CN112790108B - 一种石花菜的组织培养及其定植方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于藻类研究领域，公开了一种石花菜的组织培养及其定植方法，主要包括对原材料的选取准备、消毒切段、附着基的消毒准备、接种，在适宜的光照、温度及含有附着基的培养基条件下培养，获得附着于素色棉麻布的石花菜幼苗，用小扎带穿过布片上沿与苗绳连接扎牢，将苗绳的两端通过大扎带与定植框架连接，使苗绳绷直；定植框架的四个角连接浮球，使定植框架悬浮于水面以下10‑20cm，苗绳及挂养的苗种始终保持于水体表层，可使苗种均匀受光，促进其生长，本定植框架结构简单，挂苗方便，成本低，还可适用于拟鸡毛菜等其他海藻的苗种养殖。

Description

一种石花菜的组织培养及其定植方法

技术领域

本发明属于藻类研究领域，尤其涉及一种石花菜的组织培养及其定植方法。

背景技术

石花菜(Gelidium amansii)隶属于红藻门、真红藻纲、石花菜目、石花菜科、石花菜属，是一类重要的经济海藻。它的藻体呈紫红色，植株直立丛生，分支羽状扁平互生或对生，固着器假根状。它含有丰富的胶质，是制取琼胶的优质原料。其他海藻，如江蓠、拟鸡毛菜、紫菜虽然也能制取琼胶，然而就其色泽、透明度、硬度、口感及质量而言都不及石花菜琼胶制品好，国内外不断增大的需求与自然资源的不足的矛盾使石花菜的人工栽培成了亟待解决的问题。虽然也可以利用孢子及其他方法育苗，但没有根本解决苗种来源问题，仍需要采收自然生长的种藻，不是长久之计。最好的方法是采用无性繁殖的方法快速获得大量的苗种。

组织培养技术是一种较成熟的可以在短时间内获得大量幼苗的技术，目前对于大型海藻的组织培养的研究多集中于红藻门和褐藻门种类的海藻，且取得了一定的成果，石花菜的组织培养工作主要还处于对组培流程技术上的开发和创新。而附着基在藻类的繁殖中有着重要的作用，特别是对像石花菜这种具有假根的藻类。在有性繁殖上，人工育苗大都需要附着基，特别是在孢子的诱导释放的过程中，附着基得到了广大利用。在无性繁殖上，附着基也有被用于实验和工厂化生产，一般是用于生出假根的处理，但是在石花菜属上成功生出假根的例子不多。例如中国专利申请号为200910231251.X的专利申请公开了一种石花菜组织培养苗种培育方法。该专利文献中使用的石花菜小块经破碎机破碎后又用200目筛绢收集而得，所获得的藻段长度约1mm，且选取的培养基中未添加植物激素，所以石花菜藻段经30～40天的培养后，所获得的苗种仍然较小仅是出芽状态。再如中国专利申请号为201210484151.X的专利申请公开了一种石花菜的组织培养方法。该专利文献中培养基配方较为繁琐，且接种密度较低，不易扩大规模培养。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，在苗种培育过程中利用附着基质，提供一种规模化组织培养石花菜苗种和苗种定植的方法。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：

一种石花菜的组织培养及其定植方法，以素色棉麻布做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植。

经过实验发现，选用素色棉麻布做为石花菜的附着基，能显著提高石花菜的附着率和出芽率，克服过去石花菜的组织培养与定植困难的问题。使用素色棉麻布作为苗种附着基质，确保苗种长出假根后可牢固附着在附着基质上，便于后期挂苗。

优选的，包括：

A、苗种的选取与暂养：用毛刷将石花菜在消毒海水中反复刷洗，再将其用无菌海水冲洗，然后置于培养箱中充气暂养；

B、苗种的消毒与切断：取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在消毒海水中反复刷洗，在无菌海水中超声处理，再消毒后用无菌海水冲洗，切段备用，获得段状石花菜；

C、附着基的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部直径大小一致后，煮沸并灭菌，烘干后放凉备用，获得素色棉麻布附着基；

D、接种：在无菌培养皿中加入培养基与所述素色棉麻布附着基，然后将所述段状石花菜分散于所述素色棉麻布附着基上，进行密封培养；

E、培养：保持适当光照，经过30～40天的密封培养，获得石花菜幼苗，附着在所述素色棉麻布附着基上；

F、定植：将附着在所述素色棉麻布附着基上的所述石花菜幼苗悬浮于水面以下，给水体充气，使水体呈流动状态，适量添加营养盐，定植生长，获得人工石花菜。

步骤A中，尽量选取藻体附着生物少，株大，枝粗壮、色泽鲜亮的石花菜，再进行预处理。预处理后在培养箱中充气暂养使其状态稳定。

优选的，包括：

A、苗种的选取与暂养：用毛刷将石花菜在消毒海水中反复刷洗，再将其用无菌海水冲洗，然后置于15～20℃，20～30μmol photons m^-2s^-1，光照周期12L：12D，盐度为33～35psu的培养箱中充气暂养3～5天；

