CN112956413A - 一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法，包括以下步骤：1.配子体预发育，2.配子体破碎，3.配子体泼池，4.苗种培育管理。本发明将裙带菜配子体育苗生产中泼池前的雌雄配子体小段，经过预发育和破碎后再泼池附帘，使裙带菜配子体和幼孢子体在与苗种帘上底栖硅藻的竞争中占据优势，从而防治裙带菜配子体育苗生产中底栖硅藻污染。本发明技术防治底栖硅藻效果好，方便适用，而且还可缩短幼苗在育苗池中的培育时间，节约生产成本。

Description

一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法
技术领域
本发明涉及裙带菜苗种生产技术领域，具体涉及一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法。
背景技术
裙带菜是是我国三大经济海藻之一。目前裙带菜苗种生产常规工艺的基本过程是：种藻蓄养、种藻释放游孢子，游孢子粘附到苗种帘上发育成胚孢子，继而发育成配子体，配子体释放雌雄生殖细胞，受精形成幼孢子体，长成裙带菜幼苗，出库。这一生产工艺中，由于游孢子在苗种帘上粘附很牢固，所以可利用冲洗苗种帘的方法防治苗种帘上底栖硅藻污染，底栖硅藻对配子体和幼孢子体的影响较小。但常规工艺育苗存在周期长、成本高、种质容易退化、受季节限制等缺点。
而裙带菜配子体育苗技术可直接从配子体开始，将种质库中保藏的裙带菜配子体扩增，之后通过短光照弱光培养使配子体由生长状态转换到发育状态，然后破碎成配子体小段，泼洒到育苗池水面，沉降到苗种帘上发育，经过生殖细胞释放、受精过程，发育成裙带菜幼苗。配子体育苗缩短了育苗时间，降低了育苗成本，而且种质和品种性状特征稳定，采苗时间也不受种藻繁殖季节限制。所以配子体育苗技术具有很多的优势。
但裙带菜配子体育苗技术的应用目前仍然受到一定的限制，主要限制因素之一就是底栖硅藻污染的问题。由于配子体育苗中，破碎后的配子体小段通过沉降作用附着在苗种帘上，附着不牢固，受到扰动很容易脱落。所以配子体泼池后，在幼孢子体长出假根抓牢苗种帘之前的这段时间内，不可以通过常规的涮帘冲帘方法防治底栖硅藻污染。但在这段时间里底栖硅藻会在苗种帘上大量附着繁生，与裙带菜的配子体和幼孢子体竞争营养盐和生长空间，遮蔽甚至盖住配子体和幼孢子体，造成裙带菜苗受光不足和稀疏缺苗，影响苗种质量甚至导致配子体育苗失败。所以，裙带菜配子体育苗生产中急需防治底栖硅藻污染的有效方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法。本发明将裙带菜育苗生产中泼池前的雌雄配子体小段，经过预发育和破碎后再泼池附帘，使裙带菜配子体在与苗种帘上底栖硅藻的竞争中占据优势，从而防治裙带菜配子体育苗生产中底栖硅藻污染。该发明技术防治底栖硅藻效果好，方便适用，而且还可降低幼苗在育苗池中的培育时间，节约生产成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法，包括以下步骤：
(1)将泼池前已经破碎成1-6个细胞的雌雄混合配子体小段静置沉降；弃掉沉降后的配子体小段的上层液，将配子体小段接种到培养液中，并密封处理；向培养液中充气，保持配子体小段悬浮翻腾；光照处理培养液，使配子体小段预发育，直至配子体小段中70-90％雄配子体长出精荚，完成预发育得到预发育的配子体；
(2)将预发育的配子体滤出并破碎，在培育池注入砂滤海水，铺好空白苗种帘，投放营养盐，泼洒预发育后破碎的配子体，完成配子体泼池；
(3)配子体泼池后静水培育48-72h，然后用循环流水培育成幼孢子体；幼孢子体假根抓牢附着基后洗帘；镜检配子体或幼孢子体的生长、发育和健康情况，苗种规格达到0.5-1cm可出库。
优选的，步骤(1)中，所述培养液由以下方法制备：烧制海水，沸腾5分钟后，冷却至15-22℃，加入营养盐NaNO3和KH2PO4，使NaNO3的浓度为5-10mg/L，KH2PO4的浓度为1-2mg/L。
优选的，步骤(1)中，所述静置的温度为5-15℃，静置时间为12～24h。
优选的，步骤(1)中，培养液中接种的配子体小段以破碎前配子体湿重计，接种密度为10-20g/L，雌雄配子体的鲜重比为1:1。
优选的，步骤(1)中，所述光照处理的光照强度为3000-4000lx，光照周期L：D＝12h:12h(光照12h，黑暗12h)；预发育的温度为18-22℃。
