CN112972447A - CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用 - Google Patents

CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过模拟两种与临床紧密相关的急性胰腺炎疾病模型：①雨蛙素腹腔注射诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎；②胆管结扎诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎。实验证明CaMK II参与调控雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎并与疾病严重程度呈正相关，而应用CaMK II抑制剂KN93能明显改善上述两种模型诱导的小鼠急性胰腺炎的疾病进展过程，此外，KN93可显著延长胆管结扎诱导的急性胰腺炎小鼠的存活率，因此有望用于治疗急性胰腺炎的药物开发研究中。

Description

CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
背景技术
急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是一类由酶原显著活化而引起胰腺自我消化的非感染性炎症性疾病，在临床上起病迅速，主要表现为急性或持续性腹痛(偶无腹痛)，血清淀粉酶活性显著增高，需住院治疗的消化系统疾病之一(Lankisch PG,Apte M,BanksPA.Acute pancreatitis.Lancet.2015Jul 4；386(9988):85-96.)。美国AP的年发病率大约在13-45例/10万，是住院死亡的第五大常见原因(Hao L,Li ZS,Hu LH.National Trendsin Acute and Chronic Pancreatitis Needs to Be Improved.Gastroenterology.2018Jan:156(1):287.IF＝19.233)。而在中国，第一阶段病例研究发现，AP起病急，变化快，且发病率呈现逐年上升趋势。临床数据提示：轻症急性胰腺炎(Mild acute pancreatitis，MAP)占AP的多数，通常在住院治疗后1-2周内可恢复，病死率低。另外约15％-20％AP患者的炎症反应不仅仅局限于胰腺本身，可能累及胰腺周围组织或远端脏器(肺脏，肾脏等)，进展为重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)，SAP临床早期病死率高，如后期合并炎症感染，进展为全身炎症反应综合征，则病死率高达40％-70％(Faghih M,Fan C,SinghVK.New Advances in the Treatment of Acute Pancreatitis.Curr Treat OptionsGastroenterol.2019Jan 30.)。
AP是一种胰腺外分泌急性炎症性疾病，腺泡细胞损伤/死亡是AP发生的始动因素，临床病因较为复杂，过量饮酒，胆结石症，高脂血症，十二指肠返流等都可能首先影响腺泡细胞，引起酶原过度激活，诱导AP的发生发展。腺泡细胞的死亡方式决定AP严重程度和预后。动物实验表明，抑制腺泡细胞死亡可减轻AP炎症反应，改善AP疾病进展(LuG,TongZ,DingY,LiuJ,PanY,GaoL,TuJ,WangY,LiuG,LiW.Aspirin Protects against Acinar CellsNecrosis in Severe Acute Pancreatitis in Mice.Biomed Res Int.2016；2016:6089430.)。因此，如何针对腺泡细胞早期损伤/死亡，寻找早期预防，早期治疗的药物是临床改善AP的关键。
研究发现，钙调素依赖型蛋白激酶(CaMK II)的活化与细胞损伤/死亡密切相关，参与再灌注损伤，心肌梗死，少突胶质细胞死亡等病理生理过程的发生发展(Qu Y,Tang J,Wang H,Li S,Zhao F,Zhang L,Richard Lu Q,Mu D.RIPK3interactions with MLKL andCaMKII mediate oligodendrocytes death in the developing brain.Cell DeathDis.2017Feb 23；8(2):e2629.)。Zhang等发现CaMKII活化可加剧缺血再灌注或阿霉素处理诱导的心肌细胞坏死及后续的恶性心脏重构和心力衰竭，而抑制CaMK II可以改善上述病理过程(Zhang T,Zhang Y,Cui M,Jin L,Wang Y,Lv F,Liu Y,Zheng W,Shang H,Zhang J,Zhang M,Wu H,Guo J,Zhang X,Hu X,Cao CM,Xiao RP.CaMKII is a RIP3 substratemediating ischemia-and oxidative stress-induced myocardial necroptosis.NatMed.2016Feb；22(2):175-82.)。