B、苗种的消毒与切断：取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在消毒海水中反复刷洗，然后用超声波清洗仪在无菌海水中超声处理3～5分钟，再用75％～90％酒精消毒10～15s，再转移至1％～2％NaClO中消毒20～30s，最后用无菌海水冲洗4～5遍，用灭菌的手术刀切成2～4mm长的切段备用，获得所述段状石花菜；

C、附着基的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部直径大小一致后，将其置于开水中煮沸1～1.5小时，再置于高压灭菌锅中100～120℃灭菌20～30分钟，烘干后放凉备用，获得所述素色棉麻布附着基；

D、接种：在无菌培养皿中加入所述培养基与所述素色棉麻布附着基，然后将所述段状石花菜分散于所述素色棉麻布附着基上，每个培养皿接种3～9块石花菜切段，然后用封口膜将其封好进行密封培养；

E、培养：将接种完成的所述无菌培养皿放置在光照培养箱中，温度保持在18～24℃，光照强度20～30μmol photons m^-2s^-1，光周期为12L：12D，所述培养基每5～7天更换一次，经过30～40天的密封培养，获得所述石花菜幼苗，附着在所述素色棉麻布附着基上；

F、定植：将附着在所述素色棉麻布附着基上的所述石花菜幼苗悬浮于水面以下10～20cm，给水体充气，使水体呈流动状态，每5～7天换清洁海水50％～60％，每10～14天刷池并更换清洁海水90％～100％，适量添加营养盐，定植生长，获得所述人工石花菜。

步骤B中，超声处理后再使用75％～90％酒精加1％～2％NaClO消毒灭菌的程序，确保藻体的无菌状态。之后用灭菌刀片以2～4mm间隔切碎藻体，获得切段。

现有技术一般使用破碎机对藻体进行切段，再用筛绢过筛，所获得的切段极短，导致后续培养困难，时间更长且成活率更低。经过实验发现，将切段控制在2～4mm的范围内，能有效缩短培育时间，提高成活率。

现有技术一般切段完成后一般接种于锥形瓶中，整个培育过程均在锥形瓶中完成，为了提高培养成功率，往往采用较低的接种密度。而本发明在保持2～4mm切段的同时采用素色棉麻布为附着基，可以将接种密度最多提高到9块段，依然能保持较理想的培养成功率。在室内完成前期出芽及附着阶段，附着成功后，石花菜幼苗可以随着附着基投入室外或海上养殖，极大地节省成本。

优选的，所述培养基包括：在MES培养基中加入10mg/L NaNO₃、1mg/L KH₂PO₄、0.1mg/L吲哚乙酸获得。

在MES培养基中添加10mg/L NaNO₃、1mg/L KH₂PO₄从而使得培养基里营养盐充足、利于藻段生长，添加0.1mg/L吲哚乙酸以促进切段生长分裂。

优选的，步骤B和步骤D在超净工作台内完成。

接种所需的培养液、附着基质及各种器具均需灭菌，且接种在超净工作台完成，确保石花菜组培过程保持无菌状态。

优选的，步骤D中，所述培养基的更换通过15ml移液枪完成；步骤F中，所述营养盐的添加量为10～15mg/L NaNO₃、1～2mg/L KH₂PO₄。

每五天使用15ml移液枪更换一次培养基以避免破坏已经附着成功的藻段。

一种上述石花菜的组织培养及其定植方法使用的定植装置，包括养殖池和定植框架，所述定植框架中间设置苗绳，所述苗绳与附着所述石花菜幼苗的所述素色棉麻布附着基连接；所述定植框架的角通过浮力绳连接浮球，使所述定植框架悬浮在所述养殖池中；所述养殖池上设置气泵，所述气泵连接气石沉入所述养殖池底部；充气时，所述气泵工作吸入空气，通过所述气石从所述养殖池底部进入水体，使水体呈流动状态。

海上养殖因为潮汐作用等不稳定因素较多，刚刚附着完成的石花菜幼苗往往需要在室内定植培养一段时间。利用本发明的定植装置，气泵与气石相互配合，使水体呈流动状态，可以加快石花菜的生长。可以在本发明的定植装置中持续培养直接获得成熟的人工石花菜，也可以培养到石花菜拥有一定的抵御能力，投入到海上养殖，降低养殖成本。培养石花菜长到7～15cm，就能获得成熟的人工石花菜。

