CN112980934A - 一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法 - Google Patents

一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，且公开了一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，包括以下步骤：S1、样本板制备：样本板中的一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，DNA template 0.4μl，ddH2O 0.1μl；根据每个样本需要做的SNP位点数配置每个样本的Sample‑Mix，分装到96孔板或384孔板；S2、SNP板制备：SNP板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，Primer mix 0.2μl；ddH2O 0.3μl；根据每个SNP位点需要做的样本数配制每个SNP位点的SNP‑Mix，分装到96孔板或384孔板；本发明单次实验最高通量高达1536个反应，是常规方法的4倍或16倍，同时该方法实验通量可灵活变动，也可满足常规96个或384个反应通量，经测试最佳反应体系为2μl反应体系，相比常规qPCR 10μl反应体系，试剂成本节约了80％。

Description

一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法。
背景技术
SNP(single nucleotide polymorphism)，单核苷酸多态性，是基因组上某些位点发生的单个核苷酸变异，是基因组上可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP数量很多，作为遗传标记常被用于各类疾病相关基因研究、动植物育种、种属与个体鉴定、疾病分子遗传机制解读和靶向治疗位点的筛选等。
基因位点上的单核苷酸多态性(SNP)检测因SNP数量不同，对应样本数量差异，会选择不同分型检测方法，传统的基于实时荧光定量PCR的基因分型技术，在大量样本(育种1000-10000个，药筛100-1000)中对限定数量的SNP(一般低于100个)进行检测时存在四大技术弊端：
(1)、常规qPCR仪限定单次实验通量为96个或384个反应，当样本量或和SNP个数增多时，实验通量成为最大的限制因素。
(2)、常规qPCR基因分型技术，采用TaqMan探针法，需要针对每一个SNP设计一对特异性荧光探针和一对特异性扩增引物，当研究的SNP位点增多时，特异性荧光探针成本高昂，为研究者带来较大的经济压力。
(3)、常规基因分型方法仅适用于qPCR系统，对不能实时检测的荧光检测设备(如酶标仪)平台不兼容。
(4)、微升级反应体系对应样本的DNA使用量较多，当样本较难获取或者DNA得率较低时往往无法获得更多位点的检测结果。
为解决以上基于常规qPCR系统的基因分型检测的技术弊端，本发明公开了一种新型终点法超高通量自动化基因分型检测方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，解决了上述背景技术中所存在的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，包括以下步骤：
S1、样本板制备：
样本板中的一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，DNAtemplate 0.4μl，ddH2O 0.1μl；根据每个样本需要做的SNP位点数配置每个样本的Sample-Mix，分装到96孔板或384孔板；
S2、SNP板制备：
SNP板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix0.5μl，Primermix 0.2μl；ddH2O 0.3μl；根据每个SNP位点需要做的样本数配制每个SNP位点的SNP-Mix，分装到96孔板或384孔板；
S3、自动化点样：
采用自动化移液工作站或纳升级自动化移液系统，将样本板和SNP板内溶液，分别佳载到1536孔板中，每孔加1ul Sample-Mix和1ul Primer-Mix，即1536孔板，单孔反应体系为：2×PARMS master mix 1μl，Primer mix 0.2μl；DNA template 0.4μl，ddH2O 0.4μl；
S4、起点荧光信号检测：
由于PARMS PCR反应体系中荧光基团采用的VIC和FAM，使用酶标仪分别检测配制好的1536孔板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S5、PCR扩增：
