体来评价结构I的化合物将病原体的蛋白质改性的潜力，并且选择RSV的融合体(F)用于测试改性。F蛋白质是大的(574个氨基酸)病毒包膜相关表面糖蛋白，它在宿主识别和病毒插入中起重要作用。选择这种蛋白质是因为它的高敏感性和不稳定性，以及对不同抗原表位具有特异性的单克隆抗体的可用性和对F蛋白质构象变化的敏感性。在40℃下用浓度均为100μM的化合物VI和化合物X处理蔗糖梯度纯化的RSV 4小时。如实施例16中所述中和残余的化合物VI和X。对照包括在40℃下孵育4小时的模拟处理的RSV和在4℃下保持的未处理的病毒。根据Schmidt等人,J Virol.2014；88(17):10165-76.数字对象标识符:10.1128/JVI.01250-14.PubMed PMID:24965456所描述的程序进行ELISA测定。将于PBS中的八个连续1:2稀释液一式三份涂板(50微升/孔)至96孔板中，并且在4℃下孵育过夜。将孔用PBS洗涤并且用PBS/1％BSA封闭。添加抗蛋白质F抗体，并且孵育混合物2小时，随后洗涤并添加抗小鼠IgG HRP缀合物。另一轮洗涤之后，添加TMB底物和硫酸并且使用ELISA读取器SPECTRAmax PLUS(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)进行读取。在图17中，呈现了通过ELISA确定的抗F抗体与化合物VI和X处理的RSV结合的结果。从这些实验显而易见，在完全灭活病毒的条件下用化合物VI和X处理并不改变F蛋白质由高度特异性的构象敏感性单克隆抗体识别的程度，指示通过处理对F蛋白质的改性并未发生。
实施例8
在细菌生长介质中用化合物VI、化合物X和化合物XIV进行细菌灭活
将一组G+和G-细菌在它们各自的生长介质中使用化合物VI、化合物X和化合物XIV进行灭活。使所有细胞在相应介质中生长至对数中期，通过离心收集，再悬浮于林格氏溶液(Ringer's solution，RS)中，并且在室温下用100μM化合物VI、化合物X和化合物XIV处理，这些化合物以于RS中的100x浓缩液添加至悬浮液中。对照仅接受RS。在孵育结束时，在室温下孵育30分钟期间用10mM硫代磷酸钠中和未反应的化合物VI、化合物X和化合物XIV。通过标准群落琼脂板计数，使用连续稀释对活细胞进行计数。表1汇总了用化合物VI、化合物X和化合物XIV将大肠杆菌(E.coli)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)处理1小时的典型结果。明显地，甚至在1小时处理后，对于所有三种化合物都观测到活细胞的减少。化合物X和化合物XIV显示出比化合物VI显著更高的效力。使用这两种化合物，将两个种类灭活至低于检测限(1.00Log10 CFU/mL)。
Figure BDA0002994828660000471
实施例9
用化合物VI和化合物X进行病毒灭活
通过使用化合物VI和化合物X将猪细小病毒(PPV)灭活。在室温下用100μM化合物VI和化合物X以及10％病毒外加，于RS(pH6.9)中进行处理。通过在室温下与10mM Na2S2O3一起孵育2小时来淬灭残余的化合物。使用允许用于PPV猪睾丸细胞的标准终点稀释测定来确定病毒效价，以Log10TCID50/mL表示。将指示细胞孵育6天后，在显微镜下通过目视检查对感染的孔进行计数。为了确认结果，使用来自第一板孔的经调节介质作为样品进行二次感染。
通过使用化合物VI或化合物X将人类呼吸道合胞病毒(RSV)灭活。出于该目的，在室温下用100μM化合物VI和化合物X处理蔗糖梯度纯化的病毒。在孵育1小时、4小时和6小时的时候，获取等分试样并且在室温下用10mM硫代磷酸钠淬灭30分钟。在修改的空斑测定中使用标准10x连续稀释来确定病毒效价。对于模拟处理的病毒，甚至在室温下孵育6小时后仍未发现RSV感染性的显著变化(在不同实验中，效价的降低在0.11-0.36Log10 PFU/mL的范围内)。
通过使用化合物VI和化合物X将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)灭活。除了指示细胞是牛陀螺状细胞以外，BVDV灭活采用了PPV灭活所用的方案。
实验结果在表2中示出。观测到病毒效价的降低多达5至7对数，并且在与化合物VI一起孵育6小时后将所有病毒杀灭至低于检测限。
Figure BDA0002994828660000481
实施例10
在全血(WB)、去白细胞的血液(LB)和红血细胞浓缩液(RBCC)中用化合物VI和化合物X进行细菌灭活
在这项研究中使用两种G-种类小肠结肠炎耶尔森菌和荧光假单胞菌(均是嗜冷菌)以及两种G+细菌表皮葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，全部是已知的血液污染物。向所有血液样品中外加在RS中制备的约0.1％细菌储备悬浮液并且在室温下平衡30分钟。每次外加均使用新鲜生长过夜的细菌培养物。将化合物VI和化合物X添加至外加的血液中，达到100、250和500μM的最终浓度。对照样品(Ctr)仅接受溶剂。在室温下进行孵育6小时，随后添加灭活剂100x硫代硫酸钠，并且在室温下再孵育2小时。孵育和淬灭之后，获取等分试样用于连续稀释和板液滴记数，并且将促进细菌生长的溶液(含有胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物和酪蛋白氨基酸)添加至剩余体积中。通过将琼脂板划线来确认生长/无生长结果。
表3反映了分别在WB、LB和RBCC中的典型灭活实验的结果。
Figure BDA0002994828660000491
实施例11
在全血(WB)、去白细胞的血液(LB)和红血细胞浓缩液(RBCC)中用化合物VI和化合物X进行病毒灭活
向所有血液样品中外加在RS中制备的约20％病毒储备液并且在室温下平衡30分钟。类似于实施例10中的细菌灭活方案进行BVDV或PPV的病毒灭活研究。如实施例9中所描述，在T0时并且在孵育6小时后确定病毒效价(以Log10 TCID50/mL表示)。表4中呈现了BVDV和PPV灭活的结果。
Figure BDA0002994828660000492
Figure BDA0002994828660000501
实施例12
用化合物XVI灭活RSV
如实施例9中所描述，在室温和40℃下用不同浓度的化合物XVI灭活RSV。结果在表5中示出。
表5.在林格氏/乳酸盐溶液中用化合物XVI以浓度依赖性灭活RSV(6小时)
Figure BDA0002994828660000502
*-所有效价都以Log10 PFU/mL表示。
Figure BDA0002994828660000503
-以T0效价与在指定处理条件下的对应效价之间的差来计算灭活。
实施例13
在热灭活的胎牛血清(FBS)中用化合物VI灭活BVDV和PPV
向FBS的等分试样中外加5％(vol/vol)BVDV和PPV储备液并且在室温下平衡60分钟。将含10mM化合物VI的磷酸盐缓冲液(pH6.9)添加至外加的FBS中达到100μM的最终浓度，并且如表6中所描述处理所有等分试样。
表6.病毒灭活的对照和处理条件
Figure BDA0002994828660000511
