CN112980839A

CN112980839A - 创制水稻高直链淀粉型新种质的方法及其应用

Info

Publication number: CN112980839A
Application number: CN201911298672.4A
Authority: CN
Inventors: 丁琦; 刘行丹; 王文舒; 徐念; 魏晶; 吴晓; 李银龙; 马崇烈
Original assignee: China National Seed Group Co Ltd
Current assignee: China National Seed Group Co Ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN112980839B

Abstract

本申请公开了创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括修饰水稻中的OsWaxy基因，使其转录活性增强。本申请还公开了通过所述方法创制的水稻用于育种或改良种质资源的用途，能够靶向水稻OsWaxy基因的sgRNA，以及能够靶向水稻OsWaxy基因的CRISPR/Cas9编辑载体。通过本申请所获得的OsWaxy基因编辑纯合的非转基因的水稻将是非常有价值的种质资源，可以利用它们改良水稻品种的直链淀粉含量。本申请也为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的直链淀粉含量提供一种有效的策略。

Description

创制水稻高直链淀粉型新种质的方法及其应用

技术领域

本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsWaxy基因突变体来改良水稻直链淀粉含量的方法。

背景技术

随着人民群众生活水平的日益提高，对大米的消费逐渐转向优质化和专业化。目前，行业内公认的影响大米食味品质的最重要因素为直链淀粉含量，它与米饭质地的硬度、凝聚性和粘度等特性密切相关。在优质化方面，在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻和粳稻的一级米都要求直链淀粉含量在13％-18％之间，籼稻二级米要求在13％-20％，而三级米则在13％-22％之间，因此，直链淀粉含量是国家评价优质食用稻的重要指标。与之对应的，保证直链淀粉的含量在13％-20％之间也是水稻优质化育种方向的重要目标。而随着大米消费专业化的发展，对大米直链淀粉含量的需求更加多样化，如专门用于做米粉的大米，或者专门供糖尿病患者或者高危人群食用的高抗性淀粉大米，甚至是南北方人民口感的差异，都要求在水稻育种中，能够快速精准调整直链淀粉含量，开发能够调整不同直链淀粉含量的生物技术，供育种家选择。因此，开发精准调整直链淀粉含量的生物技术手段具有重要的商业价值。

OsWaxy基因位于第6染色体的短臂，早在1990年就已被克隆，是决定直链淀粉合成的关键酶(Wang et al.,1990)。过表达或降低OsWaxy基因表达将导致贮藏器官中OsWaxy基因酶活和直链淀粉含量明显上升或下降。通过突变体实验也发现，缺失OsWaxy基因将获得直链淀粉缺失糯稻。OsWaxy基因表达调控的机制目前还不完全清楚。除基因结构发生改变，影响其表达和蛋白功能外，可能受多个水平、多种因子的协同调控。

发明内容

本申请涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsWaxy基因突变体来改良水稻直链淀粉含量的方法。最终获得了直链淀粉含量明显升高的优质水稻品种。为实现上述目的，本申请采用如下技术方案。

在第一方面，本申请提供了创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括修饰水稻中的OsWaxy基因，使其转录活性增强。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述OsWaxy基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12a、TALEN、大范围核酸酶和ZFN。优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9进行。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含第一导向RNA(sgRNA)和第二sgRNA，其中所述第一和第二sgRNA均靶向OsWaxy基因的第一内含子。

在一些具体的实施方案中，所述第一sgRNA靶向SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并且所述第二sgRNA靶向SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述第一sgRNA包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述修饰导致OsWaxy基因的第一内含子发生缺失、插入、取代或以上的组合。

在一些具体的实施方案中，所述修饰导致OsWaxy基因的第一内含子部分或完全缺失。

在第二方面，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于育种的用途。

在第三方面，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。

在第四方面，本申请提供了通过第一方面的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。

在第五方面，本申请提供了能够靶向水稻OsWaxy基因的sgRNA，其包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成，或者其包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成。

在第六方面，本申请提供了能够靶向水稻OsWaxy基因的CRISPR/Cas9编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒、表达第一sgRNA的第二表达盒和表达第二sgRNA的第三表达盒，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，所述第一sgRNA包含SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在第七方面，本申请提供了创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括将第六方面所述的CRISPR/Cas9编辑载体导入含有OsWaxy基因的水稻中。

在一些具体的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

本申请提出了一种基因编辑技术的巧妙运用，利用其定向打靶功能来实现基因结构的改变，并筛选出特定突变类型，从而改变基因的表达量。该方法简单易行、成本低、并且效率高。本申请利用基因组编辑技术对OsWaxy基因结构的定点编辑，成功地获得了直链淀粉含量的籼稻品种，也为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种直链淀粉含量提供一种有效的策略。

附图说明

图1显示了本申请实施例1中构建的编辑载体pZZT000477的图谱。

图2显示了OsWaxy基因结构的示意图及编辑策略。本申请构建的双靶标CRISPR/Cas9编缉载体同时靶向靶序列1和2，因而可以将该基因的第一个内含子完全切除，其中Wx为OsWaxy基因的缩写。

图3显示了检测T0代株系编辑情况的PCR产物的凝胶电泳结果，电泳图显示在T0代中，可以检测到内含子缺失的纯合及杂合株系，其中Wx wildtype代表OsWaxy基因野生型；Wx Intron 1del代表OsWaxy基因内含子1缺失。泳道从左向右依次为：Intron 1del homo：内含子1缺失纯合株系；Marker：标志物；Intron 1del heter：内含子1缺失杂合株系；Intron 1del heter：内含子1缺失杂合株系；Intron 1del heter：内含子1缺失杂合株系；wildtype：野生型。

