CN112986368A - 聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法 - Google Patents

聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，包括：将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液混合，采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测得到等电聚焦谱图；根据等电聚焦图谱分析检测样品电荷异质性。本发明检测方法利用全柱成像等电聚焦技术，在两性电解质溶液形成的连续pH梯度中利用电压对PEG‑EPO样品进行电泳，各电荷异构体电泳至与自身pI值相同的pH值位置从而实现互相分离，同时检测形成峰信号。此外，在电泳体系中加入IDA作为酸端占位剂，改善了分离度和峰形。本发明的检测方法具有良好的特异性和重复性；在50％‑150％浓度范围内、线性良好；最低定量浓度为0.11mg/ml，灵敏度高。

Description

聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法
技术领域
本发明涉及重组人促红素荷异质性的检测方法，尤其涉及聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，属于聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测领域。
背景技术
重组人促红素(EPO)是治疗肾性贫血的有效药物，随着中国肾衰透析成本降低，透析病人数量不断增加，未来EPO的需求将会逐渐增加。但是EPO半衰期短，药物频繁注射给病人带来较大的痛苦和安全风险。聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)是利用聚乙二醇修饰EPO后开发的一种长效促红素，主要用于肾功能不全病人的贫血治疗。聚乙二醇修饰的蛋白质药物在血液循环中的半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，它的半衰期由重组EPO的24小时延长至130小时，明显改善了药物在临床中的局限性。
EPO和PEG-EPO均是高度糖基化的重组细胞因子，电荷异质性作为糖基化蛋白类药物的关键属性，对蛋白类药物的溶解性、稳定性、免疫原性、体内外生物活性、药物动力学发挥着关键影响，因此选择一种特异性强，灵敏度高，分离效果好的检测方法是至关重要的。目前在现有的技术中，2015版《中国药典》采用等电聚焦电泳法分析其电荷异质性。
全柱成像等电聚焦技术是通过毛细管等电聚焦(cIEF)将带有不同电荷的异质体根据其等电点的不同进行聚焦分离，在高速摄像系统支持下拍摄成像，转变为峰信号，呈现电荷异构体图谱。聚焦过程中，在外加电场的作用下，PEG-EPO样品的电荷异质体能在两性电解质形成的连续pH梯度中电泳聚焦至与其等电点相同的pH位置，在280nm下检测得到异构体分布图谱。利用在样品中加入的两种已知等电点的标记物(pI marker)标定出待测样品各异构体的等电点，并可以通过软件积分各异构体，记录各异构体峰百分比含量。
PEG化的重组人促红素虽与EPO具有相似的电荷异质性，但由于PEG链的修饰，增加了其结构复杂性，利用传统的等电聚焦电泳技术检测其电荷异质性时分离效果差，结果可分析性不足。因此需要优化检测体系，解决采用等电聚焦电泳技术检测PEG-EPO的电荷异质性时存在的分离效果差，结果可分析性不足等缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，包括：(1)制备待检测的聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)样品；(2)配制预混液；(3)将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液混合，采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测得到等电聚焦谱图；(4)根据等电聚焦图谱中等电点标记物的迁移时间和pI值，确定待分析的蛋白样品各异构体的pI值；根据等电聚焦图谱的相关信息，确定待分析的蛋白样品各异构体的含量百分比。
本发明中的术语“电荷异质性”包括但不限于聚乙二醇化重组人促红素各异构体的pI值以及各异构体含量百分比。