在40±1℃下用100μM化合物VI将病毒外加的血清样品处理60分钟。在不含血清的DMEM中连续稀释(1:5或1:10)来自所有样品(对照1-4和处理样品)的等分试样，并且将来自每个稀释液的25μL一式三份涂板至96孔板中的它们各自的指示细胞上。在37℃下于5％CO2孵育箱中将板孵育60分钟以允许病毒吸附。为了增加检测限，未稀释的样品另外用于感染24孔板中或10cm皮氏培养皿(Petri dish)中的宿主细胞。吸附之后，在未抽吸25μL稀释液的情况下将所有孔用DMEM/5％FBS填充，并且在37℃下于CO2孵育箱中将板进一步孵育6-7天。通过目视检查来检测每个孔中病毒致细胞病变效应的发展，并且用于计算各自的病毒效价，以Log10 TCID50/mL表示。检测限是0.2个感染粒子/mL。在一些情况下，为了确认测定的结果，6-7天后收集来自接种的孔的上清液并且用于感染24孔板中的新鲜细胞。
表7中呈现的实验结果证实了用化合物VI处理有效地将BVDV和PPV两者灭活至低于测定的检测限。
表7.在40℃下孵育60分钟期间用100μM化合物VI灭活FBS中的BVDV和PPV。
Figure BDA0002994828660000512
*BLD，低于检测限，≤-0.7Log10 TCID50/mL
实施例14
作为原生动物和真菌灭活剂的结构I的化合物
在生理温度下于新鲜人类红血细胞中进行血源性寄生虫恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)3D7和分歧巴贝斯虫(Babesia divergens)Rouen的灭活，持续24小时。250μM浓度的化合物XIV展现出强的抗寄生虫活性，使活疟原虫生物体的数目减少约7+对数并且使巴贝斯虫数目减少8对数。代表病原性真菌的白色念珠菌(Candida albicans)的高于6对数灭活和作为有纤毛原生动物的模型生物体的嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的3对数灭活在它们各自的生长介质中用250μM化合物XIV来达成。
实施例15
用2-巯基乙酸乙酯中和化合物X
在室温下将100μM化合物X于磷酸盐缓冲盐水中的溶液与10mM 2-巯基乙酸乙酯一起孵育，并且通过混合物的LCMS分析来确定化合物X的浓度变化以及中间中和化合物(XXI)和最终中和化合物XXII的形成。下文呈现了中和的反应流程。下表8和图18中呈现了化合物X、中间中和产物Q1(化合物XXI)和最终中和产物Q2(化合物XXII)的峰面积。
Figure BDA0002994828660000521
表8.在PBS中以及室温下用2-巯基乙酸乙酯中和化合物X的反应的LCMS分析。
Figure BDA0002994828660000531
实施例16
用硫代硫酸钠中和残余的化合物VI
硫代硫酸钠与结构I的化合物反应的研究显示，Na2S2O3与化合物的氮丙啶基快速反应，打开环并且使所述化合物转化成生物学上耐受良好的硫代硫酸酯，所述硫代硫酸酯预期将经历快速肾排泄。通过反应混合物的LCMS分析来确定在PBS中100μM化合物VI与1mMNa2S2O3的反应速率(图19)。反应遵循一级动力学，速率常数在6℃下为0.00614min-1并且在25℃下为0.0379min-1。在这种反应速率下，化合物VI于10mM Na2S2O3中以及25℃下的半衰期将为1.83分钟，2小时后将使残余的化合物VI浓度为5.5x10-19M。反应产物的LCMS分析确认了这种产物是硫代硫酸酯(通过使化合物VI与两个Na2S2O3分子反应而形成的化合物XXIII)。
Figure BDA0002994828660000541
实施例17
用硫代水杨酸甲酯中和化合物X
向178μL磷酸盐缓冲盐水中添加2μL 10mM化合物X于甲醇中的溶液和20μL 100mM硫代水杨酸甲酯于甲醇中的溶液，这得到100μM灭活剂和10mM水杨酸甲酯的最终浓度。如本文中图示说明，通过液相色谱法-质谱法分析这种溶液中化合物X的浓度变化以及化合物X与硫代水杨酸甲酯之间的共价加合物(化合物XXIV和XXV)的形成。
Figure BDA0002994828660000542
图20A中绘制的结果显示，化合物X的浓度因中间化合物XXIV的形成而降低，中间化合物XXIV进一步转化成化合物XXV。可以通过将化合物X浓度的对数(由它的峰面积确定)对孵育时间绘图来确定化合物VI的中和速率。图20B中所示的这个图揭示了线性依赖，指示一级速率常数K＝-0.0416min-1的一级反应动力学，对应于T1/2＝16.6min的化合物X半衰期。
实施例18
用苯硫酚中和结构I的化合物
向178μL磷酸盐缓冲盐水中添加2μL 10mM化合物X于甲醇中的溶液和20μL 100mM苯硫酚于甲醇中的溶液，这得到100μM灭活剂和10mM苯硫酚的最终浓度。如本文中图示说明，通过液相色谱法-质谱法分析这种溶液中化合物X的浓度变化以及化合物X与苯硫酚之间的共价加合物(化合物XXVI和化合物XXVII)的形成。
Figure BDA0002994828660000551
图21中示出了在不同时间点化合物X与苯硫酚的LCMS分析的结果。图21的左图中示出了LCMS分析的总离子流质量色谱图，其中峰对应于化合物X、XXVI和XXVII。右图中示出了相应峰的质谱。分析揭示在1分钟40秒(100秒)后，化合物X在很大程度上被中和：化合物X、XXVI和XXVII的峰面积的比率分别是21:52:27。10分钟后那些峰的比率是3:29:68，并且20分钟后是0.5:16:83.5，指示化合物X快速转化成单共价加合物和二共价加合物XXVI和XXVII。
实施例19
具有硫代磺酸酯官能团的固相剂XXVIII的制备和其用于中和化合物VI的用途
在氩气下将磺酰氯官能化的二乙烯基苯交联聚苯乙烯树脂(Sigma-Aldrich目录号498211-5g)与5ml 2M硫化氢钠溶液(通过用硫化氢使九水硫化钠水溶液饱和来制备)混合。对混合物超声处理约3分钟，然后在55℃下搅拌4小时。此后，过滤树脂并且用脱气水洗涤三次，用脱气甲醇洗涤三次，并且用脱气乙醚洗涤两次。在氩气流下干燥树脂，然后在真空下干燥。获得1.039g干燥树脂(化合物XXVIII)，硫代磺酸酯官能化的聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。将化合物XXVIII的等分试样添加至100μM化合物VI于PBS中的溶液中。LCMS分析证实了混合物中化合物VI的浓度的时间依赖性降低。
Figure BDA0002994828660000561
本文中示出了制备固相剂XXVIII的反应流程以及用固相剂XXVIII中和并共价螯合化合物VI的反应与化合物XXIX(例如，化合物VI与固相剂的共价加合物XXIX)的形成。
实施例20
基于巯基苯基官能化的甲基丙烯酸酯树脂的固相剂XXX的制备和其用于中和并共价螯合化合物VI的用途
用2ml二甲亚砜溶解400mg 4-巯基苯基乙酸(Sigma-Aldrich目录号653152-5G)，并且在室温下使溶液静置过夜。在10托真空下去除所形成的二甲基硫醚，并且在45℃下在0.05托真空下去除过量的二甲亚砜过夜。这得到定量产率的呈蜡状微黄色固体状的4-巯基苯基乙酸二硫化物。