优选的，步骤(2)中，所述破碎的温度≤20℃，破碎时间20-30s。
优选的，步骤(2)中，所述营养盐包括NaNO3和KH2PO4，使NaNO3浓度为3mg/L，KH2PO4浓度为0.6mg/L。
优选的，步骤(2)中，泼洒预发育后破碎的配子体，泼洒量为：按照预发育前未破碎的配子体鲜重计算，每40-60m苗种绳泼洒1g配子体，雌雄配子体的鲜重比为1:1；配子体泼池的池水温度≤22℃，光照强度≤3000lx。
优选的，步骤(3)中，所述循环流水的水流速度为5-10cm/s；日补水量为池水量的30-100％(体积比)，池水温度≤22℃，流水后光照强度为3000-10000lx；池水中添加NaNO31mg/L，KH2PO40.2mg/L。
优选的，步骤(3)中，所述洗帘的频率为每3d洗刷苗帘1次。
本发明的有益效果：
(1)本发明的配子体预发育技术可以防治裙带菜配子体育苗过程中的底栖硅藻污染和脱苗问题。
(2)本发明给出了一个完整的可操作的预发育技术方法：包括预发育结束点的判定标准；预发育过程中的充气翻腾操作和光照适宜条件等，提高预发育的效果及其在育苗生产中的应用效果。
(3)裙带菜配子体预发育后，配子体小段长大甚至长出枝杈，本发明进行了适当的破碎处理，有利于配子体的后续发育和避免幼苗脱苗。
(4)预发育使配子体泼池后，提前4-6d发育成幼孢子体，相应的，幼孢子体长出假根和假根在附着基上附牢的时间都提前，可有效降低裙带菜苗种的脱苗率。苗种达到出库规格的时间也可提前，节省能源成本和劳动力成本。
附图说明
图1为对比例培养得到的裙带菜幼孢子体(泼池12天)；
图2为实施例培养得到的裙带菜幼孢子体(泼池7天)；
图3为实施例和对比例培养得到的裙带菜苗种对比，a为使用实施例方法泼池28d时苗种，b为对比例泼池28d时苗种；
图4预发育后雄性配子体长出的精荚。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，裙带菜育苗池水中的底栖硅藻不可避免。育苗池中苗种帘上底栖硅藻与裙带菜幼苗处于竞争关系，底栖硅藻繁盛，裙带菜幼苗就会受到抑制，危害裙带菜配子体育苗生产。基于此，本发明的目的是提供一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法。
本发明在裙带菜配子体由生长状态转换到发育状态后、准备泼池之前，增加了一个预发育的过程，使裙带菜配子体小段在无底栖硅藻污染的灭菌海水中进行预发育，待达到特定发育程度后再次破碎成小段，然后再泼洒到育苗池，这样配子体在育苗池中比常规情况下提前4-6天发育成幼孢子体，此时育苗池中裙带菜苗种帘上的底栖硅藻还没有泛滥，裙带菜幼孢子体迅速生长，在与底栖硅藻的竞争中占据优势，抑制和控制住底栖硅藻，防治了底栖硅藻的危害。同时，在育苗池中幼孢子体长出假根和假根在附着基上附牢的时间都提前，可有效降低裙带菜苗种的脱苗率。相应的苗种达到出库规格的时间也可提前，节省能源成本和劳动力成本。
为了防止硅藻的产生和生长，发明人经过对裙带菜配子体育苗的长期研究，得出本发明的育苗方法：
(1)在裙带菜配子体育苗过程中增加了一个预发育的过程。在常规情况下，配子体在泼池前需要进行短光照弱光培育一段时间，使配子体由生长状态转换到发育状态，然后破碎成配子体小段，泼洒到育苗池发育。本发明在配子体由生长状态转换到发育状态后，不直接泼池发育，而是先在无底栖硅藻的灭菌海水中预发育到特定程度，破碎后，再泼洒到育苗池中继续发育，在与育苗池中底栖硅藻的竞争中占据优势，从而抑制底栖硅藻。
(2)创建一个完整的可操作的预发育技术方法。包括建立了预发育结束点的判定依据；同时也给出了预发育过程中的充气翻腾操作和光照适宜条件，保证预发育的效果。
本发明利用雄性配子体的精荚形成率作为控制预发育程度的时间节点。配子体发育成幼孢子体的过程包括雌雄配子体互相诱导发育，之后雄配子体形成精荚(图4)，释放精子，诱导雌配子体释放卵。本发明确定当雄配子体70-90％形成精荚时，结束预发育，进入配子体破碎和泼池程序。若雄配子体形成精荚比例超过90％，就会有较多精子释放，诱导卵囊形成并产生卵子。卵子在受精前与卵囊的连接很弱，在后续破碎过程中，卵子容易脱落而损失掉。如果继续延迟预发育时间，等到受精形成幼孢子体时再结束预发育，在后续破碎过程中幼孢子体就会受损害，并影响幼孢子体在苗种绳上的附着强度。若精荚形成率很低的时候结束预发育，预发育的程度不足，泼池后，裙带菜幼孢子体形成的时间就会推迟，对底栖硅藻的竞争优势就会减弱。综合平衡，雄配子体70-90％形成精荚时结束预发育效果为好。