优选的，所述定植框架呈正方形，为4根50×50cm UPVC管和4个双通直角接头连接而成。

优选的，所述浮球为直径15cm高密度泡沫球，外包裹孔径3×3cm渔网网袋，袋口扎牢后与所述浮力绳连接。

优选的，所述浮球浮力绳为直径0.5cm的尼龙绳。

实施本发明，具有如下有益效果：

①方法简单，成本低，收效显著；

②有效的提高苗种生产效率，缩短石花菜养殖周期；

③本发明的定植框架结构简单，挂苗方便，成本低，还可适用于拟鸡毛菜等其他海藻的苗种养殖；

④苗绳及挂养的苗种始终保持于水体表层，可使苗种均匀受光，促进其生长；

⑤适用于工厂化养殖以及海上养殖。

附图说明

图1是石花菜幼苗的定植示意图；

图2是石花菜挂苗示意图；

其中，1-石花菜幼苗，2-圆形布片、21-扎孔，3-苗绳、31-绳结，4-浮球，5-浮力绳，6-定植框架，7-气泵，8-气石，9-养殖池；

图3是不同附着基质对石花菜切段的附着率的影响对比图；

图4是不同附着基质对石花菜切段的出芽率的影响对比图；

图5是以素色棉麻布为附着基质的石花菜切段培养第1天情况图；

图6是以素色棉麻布为附着基质的石花菜切段培养第10天情况图；

图7是以素色棉麻布为附着基质的石花菜切段培养第25天情况图；

图8是以素色棉麻布为附着基质的石花菜切段培养第35天情况图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种石花菜的组织培养及其定植方法，包括：

一、石花菜的组织培养方法

1.苗种的选取与暂养

选取藻体附着生物少，株大，枝粗壮、色泽鲜亮的石花菜，对其进行预处理：用毛刷将藻体在消毒海水中反复刷洗，去掉表面污物和杂藻后，再将其用无菌海水冲洗干净。然后将处理好的干净藻体置于15℃，20-30μmol photons m^-2s^-1,光照周期12L：12D，盐度为33psu的培养箱中充气培养暂养3天。

2.苗种的消毒与切断

取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在在消毒海水中反复刷洗藻体表面，然后用超声波清洗仪在无菌海水中超声处理3分钟，再用75％酒精消毒10s，再转移至1％NaClO中消毒20s，最后用无菌海水冲洗4遍，使藻体表面无残留。

将消毒藻体用手术刀切成2～4mm长的切段备用(在超净工作台内完成)。

3.培养基的配制

培养基配置方法：MES培养基，加10mg/L NaNO₃,1mg/L KH₂PO₄,0.1mg/L吲哚乙酸

4.附着基的选取与处理

附着基质的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部大小一致后，将其置于开水中煮沸一小时，再置于高压灭菌锅中100℃灭菌30分钟，烘干后放凉备用。

5.苗种接种

接种：在无菌培养皿中加入上述培养基与已灭菌的素色棉麻布，然后将切好的藻段均匀分散于附着基上，每个培养皿接种3～5块石花菜切段，然后用封口膜将其封好进行培养。(接种过程在超净工作台进行。)

6.培养条件与方法：

将接种完成的培养皿放置在恒温培养箱中，培养箱温度保持在18℃，光照强度20-30μmol photons m^-2s^-1，光周期为12L：12D，每5天更换一次培养基，在培养第1、10、25、35天对石花菜培养情况进行观测拍照，结果如图5～8所示。

从图5～8可以看出，培育第1天时，石花菜仅为切段，未看见有芽萌出，为接种完成的初始状态。培育第10天时，石花菜切段两端均出现芽萌出，并且数量较多，但均未附着，未形成假根。培育第25天时，石花菜的部分芽呈明显簇状、形成假根，并与素色棉麻布附着基质交缠在一起，牢固附着。培育第35天时，石花菜保持牢固附着状态，并且切段本身可见生长。

经过40天的培养，可获得大量石花菜苗种，幼苗的长度为2～3cm。

二、定植方法具体实施(如图1、图2所示)

1.石花菜幼苗的选取

经过30～40天培养，选取附着于素色棉麻布2的石花菜幼苗1，幼苗长度2～3cm。

2.定植框架的制作

定植框架6呈正方形，由4根50×50cm UPVC管和4个双通直角接头连接而成。

3.浮球的制作

浮球4选择直径15cm高密度泡沫球，外包裹孔径3×3cm渔网网袋，袋口扎牢与浮力绳连5接；

4.室内养殖池定植

将挑选好的附着石花菜幼苗1的素色棉麻布2，通过小扎带穿过布片上沿的扎孔21连接在苗绳3上，每间隔7cm连接一个布片；使用大扎带将苗绳3的两端固定在定植框架6上，使每两根苗绳3的间距为10cm，苗绳3两端打绳结31；定植框架6的四个角通过浮力绳5分别与浮球4连接，使定植框架6悬浮于水面以下10-20cm处。