在35℃下于真空下通过从2ml无水N,N-二甲基甲酰胺中三次蒸发来干燥300mg氨乙基官能化的甲基丙烯酸酯树脂(Purolite Ltd,Llantrisant,Wales,UK，产品号D6195，商品名Chromalite MAM2，每ml湿树脂0.5mmol氨基，68％水分)。将干燥树脂悬浮于1ml无水N,N-二甲基甲酰胺中，并且向此悬浮液中添加370mg 4-巯基苯基乙酸二硫化物于1ml无水四氢呋喃中的溶液。在搅拌下向此悬浮液中添加172mg苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐，随后逐滴添加172μL N,N-二异丙基乙胺，并且在氩气下密封反应混合物。24小时后，在搅拌下添加330mg二硫苏糖醇于1ml去离子和脱气水中的溶液，并且在10分钟后通过真空过滤回收树脂，并且用脱气乙腈、四氢呋喃、甲醇、0.2mM二乙烯三胺五乙酸(DPTA)反复洗涤，并且用氩气吹洗，获得314mg湿的巯基苯基官能化的甲基丙烯酸酯树脂。使用艾尔曼氏程序(Elman's procedure)(Riener,C.K.；Kada,G.；Gruber,H.J.,Anal.Bioanal.Chem.,2002,373,266-76)确定产物化合物XXX上的巯基负荷，并且是每克湿树脂为0.21mmol。水分含量是71％。将化合物XXX的等分试样添加至100μM化合物VI于PBS中的溶液中。这种混合物的LCMS分析证实了混合物中化合物VI的时间依赖性减少。
Figure BDA0002994828660000581
上述反应流程说明了固相剂XXX的合成和其与化合物VI的反应，以及化合物XXXI(例如，化合物VI与固相剂XXX的共价加合物XXXI)的形成。
实施例21
苯硫酚基官能化的聚乙二醇接枝聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂XXXII的制备和其用于中和化合物VI的用途
将900mg 4-巯基苯基乙酸添加至1.60g三苯基甲基氯于50ml无水二氯甲烷中的溶液中。在室温下于氩气下搅拌混合物3小时。添加30ml水，并且搅拌混合物5分钟。分离二氯甲烷层，经硫酸钠干燥并且在真空下蒸发，得到2.3g呈白色固体状的粗产物。通过硅胶色谱法以氯仿至氯仿/甲醇10:1的梯度纯化这种物质，得到1.62g(74％)2-(4-(三苯基甲硫基)苯基)乙酸。
将200mg Tentagel S NH2树脂(Rapp Polymere GmbH,Tuebingen,Germany，产品号S30132，用氨基封端聚乙二醇接枝的二乙烯基苯交联聚苯乙烯树脂)于5ml无水N,N-二甲基甲酰胺中膨胀几小时，然后吸出过量溶剂。将151mg苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、119mg 2-(4-(三苯基甲硫基)苯基)乙酸和44mg无水1-羟基苯并三唑溶解于1.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺中。在搅拌下添加75mg(101μL)二异丙基乙胺，并且在1分钟后将所得溶液添加至膨胀树脂中。在室温下振荡2小时后，过滤树脂并且用3x2mL N,N-二甲基甲酰胺和3x2mL二氯甲烷洗涤，然后在氩气流下干燥。将树脂悬浮于2mL 2.5％三异丙基硅烷和2.5％水于四氢呋喃中的溶液中。2分钟后，在氩气下过滤树脂并且重复进行去块。然后在氩气下过滤树脂，用3ml脱气乙腈洗涤三次并且在氩气流下干燥，获得203mg带有巯基苯基的TentaGel S树脂(例如，化合物XXXII)。使用艾尔曼氏程序确定巯基负荷并且是每克干燥树脂0.12mmol。将化合物XXXII的等分试样添加至100μM化合物VI于PBS中的溶液中。LCMS分析证实了混合物中化合物VI的时间依赖性减少。
Figure BDA0002994828660000591
上述反应流程说明了固相剂XXXII的合成和其与化合物VI的反应，以及加合物化合物XXXIII(例如，化合物VI与固相剂XXXII的共价加合物XXXIII)的形成。
实施例22
通过形成离子对来结合一种或多种结构I的化合物和所述化合物的中和或分解产物的固相剂的制备和用途
将500g呈H+形式的磺酸基官能化的Purolite NRW160聚苯乙烯二乙烯基苯交联树脂通过以下步骤转变成Na+形式：在真空过滤器上并且在无菌罩下用3体积的饱和NaCl溶液洗涤珠粒，随后用2体积的1M NaOH洗涤。NaOH灭菌之后，用无菌去离子水洗涤珠粒直至冲洗液的pH值变成中性为止。将珠粒与2体积的甲醇一起孵育15分钟，并且在去除甲醇之后用3体积的无菌去离子水再次冲洗。在甲醇(2体积)中最后孵育之后，通过过滤去除醇并且在真空下干燥珠粒。
将50mg干燥珠粒添加至1mL 100μM化合物X于磷酸盐缓冲盐水中的溶液中。这种混合物的LCMS分析显示，上清液中化合物X的浓度降至低于30nM。
实施例23
制备固相剂筒
用固相剂装载配备有底部聚丙烯过滤器的空聚丙烯筒5x50mm、20x120mm、20x200mm(直径x长度，mm，目录号PF-DLE-F0004、PF-DLE-F0025和PF-DLE-F0040，Interchim,Montlucon Cedex,France)。在干燥固相剂的情况下，填充筒的2/3容量以便珠粒湿润后膨胀。筒的顶部配备有另一个聚丙烯过滤器圆盘，并且将筒密封并储存于室温下(干燥固相剂)或冷冻(湿固相剂)。如图2、图3、图5-8中所说明，可以将筒集成至处理封闭系统中。
实施例24
保留用化合物VI处理的动物血清支持细胞培养的特性
在40±1℃下于50mL无菌锥形管中将热灭活的胎牛血清(FBS，目录号89510-188，VWR)和热灭活的马血清(HS，目录号H1138，Sigma)与100μM化合物VI一起孵育60分钟。在40±1℃下将处理对照血清仅与化合物VI稀释剂一起孵育60分钟。孵育后，使用如实施例22和23中所描述来制备的填充有固相剂的筒从所处理的血清中去除化合物VI。筒过滤之后，使用0.2μ注射器过滤器对血清进行过滤灭菌。对照血清未在40℃下孵育或暴露于固相剂，但进行过滤灭菌。
这些血清用于以5％、10％和20％的三种不同浓度补充细胞生长介质。评价了这些介质支持牛陀螺状细胞(BTT，成纤维细胞形态)、猪睾丸细胞(PT，上皮)和两种人类细胞系A172(成胶质细胞瘤，星形胶质细胞样细胞)和MCF7(上皮乳癌细胞)生长的能力。
细胞生长曲线：对处于汇合早期的BTT、PT、A172和MCF7细胞进行胰蛋白酶处理并且于补充有如上文所描述的处理血清或对照血清的DMEM中涂板至48孔板中。每天更换介质。每24小时使用锥虫蓝排除法用标准血细胞计数器对活细胞进行计数。结果以每孔的细胞平均数表示。每次稀释使用至少三个孔。
克隆生长：对处于汇合早期的BTT、PT、A172和MCF7细胞进行胰蛋白酶处理，连续稀释(1:2)并且分六个重复试样于补充有如上文所描述的处理血清或对照血清的DMEM中涂板至96孔板中。每两天更换介质，持续16天。通过目视检查每个孔来确定克隆生长的存在。呈现了最后四次稀释的结果，其中对于每次稀释以来自总共六个重复试样的生长的孔数来观测细胞生长。
长期培养：以3-4天时间间隔，以上文所描述的方式将BTT、PT、A172和MCF7细胞系于补充有对照或经过处理的FBS或HS(仅BTT细胞)的介质中繁殖10代。使用相差显微术每天监测细胞和单层形态。
细胞生长结果：图22中呈现了典型生长曲线。所有生长曲线都展现出类似的模式：对于所有细胞系并且在所有介质中初始观测到经典的迟滞期，逐渐跟随着对数生长期。正如预期，对于在含20％血清的介质中培养的所有细胞系都发现最高生长速率。在10％血清补充介质中的生长具有中间值，而在含5％血清的介质中的细胞增殖大大减少。对于所有细胞系并且对于所有血清浓度都发现在对照、模拟处理或化合物VI处理的血清存在下生长的细胞之间的生长速率没有统计上显著的差异。
图22示出了模拟处理和化合物VI处理的血清对经过6-7天时段测量的在48孔板中的四种不同细胞系的生长的影响。A，猪PT细胞；B，人类A172细胞；C，人类MCF-7细胞；D，在含FBS的介质中生长的牛BTT细胞；E，在含HS的介质中生长的牛BTT细胞。T0柱指示在涂板时的细胞数；三个柱的阵列中的第一个柱(第1天至第7天)-含有补充有对照，即未处理的血清的介质的孔中的细胞数；三个柱的阵列中的第二个柱(第1天至第7天)-含有补充有模拟处理的血清的介质的孔中的细胞数；三个柱的阵列中的第三个柱(第1天至第7天)-含有补充有化合物VI处理的血清的介质的孔中的细胞数。每个时间点代表三个孔的平均值。误差条指示SD。