将配制好的1536孔板放入与之适配的1536孔PCR仪进行PCR扩增，扩增程序：第1步：57℃1min；第2步：94℃10min；第3步：94℃20s；第4步：65℃1min；回到第3步，10个循环，每个循环降温0.8℃；第5步：94℃20s；第6步：57℃1min；回到第5步，24个循环；第7步：57℃1min；
S6、终点荧光信号检测：
使用酶标仪分别检测已完成PCR扩增的1536孔反应板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S7、数据处理，准确率统计：
计算方法：(Sample扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)-(NTC扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)结果为正代表该种荧光信号对应的基因型检出，非正值则代表该种荧光信号对应的基因型未检出；
S8、体系优化与重复性验证：
设置PCR反应体系为1μl反应体系、2μl反应体系、3μl反应体系，分别进行准确性检测、批次间重复性检测、同批次内重复性验证。
优选的，所述DNA template的浓度为50ng/μl。
优选的，所述Primer mix的制备方法为：Allele A primer 15μl，Allele Bprimer 15μl，Locus common Primer 40μl，ddH2O 30μl，可根据需求按比例调整配制体积。
优选的，所述Allele A primer、Allele B primer、Locus common Primer的浓度为10μM。
优选的，所述步骤S3中，将配制好的1536孔板封膜，轻微震荡混匀，短暂离心至无气泡。
(三)有益效果
本发明提供了一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，具备以下有益效果：
(1)、单次实验最高通量高达1536个反应，是常规方法的4或16倍，同时该方法实验通量可灵活变动，也可满足常规96个或384个反应通量。
(2)、采用PARMS技术替代TaqMan探针法，PARMS技术所有SNP位点采用一对通用荧光探针，和SNP特异性扩增引物(普通引物)，大大降低了探针合成成本。
(3)、采用PARMS技术替代TaqMan探针法，PARMS技术所有SNP位点采用一对通用荧光探针，和SNP特异性扩增引物(普通引物)，大大降低了探针合成成本。
(4)、该方法适用平台广，可兼容qPCR检测系统和酶标检测系统。
附图说明
图1为本发明的工作流程示意图；
图2为本发明中基于酶标系统的新型基因分型检测不同反应体系批次间CV值分布图；
图3为本发明中基于酶标系统的新型基因分型检测不同反应体系批次内CV值分布图；
图4为本发明基于qPCR系统的新型基因分型检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1-3所示，基于酶标系统的终点法超高通量自动化基因分型检测方法：
采用半滑舌鳎已知性别的10条雄鱼(ZZ基因型别)、8条雌鱼(ZW基因型别)的核酸样本，2个SNP位点8935966(简称966)、8936186(简称186)，进行该方法基因分型准确性验证。其中两个位点均为：雄鱼纯合基因型，对应VIC信号；雌鱼杂合基因型，对应VIC和FAM信号：
S1、样本板制备：
样本板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，DNAtemplate(50ng/μl)0.4μl，ddH2O 0.1μl；根据每个样本需要做的SNP位点数配制每个样本的Sample-Mix，分装到96孔板；
S2、SNP板制备：
SNP板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，Primermix 0.2μl；ddH2O 0.3μl；根据每个SNP位点需要做的样本数配制每个SNP位点的SNP-Mix，分装到96孔板；
注：Primer mix配制方法：Allele A primer(10μM)15μl，Allele B primer(10μM)15μl，Locus common Primer(10μM)40μl，ddH2O 30μl，可根据需求按比例调整配制体积；
S3、自动化点样：
采用纳升级自动化移液系统，将样本板和SNP板内配制试剂，分别移液到1536孔板中，每孔加1μl Sample-Mix和1μl Primer-Mix，即1536孔板，单孔反应体系为：2×PARMSmaster mix 1μl，Primer mix 0.2μl；DNA template(50ng/μl)0.4μl，ddH2O 0.4μl，将配制好的1536孔板，封膜，轻微震荡混匀，短暂离心至无气泡；
S4、起点荧光信号检测：
由于PARMS PCR反应体系中荧光基团采用的VIC和FAM，使用酶标仪分别检测配制好的1536孔板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S5、PCR扩增：