步骤(1)中所述的制备PEG-EPO样品包括将PEG-EPO样品进行超滤脱盐处理后再调整PEG-EPO样品中的蛋白浓度，作为参考，可以将PEG-EPO样品中蛋白浓度调整为0.8-4.0mg/mL；本发明通过优化试验发现，PEG-EPO样品不同蛋白浓度对于异构体分离效果有较为显著的影响，通过试验发现将PEG-EPO样品脱盐后调整蛋白浓度为1.6mg/mL及2.0mg/mL的蛋白浓度作为工作浓度时，异构体分离效果较好且峰高适中，峰形较为理想；通过进一步的线性范围验证，结果表明工作浓度为1.6mg/mL时，在其80％-150％范围内的蛋白浓度(0.8-2.4mg/mL)均与峰面积有良好的线性，但工作浓度为2mg/mL时，无法满足80％-150％范围内的良好线性。因此，本发明确定，PEG-EPO样品的最佳的工作蛋白浓度为1.6mg/mL。
本发明中所述的预混液包括两性电解质、等电点标记物(pI Marker)、助溶剂、修饰及助分离剂、占位剂和超纯水；
各成分的含量优选为：两性电解质3-5v％、酸端等电点标记物0.5-1.0v％、碱端等电点标记物0.5-1.0v％、助溶剂12％-20％(3-5M)、修饰及助分离剂0.1-0.5v％、占位剂10-200mM，余量为超纯水。
进一步优选的，按照质量百分比计，各成分的含量优选为：两性电解质4v％、酸端等电点标记物0.8v％、碱端等电点标记物0.5v％、助溶剂16％(4M)、修饰及助分离剂0.35v％、占位剂10mM，余量为超纯水。
其中，所述的两性电解质可以是Pharmalyte 3-10、由Pharmalyte 2.5-5和Pharmalyte 3-10组成的两性电解质溶液或由Pharmalyte 2.5-5和Pharmalyte 5-8组成的两性电解质溶液中的任何一种；其中，将Pharmalyte2.5-5与Pharmalyte 5-8按照3:1混合作为两性电解质时，酸端与碱端pI Marker均可识别到且峰形及分离度较佳；因此，本发明优选采用由Pharmalyte 2.5-5和Pharmalyte 5-8按照体积比为3:1组成的电解质溶液作为本等电聚焦体系的两性电解质。
所述酸端pI Marker的pI值为3.38或3.59；碱端pI Marker的pI值为5.85。
所述助溶剂优选为尿素。
所述修饰及助分离剂优选为甲基纤维素。
所述占位剂优选为亚氨基二乙酸(IDA)；本发明分别试验了预混液体系不加IDA以及加IDA的情况，同时试验了IDA加量为10mmol、100mmol以及200mmol的情况。根据试验结果可见，不添加IDA的峰形较差，加入10mmol的IDA后峰形显著改善，分离度明显提高。同时，加入10mmol IDA时聚焦过程的电流最大值在15uA以下，而加入100mmol以及200mmol IDA时虽然同样可起到改善峰形，提高分离度的效果，但聚焦过程的电流最大值分别接近45及65uA，远超过仪器可持续耐受的20uA。因此，本发明确定预混液体系中加入10mmol IDA最为适宜。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液按照4:1的体积比例进行混合。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测的各项参数优选为：样品盘温度10或15℃；预聚焦(第一阶段)电压1500V，预聚焦时间1min；聚焦(第二阶段)电压3000V，聚焦时间12min；样品上样时间55s。分别试验了聚焦时间为9min、10min、12min以及14min的情况。结果显示，聚焦时间为9或者10min时，聚焦不够充分，当分别聚焦至12min和14min时，峰形已无明显改变，且分离效果较理想，表明聚焦完成。因此，本发明优选选择聚焦时间为12min。
本发明提供的聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法利用全柱成像等电聚焦技术，在两性电解质溶液形成的连续pH梯度中，利用电压对PEG-EPO样品进行电泳，各电荷异构体电泳至与自身pI值相同的pH值位置从而实现互相分离，同时检测形成峰信号。此外，本发明在电泳体系中加入IDA作为酸端占位剂，在提高分离度，改善峰形方面取得了良好效果。
特异性考察试验结果证明，本发明建立的检测方法特异性良好；重复性考察试验结果证明，本发明建立的检测方法重复性良好；线性范围考察试验结果证明，本发明建立检测方法在50％-150％浓度范围内，线性良好；定量限考察试验结果表明，本发明建立的检测方法样品的最低定量浓度为0.11mg/ml，灵敏度较高。
附图说明
图1利用Pharmalyte 3-10作为两性电解质时的谱图。