克隆生长结果：支持在极低接种密度下细胞生长(克隆生长)的能力是血清的另一个重要特征。表9示出了四个最后稀释液中连续稀释的细胞生长的存在。这些结果指示所有四种细胞系的克隆生长不受血清处理所影响。
表9.补充有对照和化合物VI处理的FBS的介质中细胞的克隆生长。示出了最后四个稀释液中生长的存在。
Figure BDA0002994828660000621
Figure BDA0002994828660000631
长期培养结果：对于连续的10代，在维持于含化合物VI处理的血清的介质中的细胞与对照介质中的细胞之间的中间或汇合单层的细胞生长/外观或形态中未观测到视觉差异。
实施例25
化合物VI处理的胎牛血清能够保留它支持病毒发育和感染性的能力的测试
将连续稀释的猪细小病毒(PPV，ATCC编号VR-742)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV，ATCC编号VR-534)储备液分别添加至猪睾丸细胞(PT，PT；ATCC编号CRL-1746)和牛陀螺状细胞(BTT，ATCC编号CRL-1390)中，并且在吸附之后，添加如实施例24中所描述来制备的补充有对照或化合物VI处理的FBS的介质。在不含血清的DMEM中连续稀释(1:5或1:10)来自外加有病毒的所有样品(处理、模拟处理或未处理的血清)的等分试样，并且将来自每个稀释液的25μL一式三份涂板至96孔板中的它们各自的指示细胞上。在37℃下于5％CO2孵育箱中将板孵育60分钟以允许病毒吸附。为了增加检测限，未稀释的样品另外用于感染24孔板中或10cm皮氏培养皿中的宿主细胞。吸附之后，在未抽吸25μL稀释液的情况下将所有孔用DMEM/5％FBS填充，并且在37℃下于CO2孵育箱中将板进一步孵育6-7天。通过目视检查来检测每个孔中病毒致细胞病变效应的发展，并且用于计算各自的病毒效价，以Log10TCID50/mL表示。检测限是0.2个感染粒子/mL。在一些情况下，为了确认测定的结果，6-7天后收集来自接种的孔的上清液并且用于感染24孔板中的新鲜细胞。
表10中所示的病毒滴定的结果指示，补充有未处理的FBS的对照介质和补充有化合物VI处理的血清的介质在所测试的细胞中具有基本上相同的病毒感染支持特性。
表10.补充有5％对照(未处理)的FBS对比DMEM/5％化合物VI处理的FBS的DMEM中确定的病毒效价的比较。
Figure BDA0002994828660000641
实施例26
结构I的化合物处理的全血和红血细胞(RBC)的品质
在室温下将全血或红血细胞浓缩液(RBCC，25mL)的10mL样品用500μM化合物VI处理6小时。在室温下将残余的化合物VI用相同体积的10mM硫代硫酸钠中和2小时。对于对照，用不含化合物VI的盐水和硫代硫酸钠或用仅不含化合物VI的盐水和/或硫代硫酸盐处理全血或RBCC的相同样品。根据制造商推荐，使用IDEXX Procyte Dx血液分析仪和IDEXXCatalyst Dx化学分析仪对来自每个样品的全血和RBCC的等分试样进行全血计数和生物化学分析。在处理之后立即分析样品并且在一周后再分析全血，并且在4-6℃下储存5周期间每周分析RBCC。测量以下参数：RBC数目、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、红细胞分布、网织红细胞计数、血小板、平均血小板体积、白血细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、氯化物、钾、钠、葡萄糖和乳酸盐浓度。在每周测试之后，所有测量的参数(RBC数目、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、红细胞分布、网织红细胞计数、血小板、平均血小板体积、白血细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、氯化物、钾、钠、葡萄糖和乳酸盐浓度)中未发现在分析仪的准确度和精密度内，在所处理样品与对照之间的细胞或生物化学特征的差异。
本发明的方面
本发明提供了以下非限制性方面：
方面1.一种用于灭活或减少样品中的病原体或非所需生物体的方法，所述方法包括：
(i)用具有结构I的化合物或所述化合物的化学上可接受的盐、水合物或溶剂化物处理所述样品：
Figure BDA0002994828660000651
其中：
每个R1在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基，
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烷基、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的环烷基或经取代的苯基，或结构II的部分：
Figure BDA0002994828660000661
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基；
每个n在每次出现时独立地为3、4或5；
每个m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
(ii)孵育足以灭活或减少所述样品中的病原体或非所需生物体的时间；
(iii)用消除或减少所述具有结构I的化合物的毒性或其它不合需要的特性的一种或多种中和剂来处理所述样品。
方面2.根据方面1的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IA：
Figure BDA0002994828660000662
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基、苯基，或结构IIA的部分：
Figure BDA0002994828660000671
每个R3在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
每个b在每次出现时独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
方面3.根据方面1的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IB：
Figure BDA0002994828660000672
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
b选自0、1、2、3、4、5或6。
方面4.根据方面1至3中任一项的方法，其中所述一种或多种中和剂是亲核化合物，所述亲核化合物通过与所述结构I、IA或IB的化合物的氮丙啶环反应并打开所述氮丙啶环来消除所述结构I、IA或IB的化合物的烷基化特性。
方面5.方面4的方法，其中所述一种或多种中和剂是硫代硫酸盐，优选硫代硫酸钠；硫代磷酸盐，优选硫代磷酸钠；硫脲或经取代的硫脲；硫代羧酸和其盐；二硫代羧酸和其盐；硫代碳酸盐；二硫代碳酸盐；硫代碳酸O-酯的盐；二硫代碳酸O-酯的盐；巯或硫醇或其盐；或经取代的巯或经取代的硫醇；或聚巯或聚硫醇和其盐；或它们的任何组合；或可溶于水性介质中的有机聚合物，所述有机聚合物含有与其共价连接的巯基或硫醇基、硫代硫酸根基、硫代磷酸根基、硫脲、硫代羧酸、二硫代羧酸、硫代碳酸根基O-酯、二硫代碳酸根基O-酯或它们的组合。