通常情况下，CaMK II是一类多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在人体广泛分布。CaMK II具有调节钙稳态、细胞分泌、学习记忆、膜兴奋性等多种生物学效应(Zalcman G,Federman N,Romano A.CaMKII Isoforms in Learning and Memory:Localization andFunction.Front Mol Neurosci.2018Dec 4；11:445)。尽管CaMK II具有重要的生理功能，但持续的CaMK II激活可导致细胞损伤和器官功能障碍。研究发现CaMK II持续激活可导致心力衰竭和心律失常，是心源性猝死的主要原因(Feng N,Anderson ME.CaMKII is anodal signal for multiple programmed cell death pathways in heart.J Mol CellCardiol.2017Feb；103:102-109)。CaMK II的激活主要由磷酸化调控的，研究发现CaMK II活化参与调控再灌注损伤、心肌梗死、少突胶质细胞死亡等病理生理过程的发生发展(YangZ,Li C,Wang Y,Yang J,Yin Y,Liu M,Shi Z,Mu N,Yu L,Ma H.Melatonin attenuateschronic pain related myocardial ischemic susceptibility through inhibitingRIP3-MLKL/CaMKII dependent necroptosis.J Mol Cell Cardiol.2018Dec；125:185-194)(Qu Y,Tang J,Wang H,Li S,Zhao F,Zhang L,Richard Lu Q,Mu D.RIPK3interactions with MLKL and CaMKII mediate oligodendrocytes death in thedeveloping brain.Cell Death Dis.2017Feb 23；8(2):e2629.)(Zhang T,Zhang Y,CuiM,Jin L,Wang Y,Lv F,Liu Y,Zheng W,Shang H,Zhang J,Zhang M,Wu H,Guo J,Zhang X,Hu X,Cao CM,Xiao RP.CaMKII is a RIP3 substrate mediating ischemia-andoxidative stress-induced myocardial necroptosis.Nat Med.2016Feb；22(2):175-82)。
但是，CaMK II在AP中的功能尚不可知，目前也尚未有任何现有技术报道CaMK II抑制剂在急性胰腺炎中相关预防及治疗作用，因此如果能够找出有效的、可逆的和竞争性的CaMK II抑制剂将对AP相关预防和治疗起到积极的推动作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
优选地，所述的CaMK II抑制剂为KN93。
优选地，所述的药物为通过抑制CaMK II活性和表达而预防和/或治疗急性胰腺炎的药物。
优选地，所述的药物为减少胰腺组织炎症细胞浸润的药物，所述炎症细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞或NK细胞。
优选地，所述的药物为抑制血清/血浆及胰腺组织中炎症因子表达水平的药物，所述炎症因子包括MCP-1、IL-1β、IL6或TNF-α。
优选地，所述的药物为抑制ROS生成和氧化应激的药物。
优选地，所述的药物为抑制腺泡细胞损伤或死亡的药物。
本发明还公开了一种产品，其活性成分为KN93，所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：
a)改善急性胰腺炎的炎症反应；
b)抑制急性胰腺炎的疾病发生/发展；
所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。
本发明还公开了一种用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，所述药物是由活性成分KN93和药学上可添加的辅料组成。
优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。