预发育时，配子体在静水和在充气悬浮翻腾条件下都可以发育，但在静水中发育慢且不均匀。充气翻腾后，发育速度快且均匀。
预发育时，光照条件的设置，也会影响预发育的效果。若光照强度太低，配子体发育迟缓，若光照强度太高，配子体发育不同步，不同配子体的发育速度差异很大。在3000-4000lx光照条件下，配子体发育具有一致性，发育时间也在可接受范围内。
(3)在预发育完成后，对配子体进行了破碎，并给出破碎条件。
裙带菜配子体预发育后，配子体小段长大甚至长出枝杈，本发明进行了适当的破碎处理，有利于配子体的后续发育和避免幼苗脱苗。长大且长出枝杈的配子体如果不进行破碎，后续发育生长速度受限；最主要的，一个长出较多枝杈配子体小段后续会长出太多的幼孢子体，在苗种绳上成较大一族，附着不牢，容易脱苗。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例
生产裙带菜配子体苗种136帘(每帘苗种绳37m)。
1、配子体预发育。
1.1培养液准备：利用玻璃三角烧瓶在电陶炉烧制沸腾5分钟的灭菌海水10L。冷却至20℃，加入营养盐NaNO3和KH2PO4，配制成NaNO36mg/L，KH2PO41mg/L；
1.2配子体破碎、沉降：将120g裙带菜雌雄配子体丝状体(雌雄重量比例1：1)由生长状态转换到发育状态后，用350目筛绢过滤，加入低温灭菌海水，用破碎机在15℃以下破碎成1-6个细胞的配子体小段，在8℃下静置过夜；
1.3配子体预发育接种：次日，倒掉上清液后，将破碎的雌雄混合配子体小段接种到2个三角烧瓶中，每个烧瓶5L培养液。用保鲜膜给三角烧瓶封口。
1.4充气条件：在充气管头接40cm玻璃气管，透过三角烧瓶封口保鲜膜，玻璃管沉到三角烧瓶底部。用充气泵充气，保证三角烧瓶中配子体小段在三角烧瓶中翻腾。
1.5配子体预发育：在三角烧瓶上设置日光灯管，保证三角烧瓶水面处光照3000lx。光照处理12h，黑暗处理12h，温度22℃条件下预培养，取样在200倍显微镜观察，11天时，90％雄配子体长出精荚，停止预发育。
2、配子体破碎：将预发育的配子体用筛绢滤出，加入预冷灭菌海水，在不超过20℃条件下破碎30秒。等待泼池。
3、配子体泼池：选2个两端连通的呈平面并联式水泥培育池，单池规格10m×1.43m×0.4m，池内一端设搅拌机保持循环水流。每个育苗池2个长池壁内侧距池底20cm处，设置托架，用于托放成组的苗种帘。在培育池注入20℃砂滤海水，水深30cm。投放营养盐NaNO3和KH2PO4，配制成NaNO33mg/L，KH2PO40.6mg/L。将4个规格为68cm×34cm长方形苗种帘，水平并列绑缚到两根长1.4m的PVC圆管上，成为一组，放到池内托架上。每池放置17组苗种帘。泼洒预发育后的破碎的配子体，静水培育72h。白天光照不超过3000lx。
4、配子体苗种培育管理、出库：静水培育72h后，开启池子端头的搅拌机，以7cm/s流速流水，流水后每日投放营养盐NaNO3和KH2PO4，配制成NaNO31mg/L，KH2PO40.2mg/L。每日补水30-100％。水温不高于22℃。光照3000-10000Lx。7d后，裙带菜幼孢子体假根抓牢附着基，苗种绳上裙带菜幼孢子体整齐，底栖硅藻很少(图2)。每3d洗刷苗帘1次。泼池28d，苗种规格达到0.8cm，裙带菜幼苗整齐(图3a)。
对比例
常规培育裙带菜配子体苗种136帘(每帘苗种绳37m)。
1、配子体破碎：将120g裙带菜雌雄配子体丝状体(雌雄重量比例1：1)由生长状态转换到发育状态后，用350目筛绢过滤，加入低温灭菌海水，用破碎机在15℃以下破碎成1-6个细胞的配子体小段，不经过预发育过程，直接用于后续泼池。
2、配子体泼池：选2个两端连通的呈平面并联式水泥培育池，单池规格10m×1.43m×0.4m，池内一端设搅拌机保持循环水流。每个育苗池2个长池壁内侧距池底20cm处，设置托架，用于托放成组的苗种帘。在培育池注入20℃砂滤海水，水深30cm。投放营养盐NaNO3和KH2PO4，配制成NaNO33mg/L，KH2PO40.6mg/L。将4个规格为68cm×34cm长方形苗种帘，水平并列绑缚到两根长1.4m的PVC圆管上，成为一组，放到池内托架上。每池放置17组苗种帘(该操作与上述使用本专利方法的操作相同)。泼洒未经过预发育的破碎配子体。静水培育72h。白天光照不超过3000lx。