方面6.方面5的方法，其中所述一种或多种中和剂是硫代硫酸钠、2-巯基乙醇、2-(甲氨基)乙硫醇、2-氨基乙硫醇、2-(二甲氨基)乙硫醇、2-巯基-N,N,N-三甲基乙铵和其盐、硫代羧酸和其盐、硫代乙酸和其盐、硫代丙酸和其盐、硫代草酸和其盐、硫代丙二酸和其盐、硫代琥珀酸和其盐、硫代乙醇酸和其盐、硫代乳酸和其盐、二硫代羧酸和其盐、二硫代乙酸和其盐、2-巯基乙酸和其盐、2-巯基丙酸和其盐、2-巯基乙酸乙酯、2-巯基琥珀酸和其盐和酯、2-(甲基磺酰基)甲硫醇、(乙基磺酰基)甲硫醇、磺酰基二甲硫醇、2,2,2-三氟乙硫醇、1H-咪唑-5-硫醇、咪唑烷-2-硫酮、1,3-二甲基咪唑烷-2-硫酮、吡啶-2-硫醇、4-硫酮基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮、2-硫酮基二氢嘧啶-4,6(1H,5H)-二酮、2-巯基苯甲酸和其盐、4-巯基苯甲酸和其盐、苯硫酚、2-巯基苯甲醚、3-巯基苯甲醚或4-巯基苯甲醚、2-巯基丙-1,2-二醇、2,3-二巯基丙醇或1,3-二巯基-2-丙醇，和它们的组合。
方面7.方面5的方法，其中所述中和剂的所述巯或硫醇的-SH基团离解的pKa介于4与10之间，优选地介于5与9之间，并且甚至更优选地介于6与8之间，或接近于所处理的介质的pH值。
方面8.方面5的方法，其中所述中和剂的所述巯或所述硫醇具有直接连接至双键或芳族结构或者完全或部分sp2杂化碳原子的-SH基团。
方面9.方面5的方法，其中所述中和剂包含至少一个受电子基团，例如砜基(-S(O2)-R)或亚砜基(-S(O)-R)，或酯基(-C(O)OR)或酰胺基(-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NR2)，其中R是任何烷基或经取代的烷基，所述受电子基团连接至SH基团所连接的碳原子。
方面10.根据方面1至9中任一项的方法，其中所述中和剂任选地通过连接基团共价键结至固体载体。
方面11.根据方面1至10中任一项的方法，其中持续1分钟至48小时、优选20分钟至24小时并且甚至更优选60分钟至8小时的时段，并且在0至100℃、优选10至60℃并且甚至更优选20至40℃的温度下以及在1至14、优选4至9并且甚至更优选6至8的pH值下，并且以至多1M、优选至多0.1M的浓度并且甚至更优选至多10mM的浓度，所述一种或多种中和剂与含有残余量的所述结构I的化合物的所述样品接触。
方面12.根据方面1至11中任一项的方法，其中在用所述中和剂处理之后残余的具有结构I的化合物的浓度降低至少2对数，优选至少3对数，并且更优选至少4对数，再优选至少5对数，再优选至少6对数，再优选至少7对数，再优选至少8对数，再优选至少9对数，再优选至少10对数。
方面13.根据方面1至12中任一项的方法，其中在残余的结构I的化合物与所述中和剂接触之后，通过用不可溶于所处理的介质中的固相剂处理来从所处理的样品中部分或完全去除所述结构I的化合物的中和或降解产物和/或过量的所述中和剂，并且所述固相剂可以是多孔的、微孔的、大孔的或凝胶型，或可以是无孔的高分散度和高表面积固体，并且可以成形为1μm至1cm的不同尺寸的珠粒或粒子，并且所述固相剂与所述一种或多种结构I的化合物和的所述中和或降解产物和/或所述中和剂发生化学反应并且共价结合或吸收或以其它方式螯合所述中和或降解产物和/或所述中和剂，随后去除所述固相剂，优选地通过过滤或沉降或离心，或者，通过将所述介质或组合物穿过含有所述固相剂的筒过滤，或通过使所述介质或组合物与所述固相剂穿过渗透膜或半渗透膜接触来完成所述处理，并且所述处理可以进行一次、两次或多次，或直至达成具有结构I的化合物的中和或降解化合物的所需减少为止，并且可以用单一固相剂或用两种或更多种不同固相剂相继地或于混合物中完成所述处理。
方面14.方面13的方法，其中所述固相剂吸收所述结构I的化合物的所述中和或降解产物和/或过量的所述中和剂。
方面15.方面14的方法，其中所述固相剂是活性碳；或反相树脂；或多孔或微孔的疏水性有机聚合物，例如聚苯乙烯树脂，或二乙烯基苯交联聚苯乙烯树脂，或用疏水性有机基团，例如C4-C18烷基改性的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯树脂。
方面16.方面15的方法，其中所述固相剂是阳离子交换剂或阴离子交换剂，并且当所述中和剂在处理的pH值下是阴离子或阳离子时，所述固相剂与所述结构I的化合物的所述中和或分解产物和/或过量的所述中和剂形成离子对。
方面17.方面16的方法，其中所述阳离子交换剂是有机聚合物，优选地经过交联或带有阴离子基团，例如磺基或磺酸基或羧酸基，所述阴离子基团与阳离子，例如钠、钾或铵或经取代的铵阳离子或与氢阳离子呈离子配对形式。
方面18.方面16的方法，其中所述阴离子交换剂是有机聚合物，优选地经过交联或带有阳离子基团，例如质子化氨基，或烷基取代的氨基，例如单甲基胺、二甲基胺或三甲基胺基团，或季铵基，例如四甲基铵基，所述基团与阴离子，例如氯离子、硫酸根、柠檬酸根或羟基阴离子呈离子配对形式。
方面19.方面13的方法，其中所述固相剂是聚合物，优选地经过交联，所述聚合物具有与其连接的的硫代硫酸盐基团，所述硫代硫酸盐基团与可接受的阳离子(例如钠)进行离子配对并且具有式P-R-S-SO3 -Na+，其中P是聚合物，R是共价键或任何二价连接子，并且所述基团通过交换反应与过量的式R1SH或R1S-Cat+的巯基或硫醇型中和剂反应，其中Cat+是可接受的阳离子(例如钠)，使得灭活剂按下式P-R-S-S-R1通过二硫键共价结合至所述聚合物并且释放硫代硫酸根阴离子S2O3 2-；或所述聚合物具有直接或通过连接子与其连接的环氧基或经取代的环氧基，并且所述环氧基与过量的式R1SH或R1S-Cat+的巯基或硫醇型中和剂反应，其中Cat+是可接受的阳离子(例如钠)，从而打开所述环氧基并且使所述中和剂共价连接至所述聚合物。
方面20.根据方面1至19中任一项的方法，其中所述样品是组合物、设施、表面、装置或生物体。
方面21.根据方面1至19中任一项的方法，其中所述样品是血液或血液产品、体液、源于真核生物或原核生物的介质、疫苗制剂组合物、生物剂或生物制剂、临床样品、活检体、研究样品、化妆品、药物组合物、一次性用品、仪器、水生流体管道、导管、软管、热交换器或水上船舶，和它们的表面。
方面22.根据方面1至19中任一项的方法，其中所述样品是血液或血液产品。
方面23.一种用于灭活、减少或去除样品中的病原体或非所需生物体的方法，所述方法包括：
用具有结构I的化合物或所述化合物的化学上可接受的盐、水合物或溶剂化物处理所述样品：
Figure BDA0002994828660000721
其中：
R1在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基，
R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烷基、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基或苯基，或结构II的部分：
Figure BDA0002994828660000722
其中；
n在每次出现时独立地为3、4或5；
m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
随后孵育足以允许一种或多种具有结构I的化合物对所述病原体或非所需生物体的所需作用发生的时间；