图4显示了野生型株系和编辑株系OsWaxy基因的核苷酸序列，其中粗体代表靶序列，下划线代表PAM序列，数字代表核苷酸数目，WT代表野生型，X32中M1、M2、M3、M4分别代表X32品种编辑株系X32-edit-55、X32-edit-21、X32-edit-17、X32-edit-07，K131中M1、M2、M3、M4分别代表空育131品种编辑株系KY131-edit-164、KY131-edit-155、KY131-edit-32、KY131-edit-101。所有序列均为T1代纯合非转基因株系的测序结果。

详细描述

提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

定义

本文使用的术语“基因编辑(gene editing)”或“基因组编辑(genome edting)”，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑指能够对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。

本文使用的术语“CRISPR/Cas9”是指使用RNA引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。参见，Jinek等人，Science 337:816-821(2013)；Cong等人，Science(2013年1月3日)；和Mali等人，Science(2013年1月3日)。目前发现的CRISPR/Cas9系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究得最深入的类型。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游临近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。

本文使用的术语“CRISPR/Cas12a”是一类新型的CRISPR-Cas系统。相较于Cas9蛋白来说，Cas12a蛋白更具准确度，同时也更安全。CRISPR/Cas9工作时，Cas9蛋白识别PAM序列(RNA编写的遗传密码)，通过gRNA解开部分双螺旋，在这个过程中，Cas9蛋白一旦找到匹配较好的序列时，便会紧密贴合在该段DNA上，而在这个过程中，也许会出现一些错配的现象，但这种结合是不可逆的。而在这一方面，Cas12a就显得机智许多，它在寻找“靶标”时，会对沿途的DNA序列进行单碱基的识别，如若发现有匹配不好的碱基，便会离开重新寻找，在寻找到PAM序列时，Cas12a蛋白会与PAM序列形成一种半封闭的R-环(R-loop)，当识别到正确的序列时，才会完全结合成封闭的R-环，所以这种结合是可逆的，这也体现出了它更安全的一面。

本文使用的术语“转录激活子样效应器核苷酶”或“TAL效应器核苷酶”或“TALEN”是指一类通过使TAL效应器DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。

本文使用的术语“锌指核酸酶(ZFN)”由一个DNA识别域以及一个DNA剪切域组成。DNA识别域为3～4个ZF串联结构，每个ZF约含30个氨基酸，被1个锌离子所固定，可识别并结合1个特异的三联体碱基，DNA剪切域由非特异性核酸内切酶Fok I羧基端的96个氨基酸残基组成。每个Fok I单体与1个ZFP相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时(6～8bp)，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。

本文使用的术语“大范围核酸酶(meganuclease)”是指能够识别14-40碱基长度的核酸序列的归巢核酸内切酶。一些大范围核酸酶可以容忍小的归巢位点序列差异，大的识别区域仍然能够保证这些酶的高度特异性，而这反过来又可保持低水平的基因组内非特异性裂解和较低的毒性。大范围核酸酶由自我剪接RNA内含子或自我剪接蛋白内含子序列的移动序列内的开放阅读框架编码。

本文使用的术语“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽的情况下，指相同或具有相同核苷酸或氨基酸的指定百分比(即在指定区域内，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列，如利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以默认参数或通过手工比对和可视检查(参阅如NCBI网站等)所测量的。

具体实施方式

本申请提出了一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制缺失第一内含子的OsWaxy基因突变体来改良水稻直链淀粉含量的方法，本申请适应于所有含有功能性OsWaxy基因的水稻品种中，包括以下步骤：

(1)拟改良水稻品种OsWaxy基因的序列分析，在第一内含子两侧选择合适位点设计靶标；

(2)构建编辑载体，载体中含有第一内含子两侧的两个靶点，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将编辑载体导入愈伤组织细胞，并再生成水稻株系；

(3)对OsWaxy基因编辑株系的基因型检测和分析，选取第一内含子被完全切除的纯合编辑株系进行性状分析，考察直链淀粉含量。

(4)经过传代分离、鉴定筛选，得到编辑纯合且非转基因的高直链淀粉含量水稻种质。

本申请的创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，具体包括以下步骤：

(1)水稻中OsWaxy基因的检测；

(2)水稻中OsWaxy基因CRISPR/cas9编辑表达载体的构建；

(3)将粳稻空育131和籼稻X32的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将编辑载体导入，鉴定转基因株系OsWaxy基因编辑情况，获得第一内含子完全缺失的OsWaxy等位基因基因型。经过传代分离、鉴定筛选，得到编辑纯合且非转基因的株系，最终获得高直链淀粉含量的改良品系。

本申请具体涉及如下技术方案。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述OsWaxy基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

本文所用的术语“活性变体序列”指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，活性变体序列包括由于遗传密码子简并性而编码相同功能的蛋白质的那些序列。诸如天然存在的等位基因变体可以使用公知的分子生物学技术例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。例如，在本申请中，与粳稻空育131和籼稻X32的OsWaxy基因具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并且也编码功能性OsWaxy蛋白的来自其他水稻品种的基因，包括在本申请定义的“活性变体序列”中。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。核苷酸的活性变体序列与该核苷酸序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个核苷酸。

对于蛋白质序列，术语“活性变体序列”包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通过缺失(所谓的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸或将一个或多个氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。因而，就蛋白质而言，术语“活性变体序列”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性，例如具有OsWaxy蛋白功能的足够数目的连续氨基酸残基。这样的功能相对天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者可以是不变的，只要保留了OsWaxy蛋白功能。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。蛋白的活性变体序列与该蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个氨基酸残基。

在一些具体的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含第一导向RNA(sgRNA)和第二sgRNA，其中所述第一和第二sgRNA均靶向OsWaxy基因的第一内含子。举例来说，靶位点可以选在该基因第一内含子中的内含子剪接位点及其附近区域，使该基因的第一个内含子被完全删除，但不影响该基因的表达。