优选地，所述药物能够通过口服、注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了CaMK II抑制剂KN93在制备抑制急性胰腺炎的药物中的应用。本发明通过模拟两种与临床相关的体内急性胰腺炎模型：①雨蛙素腹腔注射诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎；②胆管结扎诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎。实验证明，将CaMK II抑制剂KN93腹腔注射小鼠体内，能显著改善上述两种AP模型的发生发展。同时，本发明采用的体外急性胰腺炎模型为：胆囊收缩素(CCK)孵育266-6细胞株(小鼠胰腺癌腺泡细胞来源，ATCC细胞库)或者小鼠原代腺泡细胞引起细胞损伤，使用CaMK II抑制剂KN93孵育可明显抑制细胞ROS生成，减轻腺泡细胞死亡(PI或LDH释放)，从而抑制急性胰腺炎的发生发展。因此，本发明首次提出CaMK II抑制剂KN93能够应用于临床预防/治疗AP的药物研发制备。
本发明提供的抑制急性胰腺炎的药物安全低度，药理作用较强，疗效明确。本发明为预防，诊断，检测，保护，治疗和研究腹主动脉瘤疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用临床，能够在较短时间内产生巨大的临床应用前景和社会效益。
附图说明
图1为CaMK II在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎中的活化情况研究结果；其中，(a)为雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠病理结果图；(b)为p-CaMK II免疫组化染色结果；
图2为雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺组织p-CaMK II表达情况及其统计结果；其中，(a)p-CaMK II和CaMK II蛋白表达情况；(b)和(c)p-CaMK II和CaMK II蛋白统计情况；
图3为KN93可减轻雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎严重程度实验结果；其中，(a)为小鼠胰腺组织HE染色结果；(b)为胰腺组织水肿程度病理评分结果(c)为胰腺组织炎症渗出情况病理评分结果(d)为胰腺组织腺泡细胞坏死程度病理评分结果(e)为胰腺组织损伤情况病理评分。
图4为KN93可减轻雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎的血清淀粉酶和脂肪酶水平；其中，(a)为血清淀粉酶水平变化；(b)为血清脂肪酶水平变化；
图5为KN93可减轻雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎的炎症因子水平；其中，(a)为TNF-α炎症因子水平；(b)为IL-1β炎症因子水平；(c)为IL-6炎症因子水平；(d)为MCP-1炎症因子水平；
图6为KN93可减轻胆管结扎(PDL)诱导的小鼠急性胰腺炎严重程度实验结果；其中，(a)为KN93可以减轻胰腺组织水肿，炎症渗出和腺泡细胞坏死情况；(b)为病理图统计情况；(c)为KN93可改善血清淀粉酶和脂肪酶水平结果；
图7为KN93可延长胆管结扎诱导的急性胰腺炎小鼠的存活率；
图8为KN93可以改善胆囊收缩素(CCK)诱导的胰腺腺泡细胞损伤情况，并降低坏死相关蛋白(p-MLKL和RIP3)的表达；其中，(a)为KN93可减轻胰腺腺泡细胞死亡率；(b)为KN93可减轻胰腺腺泡细胞死亡率ROS生成水平；(c)为PI和ROS统计情况；(d)p-MLKL和RIP3蛋白表达情况，MLKL和GAPDH为参照蛋白；(e)为p-MLKL和RIP3蛋白统计情况。
图9为KN93对小鼠本身无毒副作用；其中，(a)为对照组小鼠和高(20mg/kg)剂量KN93小鼠胰腺、心脏、肺、肝脏和肾脏病理情况；(b)为两组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明实施例所用到的实验方法，如没有特殊说明，均为常规方法。实施例中所应用的试剂材料均可常规购买，实施例中涉及的定量实验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。
所用C57/BL6小鼠购买自南京模式大学动物中心。
所用雨蛙素(Caerulein)购买自MCE公司，货号为HY-A0190。
所用胆囊收缩素(CCK)购买自sigma-aldrich公司，货号为T6515。
所用KN93购买自MCE公司，货号为HY-15465；KN93的分子式为C26H29ClN2O4S，CAS号:139298-40-1，结构式如下：
Figure BDA0002958471510000071
实施例1:CaMK II在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎中的活化情况研究
雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型
实验动物：6-8周雄性C57BL/6J小鼠(体重平均25g)。
将实验动物分为正常对照组和不同时间(6h,12h,24h)模型组。模型组小鼠腹腔注射雨蛙素(100ug/kg，间隔1h，连续7针)构建急性胰腺炎模型。对照组小鼠给予严格PBS对照腹腔注射。留取小鼠血清进行血清酶学水平和炎症因子水平检测。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片和免疫组化染色，结果参见图1，在雨蛙素诱导的急性胰腺炎中，胰腺组织水肿，炎症渗出，腺泡细胞坏死是反应疾病严重程度的重要指标。如图1中(a)所示，用HE染色观察到从小鼠疾病模型6H开始胰腺损伤较为明显，到12H达到损伤高峰。p-CaMK II为抗p-CaMK II的特异性抗体进行免疫组化染色的结果，如图1中(b)显示p-CaMK II在坏死的腺泡细胞上持续高表达，并与急性胰腺炎疾病严重程度呈正相关。参见图2，磷酸化的CaMK II代表的是CaMK II的活化状态，调控急性胰腺炎的发生发展。如图2中(a)所示p-CaMK II在疾病6H表达显著升高且持续高表达至24H，CaMK II在疾病6H表达下降且12H，24H表达持续下降。如图2中(b)和(c)所示，为p-CaMK II和CaMK II蛋白统计情况，GAPDH为参照蛋白。结果表明，AP小鼠相较于对照组小鼠，胰腺组织水肿明显，炎症浸润增加，腺泡细胞坏死增多，血清酶学和炎症因子水平显著上调，CaMK II磷酸化水平呈持续性显著上调并与疾病严重程度呈正相关。
实施例2:KN93在预防/治疗急性胰腺炎中的应用
一、雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型
根据实施例1实际操作和模型诱导情况，选取12h雨蛙素诱导模型作为后续研究。造模方式同实施例1。
二、KN93腹腔注射
将KN93药物溶于10％DMSO+PBS缓冲液中。模型组小鼠随机分为AP组，低剂量(5mg/kg)KN93治疗组，中剂量(10mg/kg)KN93治疗组，高剂量(20mg/kg)KN93治疗组(每组7只)，于雨蛙素造模前0h腹腔注射KN93(含10％DMSO溶媒)，AP组腹腔仅注射含10％DMSO的溶媒缓冲液。所有小鼠于腹腔注射第一针雨蛙素后12h进行腹腔注射5％水合氯醛麻醉，留取小鼠血清进行血清酶学水平和炎症因子水平检测。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片和免疫组化染色。
结果如图3和图4所示，可以看出，中(10mg/kg)剂量的KN93可以改善胰腺组织损伤情况(水肿，炎症渗出和腺泡细胞坏死)，高(20mg/kg)剂量的KN93能进一步改善急性胰腺炎疾病情况。提示：KN93可呈计量梯度性的改善雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎疾病严重程度。KN93能显著保护急性胰腺炎胰腺组织病理结果，改善血清酶学和血清淀粉酶水平。此外，血清炎症因子水平同样能反应急性胰腺炎炎症水平和疾病损伤情况。如结果图4所示，高(20mg/kg)剂量的KN93可显著降低血清炎症因子水平(TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1)。
在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎体内实验中，观察到AP小鼠腺泡细胞CaMK II磷酸化水平持续性显著增加且与疾病进展呈现正相关，上述结果提示如果抑制CaMK II的激活，就可能改善或治疗急性胰腺炎的发生发展。
实施例3:KN93在预防/治疗急性胰腺炎中的应用
一、胆管结扎诱导的小鼠急性胰腺炎模型
实验动物：6-8周雄性小鼠(体重平均为25g)
将实验动物分为模型组和假手术组(每组10只)
1、实验动物腹腔注射5％水合氯醛麻醉(按照体重注射，8ul/g)。
2、所有实验动物麻醉后，固定在手术操作台上。模型组开腹后，应用手术镊钝性分离胆总管，于胆总管下端近胰腺处应用#4丝线进行结扎，逐层关闭腹腔并缝合皮肤。假手术组仅进行开腹关腹相关操作，不进行胆管结扎手术。所有小鼠进行手术操作后于37摄氏度恒温操作台恢复30min。
二、KN93腹腔注射
将模型组小鼠随机分为溶媒组和KN93组(每组12只)，KN93组于0h腹腔注射高剂量KN93(20mg/kg)，溶媒组小鼠和假手术小鼠均腹腔注射含10％DMSO PBS溶液。所有小鼠于造模开始后24h,48h留取血清，48h进行腹腔注射5％水合氯醛麻醉，留取胰腺组织制作HE染色的石蜡切片。
结果如图6中(a)和(b)所示，高(20mg/kg)剂量的KN93可显著改善PDL小鼠胰腺组织损伤情况(胰腺组织水肿、炎症渗出，腺泡细胞坏死)，此外，如图6中(c)所示，KN93可下降约50％的血清淀粉酶和脂肪酶，说明KN93能显著保护急性胰腺炎胰腺组织病理结果，改善血清酶学和血清淀粉酶水平。
