CN112979793A - 检测新型冠状病毒的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测新型冠状病毒的抗体，该抗体具有SEQ ID NO.4所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区。本发明的抗体可用于ELISA法有效检测血清中含有的新型冠状病毒。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及检测新型冠状病毒的抗体。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将 感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒 能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感 染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防 控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相 似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的 棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感 染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可 作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要 的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采 样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感 染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断 是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随 着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评 价的的重要手段。
发明内容
本发明提供了一种检测新型冠状病毒的抗体，其与新型冠状病毒NP蛋白特 异性结合，其包含的抗原互补决定区1-3(CDR1-3)的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1所示的重链CDR1；
SEQ ID NO.2所示的重链CDR2；
SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；
SEQ ID NO.5所示的轻链CDR1；
SEQ ID NO.6所示的轻链CDR2；
SEQ ID NO.7所示的轻链CDR3。
在本发明的具体实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO.4所示的重链可变 区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区。
本发明所用“抗体”一词不仅包括全长抗体，还包括全长抗体的部分片段， 如抗原结合片段。
本发明提供了一种核酸，其编码前面所述的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的具体实施方案中，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.17 所示，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明提供了一种载体，其包含前面所述的核酸。
本发明提供了一种细胞，其导入前面所述的载体。
本发明提供了一种用于产生检测新型冠状病毒的抗体的方法，其包括在适合 于宿主细胞产生抗体的条件下，培养前面所述的细胞。
本发明提供了一种抗体衍生物，其包含前面所述的抗体、诊断剂。
可用于本发明的所述诊断剂包括：放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光 剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶和光敏诊断剂。
放射性核素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、 86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32F、 11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr 或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。
顺磁性离子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜 (II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III) 和铒(III)。
荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻 蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
化学发光标记化合物包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和 草酸酯。
生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
本发明提供了一种检测新型冠状病毒的产品，其含有前面所述的抗体。
进一步，所述产品还包含第二种抗体，所述第二种抗体包含重链CDR1、重 链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3；其中，
重链CDR1含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
重链CDR2含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
重链CDR3含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
轻链CDR1含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
轻链CDR2含有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
轻链CDR3含有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
优选地，所述第二种抗体包含重链可变区、轻链可变区；其中，重链可变区 含有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的 氨基酸序列。
进一步，所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、 发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的 产品。
免疫标记技术(immunolabelling techniques)是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂作为示踪物，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应，借助于荧光显微镜、酶标检测仪等仪器，对实验结果直接镜检 观察或进行自动化测定，可在细胞、亚细胞以及分子水平上，对抗原抗体反应进 行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、 抗原或抗体进行定性定量测定。
根据标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术可分为酶免疫的技术(以 酶联免疫吸附试验为常用)、免疫荧光技术、放射免疫技术、发光免疫测定技术 等。
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是将抗原 抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合而发展起来的一种免疫标记技术， 既可用于组织、细胞内抗原的检测，又可用于体液中抗原抗体的检测。根据检测 方法的不同，可将酶联法分为双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法和其他 ELISA。
间接法是检测抗体最常用的方法，将已知抗原吸附于固相载体，加待检血清 (抗体)形成抗原抗体复合物，经孵育、洗涤后，加酶标抗体使之与抗原抗体复 合物结合，经显色后用酶标仪测定OD值，从而间接测定相应抗体含量。
竞争法既可用于抗原半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以抗原竞争法 为例，将已知抗体吸附于固相载体，加一定量已知酶标抗原及待测抗原，使两者 竞争与固相抗体结合，经洗涤，最后结合于固相抗体上的酶标抗原与待测抗原含 量呈负相关。
免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC) 与相应抗体(或抗原)以化学的方法结合，将荧光标记抗体(或抗原)与标本中 相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。
间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光 标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的存在。间 接荧光技术可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体测出未知抗原。
本发明提供了前面所述的抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用；
本发明提供了前面所述的抗体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用；
本发明提供了前面所述的抗体衍生物在制备检测新型冠状病毒的产品中的 应用。
本发明中“抗体”这一用语能够与“免疫球蛋白”互换。
本发明中“全长抗体”是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因 片段重组过程所形成)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)。
术语“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)在用于本文时指一个或多 个保留了与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以 由全长抗体的片段行使。术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括 (i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段， 包含通过铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和 CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片 段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补 决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码， 但是可以使用重组方法通过合成的接头将它们连接，从而使它们能够制备成单个 蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如 Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意图涵盖在术语 “抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用本领域技术人员公知的常规技术获得， 可以以与完整抗体相同的方式对片段筛选功用。