在一些具体的实施方案中，所述第一sgRNA包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在一些具体的实施方案中，所述修饰导致OsWaxy基因的第一内含子部分或完全缺失。修饰结果意图为从基因组中删除OsWaxy基因第一个内含子附近区域的全部或者部分序列，包括第一内含子两侧5’UTR序列的改变。修饰结果改变了OsWaxy的基因结构，但并不影响上下游蛋白质的翻译和氨基酸的序列。

在第六方面，本申请提供了能够靶向水稻OsWaxy基因的CRISPR/Cas9编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒、表达第一sgRNA的第二表达盒和表达第二sgRNA的第三表达盒，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，所述第一sgRNA包含SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在优选的实施方案中，所述水稻为一些其它性状良好，直链淀粉含量尚需改良的品种，例如籼稻或粳稻。在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻X32和粳稻空育131。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

实施例

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用的水稻品种为籼稻X32和粳稻空育131，其中籼稻X32由中国种子集团有限公司提供，粳稻空育131由华中农业大学赠送。

实施例1 CRISPR/Cas9编缉载体的构建

水稻OsWaxy基因的序列分析及基因编辑靶点设计

水稻OsWaxy基因的序列如SEQ ID NO：1所示。序列分析显示，该基因含有14个外显子和13个内含子，其中第1个内含子位于5‘UTR中，位于SEQ ID NO：1中第139-1267位碱基。本实施例所设的靶序列1和靶序列2在籼稻X32和空育131材料中均位于OsWaxy基因的第一内含子中，其中靶序列1在SEQ ID NO：1的第174-192位碱基(即TCTTATTCAGATCGATCAC(SEQID NO：3))，靶序列2在SEQ ID NO.1的第1217-1236位碱基(GTTCAAATTCTTTTAGGCTC(SEQ IDNO：4))，如图2。

CRISPR/Cas9编缉载体的构建

本实施例采用的基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/cas9，所使用的载体根据Liu等人(具体信息请参见参考文献部分)的方法设计，利用CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在线工具设计了针对靶序列1的导向RNA(sgRNA)(SEQ IDNO：5)和针对靶序列2的导向RNA(sgRNA)(SEQ ID NO：6)，sgRNA是由引导RNA(gRNA)和骨架RNA(gRNA scaffold)核苷酸序列连接起来的一个整体分子。植物表达载体包含甘蔗Ubi4启动子(即甘蔗泛素4启动子)驱动的Cas9(SEQ ID NO：7)表达盒，水稻U3启动子驱动的针对靶序列1的sgRNA表达盒，以及水稻U6启动子驱动的针对靶序列2的sgRNA表达盒。构建的CRISPR/Cas9编缉载体命名为pZZT000477，其图谱参见图1。

实施例2籼稻X32和粳稻空育131的遗传转化

将实施例1构建的编辑载体转入农杆菌菌株EHA105(华中农业大学馈赠)中并进行测序鉴定。分别由籼稻X32和粳稻空育131种子诱导产生胚性愈伤组织，与含有上述编缉载体的农杆菌EHA105共同孵育，经过筛选再生等一系列步骤完成遗传转化。农杆菌侵染水稻愈伤组织及筛选、分化流程参照Nishimura等的文献报道(A protocol forAgrobacterium-mediated transformation in rice.Nature protocols,2006,6:2 796-2802)。具体流程包括，水稻愈伤组织与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织于250mg/LCarbenicillin的ddH₂O中浸泡30min，去除多余的农杆菌后置于含250mg/L Carbenicillin的筛选培养基上筛选3轮，然后将抗性愈伤转移至再生培养基上培养，待分化出2～3cm的小苗后，将其转移至生根培养基中继续培养2周。

实施例3 T0代OsWaxy基因编辑水稻的筛选和鉴定

将实施例2中的再生株系送至温室种植，取再生的T0代小苗叶片，通过CTAB法提取植物基因组DNA作为模板。DNA样品用荧光定量PCR方法进行阳性检测。荧光定量PCR方法选择筛选标记基因CP4作为目标基因和水稻ACTIN1基因作为内参基因，于荧光定量PCR仪上进行扩增和荧光值检测，根据RQ值筛选出转基因阳性的株系(CP4基因RQ值>0.1，结果未示出)。用于扩增筛选标记基因CP4的引物序列为csp356：CAGCACAGGTTAAGTCTG(SEQ ID NO：8)和csp357：GTCTGTCTCAACGGTAAG(SEQ ID NO：9)；用于扩增ACTIN1基因的引物序列为csp106：TGCTATGTACGTCGCCATCCAG(SEQ ID NO：10)和csp107：AATGAGTAACCACGCTCCGTCA(SEQ ID NO：11)。

在OsWaxy基因的第一个内含子两侧设计引物，确保扩增片段包含被编辑切除的内含子序列，利用Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖DNA电泳，筛选出两个靶序列均发生切割，导致两个靶序列间1041bp核苷酸被完全切除的编辑株系。PCR检测整个内含子发生切除的引物序列为csp6207：TCACGCAACGGCGCTACAAATAGC(SEQ ID NO：12)和csp6209：GTTTGTGTGTGCTTACAGCCATGG(SEQ ID NO：13)。野生型株系的PCR扩增产物的大小为1865bp，内含子删除后PCR扩增产物的大小为825bp，参见图3。