实施例4:KN93可延长胆管结扎诱导的急性胰腺炎小鼠的存活率。
死亡率的降低是在急性胰腺炎研究中探索药物保护作用的关键指标。我们在实验案例3的基础上，进一步观察了KN93对胆管结扎小鼠的远期存活率的作用情况。如图7所示，用PDL建立小鼠SAP模型，伴有大量胰腺坏死(图6)和显著的死亡率。KN93治疗后急性胰腺炎小鼠死亡率明显下降(P＝0.0382)。
实施例5:KN93抑制胆囊收缩素(CCK)诱导的腺泡细胞的损伤
一、KN93抑制急性胰腺炎腺泡细胞死亡和ROS生成
将266-6小鼠腺泡细胞株(购买自ATCC库)接种于25cm2细胞培养瓶中，使用DMEM培养基(含10％FBS,100U/ML青霉素和100ug/ml链霉素)，37摄氏度，5％CO2温箱中稳定培养传代。取对数生长期内状态良好的细胞接种到24孔板，更换新的DMEM培养基，培养12h，进行如下分组处理：
对照组：培养24小时；
CCK组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)培养24小时；
CCK组+KN93低中高浓度组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和0.5，1，2uM KN93培养24小时。
收集各组细胞，进行DHE染色和PI染色，检测腺泡细胞ROS生成和损伤情况。
二、KN93抑制急性胰腺炎腺泡细胞坏死
细胞稳定培养传代同步骤一。取对数生长期内状态良好的细胞接种到6孔板，更换新的DMEM培养基，培养12h，进行如下分组处理：
对照组：培养24小时；
CCK组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)培养24小时；
CCK组+KN93低中高浓度组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和0.5，1，2uM KN93培养24小时。
收集各组细胞，提取细胞蛋白，检测细胞坏死相关通路蛋白表达情况(RIP3,p-MLKL)，采用MLKL和GAPDH作为内参蛋白。
结果如图8所示，与对照组相比，CCK组腺泡细胞死亡率(PI)和氧化应激ROS生成水平显著增加，腺泡细胞坏死相关通路蛋白表达(RIP3，p-MLKL)显著上调，而应用KN93可显著抑制上述相关现象，保护急性胰腺炎腺泡细胞死亡并下调腺泡细胞坏死相关通路蛋白。
实施例6：KN93对小鼠本身无毒副作用
结果参见图9，如病理HE染色图所示，与对照组相比，腹腔注射高剂量的KN93对胰腺、心脏、肺、肝脏和肾脏病理情况没有差异。此外，两组血清淀粉酶和脂肪酶水平也没有统计学意义。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CaMK II抑制剂为KN93。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过抑制CaMK II活性和表达而预防和/或治疗急性胰腺炎的药物。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为减少胰腺组织炎症细胞浸润的药物，所述炎症细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞或NK细胞。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制血清/血浆及胰腺组织中炎症因子表达水平的药物，所述炎症因子包括MCP-1、IL-1β、IL6或TNF-α。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制ROS生成和氧化应激的药物。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制腺泡细胞损伤或死亡的药物。
8.一种产品，其特征在于，其活性成分为KN93，所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：
a)改善急性胰腺炎的炎症反应；
b)抑制急性胰腺炎的疾病发生/发展；
所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。
9.一种用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物是由活性成分KN93和药学上可添加的辅料组成。
10.如权利要求9所述的用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种；
所述药物能够通过口服、注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
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