可通过已知技术来产生识别特定表位的抗原结合片段。如可通过胃蛋白酶消 化抗体分子产生F(ab')2片段，以及可通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生Fab' 片段。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许 快速和容易鉴定具有所需特异性的单克隆Fab'片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL结构域和VH结构域 缔合以形成靶标结合位点。这两个结构域由肽接头(L)进一步共价连接。用于制 备scFv分子以及设计适合肽接头的方法公开于美国专利号4,704,692；美国专 利号4,946,778；R.Raag和M.Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB第9 卷:73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH,第9卷:132-137(1991)中。
可通过已知方法制备抗体片段，例如如由Goldenberg,美国专利号4,036,945 和4,331,647以及其中含有的参考文献所公开。此外，参见Nisonoff等， ArchBiochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959)；Edelman等，METHODSIN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)；以及Coligan，第2.8.1-2.8.10以及2.10.-2.10.4页。
对于本发明的抗体的类型(同种型)没有特别限定。例如可以为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等的任意类型。另外，对于本发明的抗体的亚型也没有特别限定，例 如，只要为IgG，可以为IgG1、IgG2、IgG3等的任意亚型。
此外，作为本发明的抗体中的“功能性同等”的CDR的氨基酸序列的例子， 可以列举在原始的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1或数个、优选1～5个、 更优选1～3个、更加优选1个氨基酸且具有作为CDR的同等功能的氨基酸序列。 作为另一个例子，可以列举与上述原始的氨基酸序列的同源性为80％以上、优选 为90％以上、更优选为95％以上且具有作为CDR的同等功能的氨基酸序列。
本发明的核酸是编码本发明的抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的 核酸。
本发明的载体是包含本发明的核酸的载体。作为载体的种类没有特别限定， 根据之后导入的宿主细胞的种类等适当选择即可。
本发明的细胞是导入有本发明的载体的细胞。作为细胞的种类，只要是所导 入的载体发挥功能的细胞就没有特别限定。作为例子，可以列举动物细胞(COS 细胞、CHO细胞等)、酵母、细菌(大肠杆菌等)、植物细胞、昆虫细胞等。
本发明的抗体能够使用基因重组的方法生产。
首先，制备编码前面所述的抗体的DNA，但也可以为其他碱基序列。DNA 的制备能够使用PCR等公知的方法进行。也能够利用化学合成制备该DNA。
将编码所得到的VH或VL的DNA分别插入具有编码抗体的CH或CL的序 列的载体，构建抗体表达载体。其中，具有编码抗体的CH或CL的序列的载体 能够从市场获得。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，得到表达抗体的重组细 胞。然后，培养该重组细胞，从该培养物获得所期望的抗体。
作为本发明的抗体的纯化方法没有特别限定，能够采用公知的方法。例如， 能够回收上述重组细胞的培养上清，组合各种色谱、盐析、透析、膜分离等公知 的方法，纯化本发明的抗体。在抗体的同种型为IgG的情况下，也能够利用使用 了蛋白A的亲和色谱简便地进行纯化。
术语“Ka”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的结合速率(association rate)，术语“Kd”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的 解离速率(dissociation rate)。术语“KD”在用于本文时意图指解离常数，其由Kd 与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以使用本 领域公知的方法测定。一种优选的测定抗体KD的方法使用表面等离振子共振 (surface plasmon resonance)，更优选使用生物传感器系统，例如系统。
在用于本文时，术语IgG抗体的“高亲和力”指抗体对靶抗原具有10-8M或 更小，更优选10-9M或更小，甚至更优选10-10M或更小的KD。但是，“高亲和 力”结合对于其它抗体同种型可能有所不同。例如，IgM同种型的“高亲和力” 结合指抗体具有10-7M或更小，更优选10-8M或更小，甚至更优选10-9M或更 小的KD。
评估抗体对抗原的结合能力的标准测定法是本领域公知的，包括例如 ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本 领域已知的标准测定法来评估，诸如通过Biacore分析。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例 是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简 单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成 和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感 受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自 New England Biolabs(NEB)公司；EX Taq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc 抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者 血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为： Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增 NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃80s，共30 个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ 和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单 菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3 NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导 6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然 后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性 至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上 100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280 rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa， 发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计 蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显 的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150 mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的 位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较 高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导 后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，采集5位COVID-19确诊患者 出院前外周血各20ml。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离 20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公 司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche， Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 1 |
| EX Buffer(10x) | 5 |
| dNTPs(10mM each) | 4 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.3 |
| dH<sub>2</sub>O | 35.7 |
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 2 |
| EX Buffer(10x) | 10 |
| dNTPs(10mM each) | 8 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.6 |
| dH<sub>2</sub>O | 75.4 |
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H 载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT 培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小 时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％ NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用 1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3 管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃ 摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min， 然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜 XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶， 230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml) 中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积 的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重 悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA 检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃ 包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST 洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源 的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获 得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验 证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS05抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.17 所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.18 所示。
JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链可变区的氨基酸序列 如SEQID NO.16所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中 表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到 1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次， 加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB 显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为 0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
由此判断16株 抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗 体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000) 孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并 在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使 用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM 醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min 流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、 420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃ 时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH 2.0的甘氨酸-盐酸再生 CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用BiacoreT200 Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2NP蛋白，亲 和活性相关参数见表4。
表4抗体亲和力参数
| 抗体名称 | 配体偶联量 | ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| JS01 | 102RU | 2.18E+06 | 4.79E-04 | 2.20E-10 |
| JS02 | 162RU | 9.12E+05 | 5.83E-05 | 6.39E-11 |
| JS03 | 102RU | 8.97E+05 | 2.12E-04 | 2.36E-10 |
| JS04 | 162RU | 7.15E+04 | 1.91E-04 | 2.67E-09 |
| JS05 | 162RU | 5.94E+05 | 2.43E-04 | 4.09E-10 |
| JS06 | 136RU | 1.61E+05 | 0.002576 | 1.61E-08 |
| JS07 | 110RU | 1.44E+06 | 1.78E-04 | 1.24E-10 |
| JS08 | 162RU | 3.03E+04 | 5.77E-06 | 1.90E-10 |
| JS09 | 129RU | 6.89E+05 | 4.79E-05 | 6.94E-11 |
| JS10 | 136RU | 1.47E+06 | 2.99E-04 | 2.04E-10 |
| JS11 | 110RU | 1.93E+05 | 5.62E-05 | 2.92E-10 |
| JS12 | 110RU | 4.88E+05 | 7.33E-05 | 1.50E-10 |
| JS13 | 110RU | 8.05E+05 | 9.66E-05 | 1.20E-10 |
| JS14 | 136RU | 1.24E+06 | 2.21E-04 | 1.78E-10 |
| JS15 | 110RU | 7.72E+04 | 1.22E-04 | 1.58E-09 |
| JS16 | 136RU | 2.68E+05 | 4.01E-05 | 1.50E-10 |
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个 稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST 洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/ 孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。 因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为 酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被 过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释 度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他 13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最 好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线 处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微 球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处， 与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线 处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。 用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T 线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠 状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当 理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领 域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出 多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 检测新型冠状病毒的抗体
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Pro Thr Gly Trp Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Pro Thr Gly Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Val Ser Asn Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ser Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln His Arg Ser Asn Trp Lys Ile Thr
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg Ser Asn Trp Lys Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Asn Ser
1
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt catcttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatttg 300
agaggaccta cgggatggac ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 18
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagaatgtgc tcacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtacca acagagacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat tcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cggtttatta ctgtcagcac cgtagcaact ggaagatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
Claims (9)
1.一种检测新型冠状病毒的抗体，其与新型冠状病毒NP蛋白特异性结合，其包含的抗原互补决定区1-3的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1所示的重链CDR1；
SEQ ID NO.2所示的重链CDR2；
SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；
SEQ ID NO.5所示的轻链CDR1；
SEQ ID NO.6所示的轻链CDR2；
SEQ ID NO.7所示的轻链CDR3。
优选地，所述抗体包含SEQ ID NO.4所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包括全长抗体、或全长抗体的抗原结合片段。
3.一种核酸，其编码权利要求2所述的重链可变区和轻链可变区；优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.18所示。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的核酸。
5.一种细胞，其导入权利要求4所述的载体。
6.用于产生检测新型冠状病毒的抗体的方法，其包括在适合于宿主细胞产生抗体的条件下，培养权利要求5所述的细胞。
7.一种抗体衍生物，其包含权利要求1或2所述的抗体、诊断剂；优选地，所述诊断剂包括：放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶和光敏诊断剂。
8.一种检测新型冠状病毒的产品，其含有权利要求1或2所述的抗体；优选地，所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品；更优选地，所述产品还包含第二种抗体，所述第二种抗体包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3；其中，
重链CDR1含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
重链CDR2含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
重链CDR3含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
轻链CDR1含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
轻链CDR2含有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
轻链CDR3含有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
最优选地，所述第二种抗体包含重链可变区、轻链可变区；其中，重链可变区含有SEQID NO.12所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
9.一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
(1)权利要求1或2所述的抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用；
(2)权利要求1或2所述的抗体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用；
(3)权利要求7所述的抗体衍生物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
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