实施例4 T1代OsWaxy基因编辑纯合非转基因水稻的筛选和鉴定

将实施例3中鉴定的内含子完全切除的阳性水稻株系移入温室进行移栽种植，收取其自交T1代种子。选取4-6株内含子完全切除的阳性水稻株系的T1代种子(约100粒)，进行发芽、育苗，提取幼苗的DNA进行转基因成分检测及编辑位点PCR检测，从中筛选出非转基因及编辑位点纯合的株系。转基因成分检测方法请参见《基因编辑后代材料GMO检测流程》，其是根据中国国家标准农业部953号公告6-2007号公告GB/T19495—2004转基因产品检测标准要求进行。编辑位点纯合株系指利用上述csp6207及csp6209引物进行基因组PCR扩增后，扩增产物只能检测到目标编辑基因型(825bp)，检测不到野生型基因型条带(1865bp)。为确认编辑株系中OsWaxy基因编辑情况，对其靶位点区域的PCR扩增产物进行一代测序。结果显示，空育131品种编辑株系KY131-edit-164、KY131-edit-155、KY131-edit-32、KY131-edit-101以及X32品种编辑株系X32-edit-55、X32-edit-21、X32-edit-17、X32-edit-07均为非转基因的纯合编辑株系，参见图4。

实施例5编辑株系的籽粒表型鉴定

将实施例4中的非转基因及编辑位点纯合的株系移栽入温室，收获T2代种子后进行直链淀粉含量测定，以未编辑的野生型KY131和X32为对照(CK)。直链淀粉含量测定方法参照农业部标准NY/T 2639-2014《稻米直链淀粉的测定-分光光度法》。测定结果显示删除了OsWaxy基因第一个内含子后，水稻空育131和X32品种的直链淀粉含量均出现显著上调，从原本的11-13％上调至20％-24％左右(表1)。

表1：基因编辑水稻品种的直链淀粉含量

从上述结果中可以看出，本申请利用CRISPR/Cas9基因编辑技术删除了OsWaxy基因的第一个内含子，改变了OsWaxy的基因结构。与TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，是一种快速改良水稻直链淀粉含量以及获得相关种质资源的生物技术育种方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请的技术方案作了详尽的描述，但在这些技术方案的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

参考文献：

Hiro-Yuki Hirano,Mitsugu Eiguchi,Yoshio Sano.A single base changealtered the regulation of the Waxy gene at the posttranscriptional levelduring the domestication of rice.Molecular Biology and Evolution,1998,15(8):978-987

Masayuki Isshiki,Kazuko Morino,Midori Nakajima,Ron J.Okagaki,SusanR.Wessler,Takeshi Izawa,Ko Shimamoto.A naturally occurring functional alleleof the rice waxy locus has a GT to TT mutation at the 5'splice site of thefirst intron.The Plant Journal,1998,15(1):133-138

Zong-yang Wang,Zhi-liang Wu,Yan-yan Xing,Fei-gin Zheng,Xiao-Ii Guo,Wei-guo Zhang and Meng-min Hong.Nucleotide sequence of rice waxy gene.NucleicAcids Research,1990,18(19):5898

Hao Liu,Yuduan Ding,Yanqing Zhou,Wenqi Jin,Kabin Xie*,Ling-LingChen*.CRISPR-P 2.0:an improved CRISPR/Cas9 tool for genome editing inplants.Mol Plant,2017,10(3):530-532.

序列表

SEQ ID NO：1：水稻OsWaxy基因的核苷酸序列

序列说明：粗体显示的序列表示5’UTR；粗体加下划线显示的序列表示3’UTR；斜体显示的序列表示外显子；其余的序列表示内含子；下划线显示的序列表示PAM序列

SEQ ID NO：2：水稻OsWaxy基因编码的氨基酸序列

MSALTTSQLATSATGFGIADRSAPSSLLRHGFQGLKPRSPAGGDATSLSVTTSARATPKQQRSVQRGSRRFPSVVVYATGAGMNVVFVGAEMAPWSKTGGLGDVLGGLPPAMAANGHRVMVISPRYDQYKDAWDTSVVAEIKVADRYERVRFFHCYKRGVDRVFIDHPSFLEKVWGKTGEKIYGPDTGVDYKDNQMRFSLLCQAALEAPRILNLNNNPYFKGTYGEDVVFVCNDWHTGPLASYLKNNYQPNGIYRNAKVAFCIHNISYQGRFAFEDYPELNLSERFRSSFDFIDGYDTPVEGRKINWMKAGILEADRVLTVSPYYAEELISGIARGCELDNIMRLTGITGIVNGMDVSEWDPSKDKYITAKYDATTAIEAKALNKEALQAEAGLPVDRKIPLIAFIGRLEEQKGPDVMAAAIPELMQEDVQIVLLGTGKKKFEKLLKSMEEKYPGKVRAVVKFNAPLAHLIMAGADVLAVPSRFEPCGLIQLQGMRYGTPCACASTGGLVDTVIEGKTGFHMGRLSVDCKVVEPSDVKKVAATLKRAIKVVGTPAYEEMVRNCMNQDLSWKGPAKNWENVLLGLGVAGSAPGIEGDEIAPLAKENVAAP