3、配子体苗种培育管理、出库：静水培育72h后，开启池子端头的搅拌机，以7cm/s流速流水，流水后每日投放营养盐NaNO3和KH2PO4，配制成NaNO31mg/L，KH2PO40.2mg/L。每日补水30-100％。水温不高于22℃。光照3000-10000Lx(该操作与上述使用本专利方法的操作相同)。12d后，裙带菜幼孢子体假根抓牢附着基，但此时苗种绳上和裙带菜幼孢子体上都有很多底栖硅藻(图1)，每3d洗刷苗帘1次。泼池28d，个别苗种规格达到0.5cm，但裙带菜幼苗稀少，缺苗严重(图3b)。
由图1和图2可知，采用对比例的常规培养方法，裙带菜配子体苗种周围的底栖硅藻很多，甚至纠缠在一起；而采用本发明的方法，裙带菜配子体苗种周围底栖硅藻很少。由图3可知，采用对比例的常规培养方法，裙带菜配子体苗种稀疏，严重缺苗，且规格小；而采用本发明的方法，裙带菜配子体苗种均匀，不缺苗，规格较大。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种裙带菜配子体育苗生产中防治底栖硅藻污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将泼池前已经破碎成1-6个细胞的雌雄混合配子体小段静置沉降；弃掉沉降后的配子体小段的上层液，将配子体小段接种到培养液中，并密封处理；向培养液中充气，保持配子体小段悬浮翻腾；光照处理培养液，使配子体小段预发育；直至配子体小段中70-90％雄配子体长出精荚，完成预发育得到预发育的配子体；
(2)将预发育的配子体滤出并破碎，在培育池注入砂滤海水，铺好空白苗种帘，投放营养盐，泼洒预发育后破碎的配子体，完成配子体泼池；
(3)配子体泼池后静水培育48-72h，然后用循环流水培育成幼孢子体；幼孢子体假根抓牢附着基后洗帘；镜检配子体或幼孢子体的生长、发育和健康情况，苗种规格达到0.5-1cm出库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养液由以下方法制备：烧制海水，沸腾5分钟后，冷却至15-22℃，加入营养盐NaNO3和KH2PO4，使NaNO3的浓度为5-10mg/L，KH2PO4的浓度为1-2mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述静置的温度为5-15℃，静置时间为12～24h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养液中接种的配子体小段以破碎前配子体鲜重计，接种密度为10-20g/L，雌雄配子体的鲜重比为1:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述光照处理的光照强度为3000-4000lx，光照周期L：D＝12h:12h；预发育的温度为18-22℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述破碎的温度≤20℃，破碎时间20-30s。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述营养盐包括NaNO3和KH2PO4，使NaNO3浓度为3mg/L，KH2PO4浓度为0.6mg/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，泼洒预发育后破碎的配子体，泼洒量为：按照预发育前未破碎的配子体鲜重计算，每40-60m苗种绳泼洒1g配子体，其中雌雄配子体的鲜重比为1:1；配子体泼池的池水温度≤22℃，光照强度≤3000lx。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述循环流水的水流速度为5-10cm/s；日补水量为池水量的30％-100％，池水温度≤22℃，光照强度为3000-10000lx；池水中加入营养盐NaNO3和KH2PO4，使NaNO3的浓度为1mg/L，KH2PO4的浓度为0.2mg/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗帘的频率为每3d洗刷苗帘1次。
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