(ii)用不可溶于所处理的介质中的固相剂处理所述样品，并且所述固相剂可以是多孔的、微孔的、大孔的或凝胶型，或可以是无孔的高分散度和高表面积固体，并且可以成形为不同尺寸，例如1μm至1cm的珠粒或粒子，并且所述固相剂与残余的结构I的化合物或其一种或多种降解产物发生化学反应并且共价结合或吸收或以其它方式螯合残余的结构I的化合物或其一种或多种降解产物；
(iii)去除所述固相剂，优选地通过过滤、沉降或离心；或者，通过将所述样品穿过含有所述固相剂的筒过滤，或通过使所述样品与所述固相剂穿过渗透膜或半渗透膜接触来完成所述处理；并且所述处理可以进行一次或两次或多次，或直至达成所述具有结构I的化合物或其降解产物的所需减少为止，并且可以用单一固相剂或用两种或更多种不同固相剂相继地或于混合物中完成所述处理。
方面24.根据方面23的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IA：
Figure BDA0002994828660000731
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基、苯基，或结构IIA的部分：
Figure BDA0002994828660000732
每个R3在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
每个b在每次出现时独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
方面25.根据方面23的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IB：
Figure BDA0002994828660000741
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
b选自0、1、2、3、4、5或6。
方面26.根据方面23至25中任一项的方法，其中所述固相剂含有反应基团，所述反应基团与所述结构I的化合物发生化学反应并且共价结合所述结构I的化合物。
方面27.方面26的方法，其中可以与所述结构I的化合物的氮丙啶环反应并打开所述氮丙啶环的所述反应基团是亲核基团，例如硫代硫酸根基-OS(O)(O-)S-、或硫代磺酸根基-S(O)(O-)S-、或巯基或硫醇基-SH、-CH2SH、-CH2CH2SH、-CF2CH2SH、-OCH2CH2SH、-NH2CH2CH2SH、-NH(Me)CH2CH2SH、-N(Me2)CH2CH2SH、-COCH2SH、-S(O2)CH2SH、-硫脲-NHC(S)NH2或经取代的硫脲基、硫代羧酸-C(O)S-、二硫代羧酸-C(S)S-、硫代碳酸根基O-酯-OC(O)S-、二硫代碳酸根基O-酯、或黄原酸根基-OC(S)S-、硫代膦酸根基-PO(OH)SH和硫代磷酸根基-OPO(OH)SH、邻苯硫基、间苯硫基或对苯硫基-C6H4SH、硫代水杨酸根基团、间硫代苯甲酸根基团或对硫代苯甲酸根基团-O2CC6H4SH，或它们的盐形式。
方面28.根据方面27的方法，其中所述巯基或硫醇或-SH基团直接连接至双键或芳族结构或者完全或部分sp2杂化碳原子。
方面29.根据方面27或28的方法，其中所述-SH基团离解成-S-和H+的pKa小于10，优选小于9，并且最优选小于8。
方面30.根据方面23至29中任一项的方法，其中所述固相剂是多孔的、微孔的或凝胶型的有机聚合物。
方面31.方面30的方法，其中所述有机聚合物是亲水性有机聚合物，或者是可湿润的或可以在基于水的介质中扩张或膨胀的聚合物。
方面32.方面30或31的方法，其中所述有机聚合物，优选地经过交联，是聚苯乙烯聚合物；或聚丙烯酸酯聚合物；或聚甲基丙烯酸酯聚合物；或基于聚氨酯的聚合物；或基于聚酰胺的聚合物；或基于葡聚糖的聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000751
或基于琼脂糖的聚合物，例如但不限于
Figure BDA0002994828660000752
或基于纤维素的聚合物；或基于改性纤维素的聚合物，例如但不限于羧甲基纤维素或二乙氨基乙基纤维素或甲基纤维素；或其它基于多糖的聚合物；或具有等规或无规构型或具有其它立构规整度的任何其它线性、支化或交联均聚物或杂聚物或嵌段共聚物；或可能是不可溶于所处理的介质中的任何其它适当的大分子。
方面33.根据方面27至32中任一项的方法，其中所述亲核基团可以是不同类型中的一种并且可以直接连接至所述聚合物的主链，或可以通过以下连接：二价基团，例如但不限于氧原子、硫原子、-NH-基团、亚甲基、经单取代或二取代的亚甲基、亚乙基或经取代的亚乙基、亚丙基或经取代的亚丙基、氧亚甲基或氧亚乙基；或者二价、三价或多价连接子，例如但不限于低聚氧乙烯或聚氧乙烯、低聚酯或聚酯或聚酰胺型连接子，所述连接子可能是直链或支化或树枝状的并且可能含有与其连接的一个或多于一个或许多个亲核基团。
方面34.根据方面30至33中任一项的方法，其中所述聚合物不仅含有亲核基团，而且含有在不与所述结构I的化合物反应的情况下帮助它与所述亲核基团反应的基团，这是通过但不限于经由所谓的邻近效应或邻近电子对效应增强所述亲核基团的亲核性；或通过增强所述亲核基团的去质子化；或通过与所述亲核基团进行H键结；或通过与所述结构I的化合物和所述亲核基团相互作用并降低所述结构I的化合物与所述亲核基团之间形成的过渡态的能量；或通过与所述结构I的化合物非共价结合或离子配对，由此增加所述结构I的化合物的局部浓度；或通过使一种或多种结构I的化合物的氮丙啶的氮质子化，由此增加所述结构I的化合物的反应性。
方面35.根据方面30至34中任一项的方法，其中所述有机聚合物连接有足够数目的亲水基团以增加聚合物亲水性或可湿润性或者改善聚合物特性，例如但不限于对所述样品、或所述组合物、或生物体、或生物流体的组分的惰性。
方面36.方面35的方法，其中所述有机聚合物是二乙烯基苯交联聚苯乙烯，并且所述极性基团是乙二醇低聚物，或分子质量为150至100,000Da、优选2,000至40,000Da并且甚至更优选4,000至20,000Da并且密度为每个单体单元至多一个基团的聚乙二醇，或磺基(磺酸基，-SO3 -)，或所述聚合物是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物并且所述极性基团是多元醇，例如但不限于2-羟乙基、2,3-二羟丙基、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、五乙二醇或低聚乙二醇或聚乙二醇，并且所述极性基团以足以达成所需亲水性或其它有利特性的密度连接至C1，或所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物的羰基，所述特性可以是但不限于免疫原性缺乏，或致血栓性缺乏，或对蛋白质或受体或者所处理的样品或组合物或体液的其它组分的结合或亲和力缺乏。
方面37.根据方面23至36中任一项的方法，其中所述固相剂与残余的结构I的化合物的带正电荷的氮原子形成多个离子对。
方面38.方面37的方法，其中所述固相剂是有机聚合物、微孔的或大孔的或凝胶型有机聚合物，优选地经过交联并带有阴离子基团，例如磺基或磺酸基或羧酸基，所述阴离子基团与阳离子，例如钠、钾或铵或经取代的铵阳离子或者氢阳离子呈离子配对形式。
方面39.方面38的方法，其中所述聚合物是二乙烯基交联聚苯乙烯聚合物，所述聚合物含有呈钠形式并且密度为每克聚合物至多1.5毫当量的磺酸基。