SEQ ID NO：3：水稻OsWaxy基因中的靶序列1

TCTTATTCAGATCGATCACSEQ ID NO：4：水稻OsWaxy基因的靶序列2

GTTCAAATTCTTTTAGGCTC

SEQ ID NO：5：针对靶序列1的sgRNA的核苷酸序列

GTGATCGATCTGAATAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

SEQ ID NO：6：针对靶序列2的sgRNA的核苷酸序列

GAGCCTAAAAGAATTTGAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT

SEQ ID NO：7：Cas9的核苷酸序列

ATGCCGAAGAAGCGCCGCCGCGTGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTCGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTCGGCAACACCGACCGCCACTCCATCAAGAAGAACCTCATCGGCGCCCTCCTCTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCTCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCTACACCCGCCGCAAGAACCGCATCTGCTACCTCCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGCCTCGAGGAGTCCTTCCTCGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCGATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCGACCATCTACCACCTCCGCAAGAAGCTCGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTCCGCCTCATCTACCTCGCCCTCGCCCACATGATCAAGTTCCGCGGCCACTTCCTCATCGAGGGCGACCTCAACCCGGACAACTCCGACGTGGACAAGCTCTTCATCCAGCTCGTGCAGACCTACAACCAGCTCTTCGAGGAGAACCCGATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTCTCCGCCCGCCTCTCCAAGTCCCGCCGCCTCGAGAACCTCATCGCCCAGCTCCCGGGCGAGAAGAAGAACGGCCTCTTCGGCAACCTCATCGCCCTCTCCCTCGGCCTCACCCCGAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTCGCCGAGGACGCCAAGCTCCAGCTCTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTCGACAACCTCCTCGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTCTTCCTCGCCGCCAAGAACCTCTCCGACGCCATCCTCCTCTCCGACATCCTCCGCGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCGCTCTCCGCCTCCATGATCAAGCGCTACGACGAGCACCACCAGGACCTCACCCTCCTCAAGGCCCTCGTGCGCCAGCAGCTCCCGGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTCCTCGTGAAGCTCAACCGCGAGGACCTCCTCCGCAAGCAGCGCACCTTCGACAACGGCTCCATCCCGCACCAGATCCACCTCGGCGAGCTCCACGCCATCCTCCGCCGCCAGGAGGACTTCTACCCGTTCCTCAAGGACAACCGCGAGAAGATCGAGAAGATCCTCACCTTCCGCATCCCGTACTACGTGGGCCCGCTCGCCCGCGGCAACTCCCGCTTCGCCTGGATGACCCGCAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCGTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGCATGACCAACTTCGACAAGAACCTCCCGAACGAGAAGGTGCTCCCGAAGCACTCCCTCCTCTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTCACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGCAAGCCGGCCTTCCTCTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTGAAGCAGCTCAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGCTTCAACGCCTCCCTCGGCACCTACCACGACCTCCTCAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTCGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTCGAGGACATCGTGCTCACCCTCACCCTCTTCGAGGACCGCGAGATGATCGAGGAGCGCCTCAAGACCTACGCCCACCTCTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTCAAGCGCCGCCGCTACACCGGCTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTCATCAACGGCATCCGCGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTCGACTTCCTCAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGACGACTCCCTCACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTCCACGAGCACATCGCCAACCTCGCCGGCTCCCCGGCCATCAAGAAGGGCATCCTCCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAGGTGATGGGCCGCCACAAGCCGGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGCGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAGCGCATGAAGCGCATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTCGGCTCCCAGATCCTCAAGGAGCACCCGGTGGAGAACACCCAGCTCCAGAACGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGCCGCGACATGTACGTGGACCAGGAGCTCGACATCAACCGCCTCTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCGCAGTCCTTCCTCAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTCACCCGCTCCGACAAGAACCGCGGCAAGTCCGACAACGTGCCGTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGCCAGCTCCTCAACGCCAAGCTCATCACCCAGCGCAAGTTCGACAACCTCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCTCTCCGAGCTCGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGCCAGCTCGTGGAGACCCGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTCGACTCCCGCATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTCATCCGCGAGGTGAAGGTGATCACCCTCAAGTCCAAGCTCGTGTCCGACTTCCGCAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTCAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTCATCAAGAAGTACCCGAAGCTCGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGCAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCCGCAAGCGCCCGCTCATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGCGACTTCGCCACCGTGCGCAAGGTGCTCTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTCCCGAAGCGCAACTCCGACAAGCTCATCGCCCGCAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCGACCGTGGCCTACTCCGTGCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTCAAGTCCGTGAAGGAGCTCCTCGGCATCACCATCATGGAGCGCTCCTCCTTCGAGAAGAACCCGATCGACTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCGAAGTACTCCCTCTTCGAGCTCGAGAACGGCCGCAAGCGCATGCTCGCCTCCGCCGGCGAGCTCCAGAAGGGCAACGAGCTCGCCCTCCCGTCCAAGTACGTGAACTTCCTCTACCTCGCCTCCCACTACGAGAAGCTCAAGGGCTCCCCGGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTCTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTCGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAGGTGCTCTCCGCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCGATCCGCGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTCTTCACCCTCACCAACCTCGGCGCCCCGGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGCAAGCGCTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTCGACGCCACCCTCATCCACCAGTCCATCACCGGCCTCTACGAGACCCGCATCGACCTCTCCCAGCTCGGCGGCGACCCGAAGAAGCGCCGCCGCGTGTGA

SEQ ID NO：8：用于扩增筛选标记基因CP4的正向引物序列

CAGCACAGGTTAAGTCTG

SEQ ID NO：9：用于扩增筛选标记基因CP4的反向引物序列

GTCTGTCTCAACGGTAAG

SEQ ID NO：10：用于扩增ACTIN1基因的正向引物序列

TGCTATGTACGTCGCCATCCAG

SEQ ID NO：11：用于扩增ACTIN1基因的反向引物序列

AATGAGTAACCACGCTCCGTCA

SEQ ID NO：12：用于扩增OsWaxy基因编辑位点的正向引物

TCACGCAACGGCGCTACAAATAGC

SEQ ID NO：13：用于扩增OsWaxy基因编辑位点的反向引物

GTTTGTGTGTGCTTACAGCCATGG

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 创制水稻高直链淀粉型新种质的方法及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5035