图2利用Pharmalyte 2.5-5：Pharmalyte 3-10＝1：1作为两性电解质时的谱图。
图3利用Pharmalyte 2.5-5：Pharmalyte 5-8＝1：1作为两性电解质时的谱图。
图4利用Pharmalyte 2.5-5：Pharmalyte 5-8＝3：1作为两性电解质时的谱图。
图5预混液体系中加入10mmol IDA后的谱图。
图6预混液体系中加入10mmol IDA后的聚焦过程电流(箭头指示)。
图7预混液体系中加入100mmol IDA后的聚焦过程电流(箭头指示)。
图8预混液体系中加入200mmol IDA后的聚焦过程电流(箭头指示)。
图9工作蛋白浓度为1.0mg/mL时的谱图。
图10工作蛋白浓度为1.6mg/mL时的谱图。
图11工作蛋白浓度为2.0mg/mL时的谱图。
图12工作蛋白浓度为4.0mg/mL时的谱图。
图13第二阶段聚焦时间为9min时的谱图。
图14第二阶段聚焦时间为10min时的谱图。
图15第二阶段聚焦时间为12min时的谱图。
图16第二阶段聚焦时间为14min时的谱图。
图17为对本发明方法特异性的考察结果。
图18为对本发明方法线性范围的考察结果。
图19为对本发明方法最低定量限的考察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法的建立
1.1实验仪器：全柱成像等电聚焦电泳系统、紫外分光光度计、离心机、电子天平、涡旋震荡仪。
1.2试剂和材料：尿素、1％甲基纤维素、两性电解质Pharalyte2.5-5、两性电解质Pharalyte5-8、等电点pI marker3.38、等电点pI marker3.38、电极缓冲液、亚氨基二乙酸(IDA)、超滤管、涂层毛细管卡盒CIEF。
1.3溶液的配制：
1.3.1 200mmol/L IDA：称取亚氨基二乙酸0.027g，用1ml超纯水溶解即得。
1.3.2按照下表1配制样品预混液，此为10针样品所需量，如需要配制更多或更少预混液，可以等比例扩大或缩小体积。
表1样品预混液的配制
Figure BDA0002943944840000061
Figure BDA0002943944840000071
1.4样品的制备
1.4.1浓缩：将200μl的样品将入到超滤管中，14000rpm离心10min；若浓度明显不足1.6mg/ml，继续补加样品，14000rpm离心10min，反复操作，直至浓缩到浓度高于1.6mg/ml。
1.4.2脱盐：在浓缩好的样品中加入300μl超纯水，14000rpm离心10min；再加入300μl超纯水，14000rpm离心10min。用紫外分光光度计测定脱盐后的浓度，然后用超纯水调整蛋白浓度为1.6mg/ml，即为样品工作液。
1.5对照品同1.4所述操作，得到对照品工作液。
1.6样品的处理
取样品预混液80μl，加入1.6mg/ml的供试品溶液20μl，充分混匀后，13000rpm离心3min除气泡，小心从上层吸取80μl加至孔板中，使用平板离心机1000rpm离心5min，待分析。对照品溶液、空白样品(超纯水)同法操作。
1.7设置仪器参数
样品盘温度10℃；预聚焦(第一阶段)电压1500V，预聚焦时间1min；聚焦(第二阶段)电压3000V，聚焦时间12min；样品上样时间55s。
试验例1聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法中各检测参数的优化试验
1、两性电解质溶液的比例优化
两性电解质溶液选用GE品牌的Pharmalyte 2.5-5与Pharmalyte5-8(Pharmalyte的中文释义即为两性载体/两性电解质，该名称为GE品牌两性电解质溶液的商品名)；配制预混液体系时分别试验了Pharmalyte 3-10、Pharmalyte 2.5-5/Pharmalyte 3-10(二者体积比例为1:1)、Pharmalyte 2.5-5/Pharmalyte 5-8(二者体积比例为1:1)、Pharmalyte2.5-5/Pharmalyte 5-8(二者体积比例为3:1)四种两性电解质溶液进行相应的检测。
检测结果见图1-图4。由各谱图的峰形及分离效果可以看出，仅利用Pharmalyte3-10作为两性电解质时，酸端pI Marker已跑出检测范围且样品无法完全出峰；将Pharmalyte 2.5-5与Pharmalyte3-10按照1:1混合作为两性电解质时，可以见到4个异构体峰，但峰形不理想，且酸端pI Marker仍然不易识别；将Pharmalyte 2.5-5与Pharmalyte 5-8按照1:1混合作为两性电解质时，峰形明显改善且酸端pI Marker已在检测范围边缘；将Pharmalyte 2.5-5与Pharmalyte 5-8按照3:1混合作为两性电解质时，酸端与碱端pIMarker均可识别到且峰形及分离度较好。因此Pharmalyte 2.5-5/Pharmalyte 5-8(比例3:1)最适宜作为本等电聚焦体系的两性电解质。