将配制好的1536孔板放入与之适配的1536孔PCR仪进行PCR扩增，扩增程序：第1步：57℃1min；第2步：94℃10min；第3步：94℃20s；第4步：65℃1min；回到第3步，10个循环，每个循环降温0.8℃；第5步：94℃20s；第6步：57℃1min；回到第5步，24个循环；第7步：57℃1min；
S6、终点荧光信号检测：
使用酶标仪分别检测已完成PCR扩增的1536孔反应板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S7、数据处理，准确率统计：
计算方法：(样本扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)-(NTC扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)结果为正代表该种荧光信号对应的基因型检出，非正值则代表该种荧光信号对应的基因型未检出。
准确率检测结果如下：
实验条件：8935966位点-VIC基因型-2μl反应体系；错误个数：1；样本个数：18；准确率：94％；
实验条件：8935966位点-FAM基因型-2μl反应体系；错误个数：0；样本个数：18；准确率：100％；
实验条件：8935966位点-2μl反应体系基因分型；错误个数：1；样本个数：18；准确率：94％；
实验条件：8936186位点-VIC基因型-2μl反应体系；错误个数：0；样本个数：18；准确率：100％；
实验条件：8936186位点-FAM基因型-2μl反应体系；错误个数：0；样本个数：18；准确率：100％；
实验条件：8936186位点-2μl反应体系基因分型；错误个数：0；样本个数：18；准确率：100％；
S8、体系优化与重复性验证：
设置PCR反应体系为1μl反应体系、2μl反应体系、3μl反应体系，分别进行准确性检测、批次间重复性检测、同批次内重复性验证；
实验方法同上述准确性实验方法。不同PCR反应体系，保持各组分比例与实验1相同；
实验过程中发现1μl反应体系，预实验时由于体系体积过小，导致部分孔未检测到信号值，故舍弃1μl反应体系；
(a)不同反应体系检测准确性结果如下：
实验准确性：8935966位点-2μl体系；错误数：1；样本数：18；准确率：94％；
实验准确性：8936186位点-2μl体系；错误数：0；样本数：18；准确率：100％；
实验准确性：8935966位点-3μl体系；错误数：2；样本数：18；准确率：89％；
实验准确性：8936186位点-3μl体系；错误数：1；样本数：18；准确率：94％；
2μl反应体系检测准确率高于3μl反应体系；
(b)不同反应体系检测批次间重复性结果如图2所示：
40个样本基于酶标检测系统的超高通量基因分型检测批次间重复性良好。2μl反应体系绝大部分CV值＜3％，3μl反应体系绝大部分CV值＜4％。不同批次间重复性2μl反应体系略优于3μl反应体系。
(c)检测批次内重复性验证结果如图3所示：
同一批次内不同反应体系3个样本10次重复性良好；2μl反应体CV值＜4.5％，3μl反应体系CV值＜5.5％。同批次内重复性2μl反应体系略优于3μl反应体系。
综合以上实验结果，基于酶标检测系统的终点法超高通量自动化基因分型检测方法最优体系为2μll反应体系。检测批次间和批次内稳定性良好。检测准确性94％以上，有进一步优化提升的空间。
基于酶标检测系统的超高通量基因分型检测方法不仅限于1536个反应通量，亦适用于常规96和384个反应通量。
实施例二
如图1、4所示，基于qPCR系统的终点法超高通量自动化基因分型检测方法：
采用半滑舌鳎已知性别的10条雄鱼(ZZ基因型别)、8条雌鱼(ZW基因型别)的核酸样本，2个SNP位点8935966(简称966)、8936186(简称186)，进行该方法基因分型准确性验证。其中两个位点均为：雄鱼纯合基因型，对应VIC信号；雌鱼杂合基因型，对应VIC和FAM信号。
S1、样本板制备：
样本板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix0.5μl，DNAtemplate(50ng/5μl)0.4μl，ddH2O 0.1μl；根据每个样本需要做的SNP位点数配制每个样本的Sample-Mix，分装到96孔板或384孔板；
S2、SNP板制备：
SNP板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix0.5μl，Primermix 0.2μl；ddH2O 0.3μl；根据每个SNP位点需要做的样本数配制每个SNP位点的SNP-Mix，分装到96孔板或384孔板；
Primer mix的制备方法为：Primer mix配制方法：Allele A primer(10μM)15μl，Allele B primer(10μM)15μl，Locus common Primer(10μM)40μl，ddH2O 30μl。可根据需求按比例调整配制体积；
S3、自动化点样：