方面40.方面38的方法，其中所述聚合物是二丙烯酸酯交联聚丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯并且所述阴离子基团是呈钠形式并且密度为每克聚合物至多4毫当量的磺酸基或羧酸基。
方面41.根据方面1至40中任一项的方法，其中所述病原体或非所需生物体是：引起感染性疾病的生物体，例如但不限于病毒，包括包膜病毒和无包膜病毒、DNA或RNA病毒和噬菌体；朊病毒；原核生物；细菌，包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、产孢子细菌或细菌孢子、支原体、古生菌和细菌膜；真核生物、单细胞或多细胞真核生物，包括但不限于真菌、原生动物、单细胞或多细胞寄生虫、蠕虫、血吸虫或线虫或它们的卵、单细胞或多细胞藻类和甲壳类；或它们的任何组合，包括浸出物、生物膜或生物淤积系统。
方面42.根据方面1至41中任一项的方法，其中所处理的样品选自人类或动物血液、去白细胞的血液，和血液产品，包括血浆、红血细胞、血小板、血清或血浆组分、因子或酶、旨在用于输血的输血用血液和血液组分、单采血液组分、体液、动物血清(包括用作细胞培养物添加剂的血清)、源于真核生物或原核生物的介质、疫苗制剂组合物、化妆品和药物组合物；所述设施可以是任何工业或家用设备、器具、器械、机构、机器或材料，或者病原体、微生物或其它生物体的存在可能不合需要或需要加以控制的任何其它物品；所述表面可以是器皿、装置或设施，包括导管、通道、软管、管路、通风口、热交换器、污水管、沟道或任何其它流体或气体管道的表面，或与流体接触的任何主体表面，例如海上船舶、筛网或过滤器，其中病原体、微生物或其它生物体的存在是不合需要的或需要加以控制，包括生物淤积；所述生物体可以是动物、哺乳动物或人类或它们的部分，包括生物样品、制剂和活检体。
方面43.根据方面1至42中任一项的方法，其中用含有一种或多种结构I的化合物的组合物处理所述一种或多种病原体或微生物，并且其中可以将所述组合物配制成液体、溶液、凝胶、固体、粉末、粒子，或可以囊封、溶解、分散、磨碎、微粉化或转化成纳米粒子，或其它配制形式或它们的组合。
方面44.根据方面1至43中任一项的方法，其中持续1分钟至48小时、优选20分钟至24小时并且甚至更优选60分钟至8小时的时间段，并且在0至100℃、优选10至60℃并且甚至更优选20至40℃的温度下；以及在1至14、优选4至9并且甚至更优选6至8的pH值下；并且在10nM至10mM、优选1μM至1mM、再优选100μM至500μM的浓度下，用具有结构I的化合物处理所述样品或组合物。
方面45.根据方面1至44中任一项的方法，其中所处理的样品中存在的所述病原体或非所需生物体中的至少一者的效价降低至少50％，优选至少1对数，更优选至少2对数，再优选至少3对数，再优选至少4对数，再优选至少5对数，再优选至少6对数，再优选至少7对数，再优选至少8对数，再优选至少9对数，再优选至少10对数或更大。
方面46.根据方面1至45中任一项的方法，其中所述一种或多种病原体或微生物存在于生物体中，所述生物体可以是动物、哺乳动物或人类，并且通过静脉内、经口、局部、经直肠、皮下、肌肉内施用、通过吸入或通过它们的组合来体内完成用结构I的化合物或结构I的化合物的制剂的处理，并且可以通过单次施用、通过多次施用或通过连续施用并且以足以达成所需的病原体减少的一个或多个剂量来完成所述处理。
方面47.方面46的方法，其中通过离体处理所述生物体的体液来完成所述结构I的化合物的去除或中和或灭活以及任选地所述结构I的化合物的所述中和产物和/或过量的所述中和剂的去除，将所述体液返回或回输至所述生物体。
方面48.根据方面1至47中任一项的方法，其中所述一种或多种病原体或微生物存在于动物或人类中，并且通过处理所述动物或人类的体液，例如血液或血浆来离体完成用所述结构I的化合物的处理以及所述结构I的化合物和任选地所述化合物的中和或降解产物和/或过量的所述中和剂的去除或中和，所述体液可以通过单采术收集并且将处理后的流体返回或回输至所述动物或人类。
方面49.根据方面1和48中任一项的方法，其中所述病原体或非所需生物体中的至少一者对一种或多种抗病原体处理具有抗性，或可能对除了具有结构I的化合物的处理以外的任何处理都不敏感。
方面50.根据方面1至49中任一项的方法，其中所述具有结构I的化合物与有机或无机阴离子，优选低亲核性的阴离子呈盐形式，例如硫酸根、高氯酸根、甲磺酸根或四氟硼酸根，或者与具有良好水溶性并且熔点高于40℃且低于120℃的固体，例如但不限于具有不同分子量的聚乙二醇呈固溶体形式。

Claims (20)

1.一种用于灭活或减少样品中病原体或非所需生物体的方法，所述方法包括：
(i)用具有结构I的化合物或所述化合物的化学上可接受的盐、水合物或溶剂化物处理所述样品：
Figure FDA0002994828650000011
其中：
每个R1在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基，
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烷基、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的环烷基或经取代的苯基，或结构II的部分：
Figure FDA0002994828650000012
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、Cl、F、烷基、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或其它经取代的烷基；
每个n在每次出现时独立地为3、4或5；
每个m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
(ii)孵育足以灭活或减少所述样品中的病原体或非所需生物体的时间；
(iii)(a)用消除或减少所述具有结构I的化合物的毒性或其它不合需要的特性的一种或多种中和剂，或(b)用吸收或者共价结合或以其它方式螯合所述具有结构I的化合物的一种或多种固相剂来处理所述样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IA：
Figure FDA0002994828650000021
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、环烷基、烷氧基或经取代的烷基、烯基、环烷基、苯基，或结构IIA的部分：
Figure FDA0002994828650000022
每个R3在每次出现时独立地选自H、Cl、F、烷基、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、烯基、苯基、烷氧基、酰氧基或经取代的烷基；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
每个b在每次出现时独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述结构I的化合物具有结构IB：
Figure FDA0002994828650000031
其中：
每个R2在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个R3在每次出现时独立地选自H、CH3、CH2CH3或CH(CH3)2；
每个a在每次出现时独立地选自1、2或3；并且