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 60

ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 120

caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 180

cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 240

taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 300

catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 360

attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 420

ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 480

aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 540

tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 600

agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 660

aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 720

atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 780

ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 840

ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 900

gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 960

aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 1020

atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 1080

tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 1140

attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 1200

atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 1260

agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacca tgtcggctct caccacgtcc 1320

cagctcgcca cctcggccac cggcttcggc atcgccgaca ggtcggcgcc gtcgtcgctg 1380

ctccgccacg ggttccaggg cctcaagccc cgcagccccg ccggcggcga cgcgacgtcg 1440

ctcagcgtga cgaccagcgc gcgcgcgacg cccaagcagc agcggtcggt gcagcgtggc 1500

agccggaggt tcccctccgt cgtcgtgtac gccaccggcg ccggcatgaa cgtcgtgttc 1560

gtcggcgccg agatggcccc ctggagcaag accggcggcc tcggtgacgt cctcggtggc 1620

ctcccccctg ccatggctgt aagcacacac aaacttcgat cgctcgtcgt cgctgaccgt 1680

cgtcgtcttc aactgttctt gatcatcgca ttggatggat gtgtaatgtt gtgttcttgt 1740

gttctttgca ggcgaatggc cacagggtca tggtgatctc tcctcggtac gaccagtaca 1800

aggacgcttg ggataccagc gttgtggctg aggtaggagc atatgcgtga tcagatcatc 1860

acaagatcga ttagctttag atgatttgtt acatttcgca agattttaac ccaagttttt 1920

gtggtgcaat tcattgcaga tcaaggttgc agacaggtac gagagggtga ggtttttcca 1980

ttgctacaag cgtggagtcg accgtgtgtt catcgaccat ccgtcattcc tggagaaggt 2040

ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg catttagcag 2100

ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg gtgagaagat 2160

ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca gccttctttg 2220

ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt taccatagta 2280

tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac tcgaggctcc 2340

taggatccta aacctcaaca acaacccata cttcaaagga acttatggtg agttacaatt 2400

gatctcaaga tcttataact ttcttcgaag gaatccatga tgatcagact aattccttcc 2460

ggtttgttac tgacaacagg tgaggatgtt gtgttcgtct gcaacgactg gcacactggc 2520

ccactggcga gctacctgaa gaacaactac cagcccaatg gcatctacag gaatgcaaag 2580

gtctatgctt gttcttgcca taccaactca aatctgcatg cacactgcat tctgttcaga 2640

aactgactgt ctgaatcttt ttcactgcag gttgctttct gcatccacaa catctcctac 2700

cagggccgtt tcgctttcga ggattaccct gagctgaacc tctccgagag gttcaggtca 2760

tccttcgatt tcatcgacgg gtatgagtaa gattctaaga gtaacttact gtcaattcgc 2820

catatatcga ttcaatccaa gatccttttg agctgacaac cctgcactac tgtccatcgt 2880

tcaaatccgg ttaaatttca ggtatgacac gccggtggag ggcaggaaga tcaactggat 2940

gaaggccgga atcctggaag ccgacagggt gctcaccgtg agcccgtact acgccgagga 3000

gctcatctcc ggcatcgcca ggggatgcga gctcgacaac atcatgcggc tcaccggcat 3060

caccggcatc gtcaacggca tggacgtcag cgagtgggat cctagcaagg acaagtacat 3120

caccgccaag tacgacgcaa ccacggtaag aacgaatgca ttcttcacaa gatatgcaat 3180

ctgaattttc tttgaaaaag aaattatcat ctgtcacttc ttgattgatt ctgacaaggc 3240

aagaatgagt gacaaatttc aggcaatcga ggcgaaggcg ctgaacaagg aggcgttgca 3300

ggcggaggcg ggtcttccgg tcgacaggaa aatcccactg atcgcgttca tcggcaggct 3360

ggaggaacag aagggccctg acgtcatggc cgccgccatc ccggagctca tgcaggagga 3420

cgtccagatc gttcttctgg tataatataa tacactacaa gacacacttg cacgatatgc 3480

caaaaattca gaacaaattc agtggcaaaa aaaaaactcg aatattaggg aaggacctaa 3540

taatatcaaa taattagaag gggtgaggct ttgaacccag atcgtctagt ccaccacctt 3600

gtggagttag ccggaagacc tctgagcatt tctcaattca gtggcaaatg atgtgtataa 3660

ttttgatccg tgtgtgtttc agggtactgg aaagaagaag ttcgagaagc tgctcaagag 3720

catggaggag aagtatccgg gcaaggtgag ggccgtggtg aagttcaacg cgccgcttgc 3780

tcatctcatc atggccggag ccgacgtgct cgccgtcccc agccgcttcg agccctgtgg 3840

actcatccag ctgcagggga tgagatacgg aacggtatac aatttccatc tatcaattcg 3900

attgttcgat ttcatctttg tgcaatgcaa tgcaattgca aatgcaaatg catgatgatt 3960

ttccttgttg atttctccag ccctgtgctt gcgcgtccac cggtgggctc gtggacacgg 4020

tcatcgaagg caagactggt ttccacatgg gccgtctcag cgtcgacgta agcctataca 4080

tttacataac aatcagatat gacacatcct aataccgata agtcggtaca ctactacaca 4140

tttacatggt tgctggttat atggtttttt tggcagtgca aggtggtgga gccaagcgac 4200

gtgaagaagg tggcggccac cctgaagcgc gccatcaagg tcgtcggcac gccggcgtac 4260

gaggagatgg tcaggaactg catgaaccag gacctctcct ggaaggtata aattacgaaa 4320

caaatttaac ccaaacatat actatatact ccctccgctt ctaaatattc aacgccgttg 4380

tcttttttaa atatgtttga ccattcgtct tattaaaaaa attaaataat tataaattct 4440

tttcctatca tttgattcat tgttaaatat acttatatgt atacatatag ttttacatat 4500

ttcataaaat tttttgaaca agacgaacgg tcaaacatgt gctaaaaagt taacggtgtc 4560

gaatattcag aaacggaggg agtataaacg tcttgttcag aagttcagag attcacctgt 4620

ctgatgctga tgatgattaa ttgtttgcaa catggatttc aggggcctgc gaagaactgg 4680

gagaatgtgc tcctgggcct gggcgtcgcc ggcagcgcgc cggggatcga aggcgacgag 4740

atcgcgccgc tcgccaagga gaacgtggct gctccttgaa gagcctgaga tctacatatg 4800

gagtgattaa ttaatatagc agtatatgga tgagagacga atgaaccagt ggtttgtttg 4860