2、预混液体系不加IDA以及添加不同用量的IDA的对比试验
分别试验了预混液体系不加IDA以及加IDA的情况，同时试验了预混液中IDA加量为10mmol、100mmol以及200mmol的情况。结果见图5-图8。不添加IDA的结果如上述图4所示，与图5比较，加入10mmol的IDA后峰形显著改善，分离度明显提高。同时，加入10mM IDA时聚焦过程的电流最大值在15uA以下(图6)，而加入100mmol以及200mmol IDA时虽然同样可起到改善峰形，提高分离度的效果，但聚焦过程的电流最大值分别接近45及65uA(图7-图8)，远超过仪器可持续耐受的20uA。因此，预混液体系中加入10mmol IDA较为适宜。
3、PEG-EPO样品进行预处理以及浓度调整的优化试验
分别试验了将PEG-EPO样品脱盐后调整蛋白浓度至1.0mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL以及4.0mg/mL。
检测结果见图9-图12。试验结果表明，1.6mg/mL及2.0mg/mL的蛋白浓度作为工作浓度时，异构体分离效果较好且峰高适中，峰形较为理想。通过进一步的线性范围验证(对工作浓度的80％-150％进行试验，考察峰面积与蛋白浓度之间的线性，见以下试验例4)，结果表明工作浓度为1.6mg/mL时，在其80％-150％范围内的蛋白浓度(0.8-2.4mg/mL)均与峰面积有良好的线性，但工作浓度为2mg/mL时，无法满足80％-150％范围内的良好线性。因此PEG-EPO样品的最优工作蛋白浓度为1.6mg/mL。
4、聚焦(第二阶段)阶段的电压以及聚焦时间的优化试验
分别试验了聚焦时间为9min、10min、12min以及14min的情况。
具体试验结果见图13-图16。结果显示，聚焦时间为9min或者10min时，聚焦不够充分，当分别聚焦至12min和14min时，峰形已无明显改变，且分离效果较理想，表明聚焦完成。因此，选择聚焦时间为12min即可满足要求。
试验例2本发明建立的检测方法的特异性考察试验
对空白样品(超纯水)、PEG-EPO对照品以及PEG-EPO原液进行电荷异质性的检测。结果(图17)显示，空白对照、样品A(PEG-EPO对照品)和样品B(PEG-EPO原液)的聚焦图谱中pI Marker均清晰可见，空白对照品中无干扰峰存在，特异性良好。
试验例3本发明建立的检测方法的重复性考察试验
按要求制备预混液和样品工作液，样品重复进样6针，超纯水代替样品作为空白对照。积分各异构体峰，记录6针各异构体峰的pI值、峰面积百分比。可接受标准：6针样品各异构体峰pI值的SD应≤0.2；峰1的峰面积百分比的RSD应≤10.0％；峰2和峰3的峰面积百分比的RSD均应≤5.0％，峰4的峰面积百分比的RSD应≤20.0％。
重复性考察结果见表2。
表2重复性考察结果
Figure BDA0002943944840000101
6份平行样品峰1、峰2、峰3和峰4的SD值均为0.0，6份平行样品峰1峰面积％、峰2峰面积％、峰3峰面积％、峰4峰面积％的RSD值依次为4.2、2.1、1.8、14.8，均符合可接受标准，说明该方法重复良好。试验例4本发明建立的检测方法的线性范围考察
取400μl样品置于超滤管中，14000rpm离心10min，加入300μl超纯水，混匀，14000rpm离心10min，再加入300μl超纯水，混匀，14000rpm离心，浓缩脱盐后的样品用分光光度计测定蛋白浓度，并用超纯水调整离心后体积使蛋白终浓度为2.4mg/ml。再用超纯水将上述分别稀释为0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml的浓度，即制备得到浓度为样品工作液浓度50％、75％、100％、125％、150％的5个样品，分别记为样品A1，样品A2，样品A3，样品A4，样品A5，每个样品平行制备3份进行检测。
检测结束后积分各异构体峰，记录各异构体峰的峰面积和峰面积百分比。分别计算每个浓度样品所有异构体峰面积的总和(总CPA)，测定每个浓度点3针进样总CPA试验平均值。以各浓度点(样品A1-样品A5)的总CPA平均值与蛋白浓度做直线回归方程。可接受标准：各个不同线性浓度样品的总CPA平均值与蛋白浓度呈线性相关，R2≥0.95。