b选自0、1、2、3、4、5或6。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种中和剂是亲核化合物，所述亲核化合物通过与所述结构I的化合物的氮丙啶环反应并打开所述氮丙啶环来消除所述结构I的化合物的烷基化特性。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种中和剂是硫代硫酸盐，优选硫代硫酸钠；硫代磷酸盐，优选硫代磷酸钠；硫脲或经取代的硫脲；硫代羧酸和其盐；二硫代羧酸和其盐；硫代碳酸盐；二硫代碳酸盐；硫代碳酸O-酯的盐；二硫代碳酸O-酯的盐；巯或硫醇或其盐；或经取代的巯或经取代的硫醇；或聚巯或聚硫醇和其盐；或它们的任何组合；或可溶于水性介质中的有机聚合物，所述有机聚合物含有与其共价连接的巯基或硫醇基、硫代硫酸根基、硫代磷酸根基、硫脲、硫代羧酸、二硫代羧酸、硫代碳酸根基O-酯、二硫代碳酸根基O-酯或它们的组合。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种中和剂是硫代硫酸钠、2-巯基乙醇、2-(甲氨基)乙硫醇、2-氨基乙硫醇、2-(二甲氨基)乙硫醇、2-巯基-N,N,N-三甲基乙铵和其盐、硫代羧酸和其盐、硫代乙酸和其盐、硫代丙酸和其盐、硫代草酸和其盐、硫代丙二酸和其盐、硫代琥珀酸和其盐、硫代乙醇酸和其盐、硫代乳酸和其盐、二硫代羧酸和其盐、二硫代乙酸和其盐、2-巯基乙酸和其盐、2-巯基丙酸和其盐、2-巯基乙酸乙酯、2-巯基琥珀酸和其盐和酯、2-(甲基磺酰基)甲硫醇、(乙基磺酰基)甲硫醇、磺酰基二甲硫醇、2,2,2-三氟乙硫醇、1H-咪唑-5-硫醇、咪唑烷-2-硫酮、1,3-二甲基咪唑烷-2-硫酮、吡啶-2-硫醇、4-硫酮基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮、2-硫酮基二氢嘧啶-4,6(1H,5H)-二酮、2-巯基苯甲酸和其盐、4-巯基苯甲酸和其盐、苯硫酚、2-巯基苯甲醚、3-巯基苯甲醚或4-巯基苯甲醚、2-巯基丙-1,2-二醇、2,3-二巯基丙醇或1,3-二巯基-2-丙醇，和它们的组合。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述中和剂共价结合至固相载体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述固相载体是多孔的、微孔的或凝胶型的有机聚合物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述有机聚合物是亲水性有机聚合物，或者是可湿润的或能够在基于水的介质中扩张或膨胀的聚合物。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述有机聚合物，优选地经过交联，是聚苯乙烯聚合物；或聚丙烯酸酯聚合物；或聚甲基丙烯酸酯聚合物；或基于聚氨酯的聚合物；或基于聚酰胺的聚合物；或基于葡聚糖的聚合物，例如但不限于
Figure FDA0002994828650000051
或基于琼脂糖的聚合物，例如但不限于
Figure FDA0002994828650000052
或基于纤维素的聚合物；或基于改性纤维素的聚合物，例如但不限于羧甲基纤维素或二乙氨基乙基纤维素或甲基纤维素；或其它基于多糖的聚合物；或具有等规或无规构型或具有其它立构规整度的任何其它线性、支化或交联均聚物或杂聚物或嵌段共聚物；或可能是不可溶于所处理的介质中的任何其它适当的大分子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述中和剂的亲核基团直接连接至所述聚合物的主链，或能够通过以下连接：二价基团，例如氧原子、硫原子、-NH-基团、亚甲基、经单取代或二取代的亚甲基、亚乙基或经取代的亚乙基、亚丙基或经取代的亚丙基、氧亚甲基或氧亚乙基；或者二价、三价或多价连接子，例如但不限于低聚氧乙烯或聚氧乙烯、低聚酯或聚酯或聚酰胺型连接子，所述连接子可能是直链或支化或树枝状的并且可能含有与其连接的一个或多于一个或许多个亲核基团。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在残余的结构I的化合物与所述中和剂接触之后，通过用不可溶于所处理的介质中的固相剂处理来从所处理的样品中减少或去除所述结构I的化合物的中和或降解产物和/或过量的所述中和剂，所述固相剂与所述结构I的化合物的所述中和或降解产物和/或所述中和剂发生化学反应并且共价结合或吸收或以其它方式螯合所述中和或降解产物和/或所述中和剂，随后从所述固相剂移走所处理的样品。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述固相剂吸收所述结构I的化合物的所述中和或降解产物和/或过量的所述中和剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述固相剂是活性碳；或反相树脂；或多孔或微孔的疏水性有机聚合物，例如聚苯乙烯树脂，或二乙烯基苯交联聚苯乙烯树脂，或用疏水性有机基团，例如C4-C18烷基改性的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯树脂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中持续1分钟至48小时、优选20分钟至24小时并且甚至更优选60分钟至8小时的时段，并且在0至100℃、优选10至60℃并且甚至更优选20至40℃的温度下以及在1至14、优选4至9并且甚至更优选6至8的pH值下，并且以至多1M、优选至多0.1M的浓度并且甚至更优选至多10mM的浓度，所述一种或多种中和剂与含有残余量的所述结构I的化合物的所述样品接触。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在用所述中和剂处理之后残余的具有结构I的化合物的浓度降低至少2对数，优选至少3对数，并且更优选至少4对数，再优选至少5对数，再优选至少6对数，再优选至少7对数，再优选至少8对数，再优选至少9对数，再优选至少10对数。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述病原体或非所需生物体是以下一者或多者：引起感染性疾病的生物体，例如病毒，包括包膜病毒和无包膜病毒、DNA或RNA病毒和噬菌体；朊病毒；原核生物；细菌，包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、产孢子细菌或细菌孢子、支原体、古生菌和细菌膜；真核生物、单细胞或多细胞真核生物，包括但不限于真菌、原生动物、单细胞或多细胞寄生虫、蠕虫、血吸虫或线虫或它们的卵、单细胞或多细胞藻类和甲壳类；或生物膜或生物淤积系统；或它们的任何组合。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是组合物、设施、表面、装置或生物体。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是血液或血液产品、体液、源于真核生物或原核生物的介质、疫苗制剂组合物、生物剂或生物制剂、临床样品、活检体、研究样品、化妆品、药物组合物、一次性用品、仪器、水生流体管道、导管、软管、热交换器或水上船舶，和它们的表面。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是血液或血液产品。
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