ttgtagtgaa tttgtagcta tagccaatta tataggctaa taagtttgat gttgtactct 4920

tctgggtgtg cttaagtatc ttatcggacc ctgaatttat gtgtgtggct tattgccaat 4980

aatattaagt aataaagggt ttattatatt attatatatg ttatattata cttcc 5035

<210> 2

<211> 609

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe

20 25 30

Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val

50 55 60

Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser

85 90 95

Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met

100 105 110

Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala

130 135 140

Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val

145 150 155 160

Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly

165 170 175

Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys

180 185 190

Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn

245 250 255

Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe

260 265 270

Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser

275 280 285

Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys

290 295 300

Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly

325 330 335

Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val

340 345 350

Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile

355 360 365

Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn

370 375 380

Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp

405 410 415

Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile

420 425 430

Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser

435 440 445

Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn

450 455 460

Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val

465 470 475 480

Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg

485 490 495

Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr

500 505 510

Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp

515 520 525

Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu

530 535 540

Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val

545 550 555 560

Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn

565 570 575

Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly

580 585 590

Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala

595 600 605

Pro

<210> 3

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

tcttattcag atcgatcac 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

gttcaaattc ttttaggctc 20

<210> 5

<211> 95

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 5

gtgatcgatc tgaataagag ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgc 95

<210> 6

<211> 97

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 6

gagcctaaaa gaatttgaac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgct 97

<210> 7

<211> 4149

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 7

atgccgaaga agcgccgccg cgtggacaag aagtactcca tcggcctcga catcggcacc 60

aactccgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgccgtccaa gaagttcaag 120

gtgctcggca acaccgaccg ccactccatc aagaagaacc tcatcggcgc cctcctcttc 180

gactccggcg agaccgccga ggccacccgc ctcaagcgca ccgcccgccg ccgctacacc 240

cgccgcaaga accgcatctg ctacctccag gagatcttct ccaacgagat ggccaaggtg 300

gacgactcct tcttccaccg cctcgaggag tccttcctcg tggaggagga caagaagcac 360

gagcgccacc cgatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccg 420

accatctacc acctccgcaa gaagctcgtg gactccaccg acaaggccga cctccgcctc 480

atctacctcg ccctcgccca catgatcaag ttccgcggcc acttcctcat cgagggcgac 540

ctcaacccgg acaactccga cgtggacaag ctcttcatcc agctcgtgca gacctacaac 600

cagctcttcg aggagaaccc gatcaacgcc tccggcgtgg acgccaaggc catcctctcc 660

gcccgcctct ccaagtcccg ccgcctcgag aacctcatcg cccagctccc gggcgagaag 720

aagaacggcc tcttcggcaa cctcatcgcc ctctccctcg gcctcacccc gaacttcaag 780

tccaacttcg acctcgccga ggacgccaag ctccagctct ccaaggacac ctacgacgac 840

gacctcgaca acctcctcgc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctctt cctcgccgcc 900

aagaacctct ccgacgccat cctcctctcc gacatcctcc gcgtgaacac cgagatcacc 960

aaggccccgc tctccgcctc catgatcaag cgctacgacg agcaccacca ggacctcacc 1020

ctcctcaagg ccctcgtgcg ccagcagctc ccggagaagt acaaggagat cttcttcgac 1080

cagtccaaga acggctacgc cggctacatc gacggcggcg cctcccagga ggagttctac 1140

aagttcatca agccgatcct cgagaagatg gacggcaccg aggagctcct cgtgaagctc 1200

aaccgcgagg acctcctccg caagcagcgc accttcgaca acggctccat cccgcaccag 1260

atccacctcg gcgagctcca cgccatcctc cgccgccagg aggacttcta cccgttcctc 1320

aaggacaacc gcgagaagat cgagaagatc ctcaccttcc gcatcccgta ctacgtgggc 1380

ccgctcgccc gcggcaactc ccgcttcgcc tggatgaccc gcaagtccga ggagaccatc 1440

accccgtgga acttcgagga ggtggtggac aagggcgcct ccgcccagtc cttcatcgag 1500

cgcatgacca acttcgacaa gaacctcccg aacgagaagg tgctcccgaa gcactccctc 1560

ctctacgagt acttcaccgt gtacaacgag ctcaccaagg tgaagtacgt gaccgagggc 1620

atgcgcaagc cggccttcct ctccggcgag cagaagaagg ccatcgtgga cctcctcttc 1680

aagaccaacc gcaaggtgac cgtgaagcag ctcaaggagg actacttcaa gaagatcgag 1740

tgcttcgact ccgtggagat ctccggcgtg gaggaccgct tcaacgcctc cctcggcacc 1800

taccacgacc tcctcaagat catcaaggac aaggacttcc tcgacaacga ggagaacgag 1860

gacatcctcg aggacatcgt gctcaccctc accctcttcg aggaccgcga gatgatcgag 1920

gagcgcctca agacctacgc ccacctcttc gacgacaagg tgatgaagca gctcaagcgc 1980

cgccgctaca ccggctgggg ccgcctctcc cgcaagctca tcaacggcat ccgcgacaag 2040

cagtccggca agaccatcct cgacttcctc aagtccgacg gcttcgccaa ccgcaacttc 2100

atgcagctca tccacgacga ctccctcacc ttcaaggagg acatccagaa ggcccaggtg 2160

tccggccagg gcgactccct ccacgagcac atcgccaacc tcgccggctc cccggccatc 2220

aagaagggca tcctccagac cgtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaggt gatgggccgc 2280