检测结果如图18示，总CPA平均值与浓度之间的R2＝0.99，该方法在50％-150％浓度范围内，线性良好。
试验例5本发明建立的检测方法的定量限考察试验
用超纯水将样品工作液(1.6mg/ml)倍比稀释浓度依次为0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml。分别记为样品A1，样品A2，样品A3，样品A4，样品A5，样品A6，每个样品平行制备3份。进样分析后积分各异构体峰，测定每个稀释样品的最高峰的信噪比(S/N)。结果见表3。
表3定量限考察结果
Figure BDA0002943944840000111
当样品浓度为0.2mg/ml时，最高峰的信噪比平均值为18，由此可推算信噪比S/N＝10时的样品浓度为0.11mg/ml。因此该方法样品的最低定量浓度为0.11mg/ml，灵敏度较高。0.2mg/ml样品3份平行样品的叠加图谱见图19。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，其特征在于，包括：(1)制备待检测的聚乙二醇重组人促红素样品；(2)配制预混液；(3)将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液混合，采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测得到等电聚焦谱图；(4)根据等电聚焦图谱中等电点标记物的迁移时间和pI值，确定待分析的蛋白样品各异构体的pI值；根据等电聚焦图谱的相关信息，确定待分析的蛋白样品各异构体的含量百分比。
2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的制备聚乙二醇重组人促红素样品包括将聚乙二醇重组人促红素样品进行超滤脱盐处理后再调整聚乙二醇重组人促红素样品中的蛋白浓度；优选的，将聚乙二醇重组人促红素样品中的蛋白浓度调整为0.8-4.0mg/mL；更优选的，将聚乙二醇重组人促红素样品中的蛋白浓度调整为1.6mg/mL。
3.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的预混液包括两性电解质、酸端等电点标记物、碱端等电点标记物、助溶剂、修饰及助分离剂、占位剂和水。
4.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于，各成分的最终含量为：两性电解质3-5v％、酸端等电点标记物0.5-1.0v％、碱端等电点标记物0.5-1.0v％、助溶剂12-20％、修饰及助分离剂0.1-0.5v％、占位剂10-200mM，余量为超纯水。
5.按照权利要求4所述的检测方法，其特征在于，各成分的最终含量为：两性电解质4v％、酸端等电点标记物0.8v％、碱端等电点标记物0.5v％、助溶剂16％，修饰及助分离剂0.35v％、占位剂10mM。
6.按照权利要求3-5任何一项所述的检测方法，其特征在于，所述的两性电解质是Pharmalyte 3-10、由Pharmalyte 2.5-5和Pharmalyte 3-10组成的两性电解质溶液或由Pharmalyte 2.5-5和Pharmalyte 5-8组成的两性电解质溶液中的任何一种；优选的，所述两性电解质是将Pharmalyte 2.5-5与Pharmalyte 5-8按照3:1混合作为两性电解质。
7.按照权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述酸端等电点标记物的pI值为3.38或3.59；所述碱端等电点标记物的pI值为5.85。
8.按照权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述助溶剂为尿素；所述修饰及助分离剂为甲基纤维素；所述占位剂为亚氨基二乙酸。
9.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液按照4:1的体积比例进行混合。
10.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测的各项参数为：样品盘温度为10℃或15℃；预聚焦电压1500V，预聚焦时间1min；聚焦电压3000V，聚焦时间9-14min；优选的，聚焦时间为12min。
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