采用纳升级自动化移液系统，将样本板和SNP板内配制试剂，分别移液到1536孔板中，每孔加15μl Sample-Mix和15μl Primer-Mix，即1536孔板，单孔反应体系为：2×PARMSmaster mix 1μl，Primer mix 0.2μl；DNA template(50ng/5μl)0.4μl，ddH2O 0.4μl。将配制好的1536孔板，封膜，轻微震荡混匀，短暂离心至无气泡；
将配制好的1536孔板封膜，轻微震荡混匀，短暂离心至无气泡；
S4、qPCR系统扩增检测：
将配制好的1536孔板放入与之适配的1536孔qPCR仪进行扩增检测，扩增程序：第1步：57℃1min(收集荧光)；第2步：94℃10min；第3步：94℃20s；第4步：65℃1min(收集荧光)；回到第3步，10个循环，每个循环降温0.8℃；第5步：94℃20s；第6步：57℃1min(收集荧光)；回到第5步，24个循环；第7步：57℃1min(收集荧光)；
S5、分析软件判读基因型：
qPCR检测结果，如图4所示：基于qPCR系统的超高通量基因分型检测结果准确率为100％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、样本板制备：
样本板中的一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，DNAtemplate 0.4μl，ddH2O 0.1μl；根据每个样本需要做的SNP位点数配置每个样本的Sample-Mix，分装到96孔板或384孔板；
S2、SNP板制备：
SNP板中一个样本的一个SNP位点反应体系：2×PARMS master mix 0.5μl，Primer mix0.2μl；ddH2O 0.3μl；根据每个SNP位点需要做的样本数配制每个SNP位点的SNP-Mix，分装到96孔板或384孔板；
S3、自动化点样：
采用自动化移液工作站或纳升级自动化移液系统，将样本板和SNP板内试剂，分别移液到1536孔板中，每孔加1μl样本板配制试剂和1μl SNP板配制试剂，即1536孔板单孔反应体系为：2×PARMS master mix 1μl，Primer mix 0.2μl；DNA template 0.4μl，ddH2O 0.4μl；
S4、起点荧光信号检测：
由于PARMS PCR反应体系中荧光基团采用的VIC和FAM，使用酶标仪分别检测配制好的1536孔板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S5、PCR扩增：
将配制好的1536孔板放入与之适配的1536孔PCR仪进行PCR扩增，扩增程序：第1步：57℃1min；第2步：94℃10min；第3步：94℃20s；第4步：65℃1min；回到第3步，10个循环，每个循环降温0.8℃；第5步：94℃20s；第6步：57℃1min；回到第5步，24个循环；第7步：57℃1min；
S6、终点荧光信号检测：
使用酶标仪分别检测已完成PCR扩增的1536孔反应板每孔的VIC和FAM的荧光信号；
S7、数据处理，准确率统计：
计算方法：(样本扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)-(NTC扩增后荧光信号值-扩增前荧光信号值)结果为正代表该种荧光信号对应的基因型检出，结果为非正值则代表该种荧光信号对应的基因型未检出。
S8、体系优化与重复性验证：
设置PCR反应体系为1μl反应体系、2μl反应体系、3μl反应体系，分别进行准确性检测、批次间重复性检测、同批次内重复性验证。
2.根据权利要求1所述的一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，其特征在于：所述DNA template的浓度为50ng/μl。
3.根据权利要求1所述的一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，其特征在于：所述Primer mix的制备方法为：Allele A primer 15μl，Allele B primer 15μl，Locus common Primer 40μl，ddH2O30μl，可根据需求按比例调整配制体积。
4.根据权利要求4所述的一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，其特征在于：所述Allele A primer、Allele B primer、Locus common Primer的浓度为10μM。
5.根据权利要求1所述的一种纳升级自动化完成1536个终点法基因分型的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中，将配制好的1536孔板封膜，轻微震荡混匀，短暂离心至无气泡。
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