cacaagccgg agaacatcgt gatcgagatg gcccgcgaga accagaccac ccagaagggc 2340

cagaagaact cccgcgagcg catgaagcgc atcgaggagg gcatcaagga gctcggctcc 2400

cagatcctca aggagcaccc ggtggagaac acccagctcc agaacgagaa gctctacctc 2460

tactacctcc agaacggccg cgacatgtac gtggaccagg agctcgacat caaccgcctc 2520

tccgactacg acgtggacca catcgtgccg cagtccttcc tcaaggacga ctccatcgac 2580

aacaaggtgc tcacccgctc cgacaagaac cgcggcaagt ccgacaacgt gccgtccgag 2640

gaggtggtga agaagatgaa gaactactgg cgccagctcc tcaacgccaa gctcatcacc 2700

cagcgcaagt tcgacaacct caccaaggcc gagcgcggcg gcctctccga gctcgacaag 2760

gccggcttca tcaagcgcca gctcgtggag acccgccaga tcaccaagca cgtggcccag 2820

atcctcgact cccgcatgaa caccaagtac gacgagaacg acaagctcat ccgcgaggtg 2880

aaggtgatca ccctcaagtc caagctcgtg tccgacttcc gcaaggactt ccagttctac 2940

aaggtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctcaa cgccgtggtg 3000

ggcaccgccc tcatcaagaa gtacccgaag ctcgagtccg agttcgtgta cggcgactac 3060

aaggtgtacg acgtgcgcaa gatgatcgcc aagtccgagc aggagatcgg caaggccacc 3120

gccaagtact tcttctactc caacatcatg aacttcttca agaccgagat caccctcgcc 3180

aacggcgaga tccgcaagcg cccgctcatc gagaccaacg gcgagaccgg cgagatcgtg 3240

tgggacaagg gccgcgactt cgccaccgtg cgcaaggtgc tctccatgcc gcaggtgaac 3300

atcgtgaaga agaccgaggt gcagaccggc ggcttctcca aggagtccat cctcccgaag 3360

cgcaactccg acaagctcat cgcccgcaag aaggactggg acccgaagaa gtacggcggc 3420

ttcgactccc cgaccgtggc ctactccgtg ctcgtggtgg ccaaggtgga gaagggcaag 3480

tccaagaagc tcaagtccgt gaaggagctc ctcggcatca ccatcatgga gcgctcctcc 3540

ttcgagaaga acccgatcga cttcctcgag gccaagggct acaaggaggt gaagaaggac 3600

ctcatcatca agctcccgaa gtactccctc ttcgagctcg agaacggccg caagcgcatg 3660

ctcgcctccg ccggcgagct ccagaagggc aacgagctcg ccctcccgtc caagtacgtg 3720

aacttcctct acctcgcctc ccactacgag aagctcaagg gctccccgga ggacaacgag 3780

cagaagcagc tcttcgtgga gcagcacaag cactacctcg acgagatcat cgagcagatc 3840

tccgagttct ccaagcgcgt gatcctcgcc gacgccaacc tcgacaaggt gctctccgcc 3900

tacaacaagc accgcgacaa gccgatccgc gagcaggccg agaacatcat ccacctcttc 3960

accctcacca acctcggcgc cccggccgcc ttcaagtact tcgacaccac catcgaccgc 4020

aagcgctaca cctccaccaa ggaggtgctc gacgccaccc tcatccacca gtccatcacc 4080

ggcctctacg agacccgcat cgacctctcc cagctcggcg gcgacccgaa gaagcgccgc 4140

cgcgtgtga 4149

<210> 8

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 8

cagcacaggt taagtctg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 9

gtctgtctca acggtaag 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 10

tgctatgtac gtcgccatcc ag 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 11

aatgagtaac cacgctccgt ca 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 12

tcacgcaacg gcgctacaaa tagc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Sequence Listing)

<400> 13

gtttgtgtgt gcttacagcc atgg 24

Claims

1.创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括修饰水稻中的OsWaxy基因，使其转录活性增强，任选地，所述修饰通过基因编辑进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述OsWaxy基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列，任选地，所述水稻为籼稻或粳稻。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、TALEN、大范围核酸酶和ZFN，优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9进行，任选地，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，任选地，所述CRISPR/Cas9包含第一导向RNA(sgRNA)和第二sgRNA，其中所述第一和第二sgRNA均靶向OsWaxy基因的第一内含子，任选地，所述第一sgRNA靶向SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并且所述第二sgRNA靶向SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，任选地，所述第一sgRNA包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述修饰导致OsWaxy基因的第一内含子发生缺失、插入、取代或以上的组合，任选地，所述修饰导致OsWaxy基因的第一内含子部分或完全缺失。

5.通过权利要求1-4中任一项所述的方法创制的水稻用于育种的用途。

6.通过权利要求1-4中任一项所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。

7.由权利要求1-4中任一项的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。

8.能够靶向水稻OsWaxy基因的sgRNA，其包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或由SEQID NO:5所示的核苷酸序列组成，或者其包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或由SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列组成。

9.能够靶向水稻OsWaxy基因的CRISPR/Cas9编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒、表达第一sgRNA的第二表达盒和表达第二sgRNA的第三表达盒，其中所述Cas9包含SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，所述第一sgRNA包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列，并且所述第二sgRNA包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

10.创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括将权利要求9所述的CRISPR/Cas9编辑载体导入含有OsWaxy基因的水稻中，任选地，所述OsWaxy基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列，任选地，所述水稻为籼稻或粳稻。