5.定植管理

(1)使用气泵7给养殖池9内的水体充气，使水体呈流动状态，增强石花菜幼苗1的附着力；

(2)每5天换清洁海水50％，每10天刷池并更换清洁海水100％，加10mg/L NaNO₃,1mg/L KH₂PO₄营养盐促进石花菜幼苗的生长发育；

三、实验情况

(1)选取生长旺盛的石花菜成体进行切段组织培养，能够获得大量的石花菜幼苗；

(2)在培养基中添加一定量的生长激素，能有效的提高石花菜幼体的生长发育；

(3)石花菜切段组织培养过程中，使用素色棉布片作为附着基，能使切段发育假根，并能很好的附着，为后续的定植与养殖提供便利和增产增效。

实施例2

一种石花菜的组织培养及其定植方法，包括：

三、石花菜的组织培养方法

1.苗种的选取与暂养

选取藻体附着生物少，株大，枝粗壮、色泽鲜亮的石花菜，对其进行预处理：用毛刷将藻体在消毒海水中反复刷洗，去掉表面污物和杂藻后，再将其用无菌海水冲洗干净。然后将处理好的干净藻体置于20℃，20-30μmol photons m^-2s^-1,光照周期12L：12D，盐度为35psu的培养箱中充气培养暂养5天。

2.苗种的消毒与切断

取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在在消毒海水中反复刷洗藻体表面，然后用超声波清洗仪在无菌海水中超声处理5分钟，再用90％酒精消毒15s，再转移至2％NaClO中消毒30s，最后用无菌海水冲洗5遍，使藻体表面无残留。

将消毒藻体用手术刀切成2～4mm长的切段备用(在超净工作台内完成)。

3.培养基的配制

培养基配置方法：MES培养基，加15mg/L NaNO₃,2mg/L KH₂PO₄,0.2mg/L吲哚乙酸

4.附着基的选取与处理

附着基质的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部大小一致后，将其置于开水中煮沸一个半小时，再置于高压灭菌锅中120℃灭菌20分钟，烘干后放凉备用。

5.苗种接种

接种：在无菌培养皿中加入上述培养基与已灭菌的素色棉麻布，然后将切好的藻段均匀分散于附着基上，每个培养皿接种7～9块石花菜切段，然后用封口膜将其封好进行培养。(接种过程在超净工作台进行。)

6.培养条件与方法：

将接种完成的培养皿放置在恒温培养箱中，培养箱温度保持在24℃，光照强度20-30μmol photons m^-2s^-1，光周期为12L：12D，每7天更换一次培养基，经过30天的培养，可获得大量石花菜苗种，幼苗的长度为2～3cm。

四、定植方法具体实施

1.石花菜幼苗的选取

经过30～40天培养，选取附着于素色棉麻布2的石花菜幼苗1，幼苗长度2～3cm。

2.定植框架的制作

定植框架6呈正方形，由4根50×50cm UPVC管和4个双通直角接头连接而成。

3.浮球的制作

浮球4选择直径15cm高密度泡沫球，外包裹孔径3×3cm渔网网袋，袋口扎牢与浮力绳连5接；

6.室内养殖池定植

将挑选好的附着石花菜幼苗1的素色棉麻布2，通过小扎带穿过布片上沿的扎孔21连接在苗绳3上，每间隔7cm连接一个布片；使用大扎带将苗绳3的两端固定在定植框架6上，使每两根苗绳3的间距为10cm，苗绳3两端打绳结31；定植框架6的四个角通过浮力绳5分别与浮球4连接，使定植框架6悬浮于水面以下10-20cm处。

7.定植管理

(3)使用气泵7给养殖池9内的水体充气，使水体呈流动状态，增强石花菜幼苗1的附着力；

(4)每7天换清洁海水60％，每14天刷池并更换清洁海水90％，加15mg/L NaNO₃,2mg/L KH₂PO₄营养盐促进石花菜幼苗的生长发育；

三、实验情况

(1)选取生长旺盛的石花菜成体进行切段组织培养，能够获得大量的石花菜幼苗；

(2)在培养基中添加一定量的生长激素，能有效的提高石花菜幼体的生长发育；

(3)石花菜切段组织培养过程中，使用素色棉布片作为附着基，能使切段发育假根，并能很好的附着，为后续的定植与养殖提供便利和增产增效。

对比例1

一种石花菜的组织培养及其定植方法，操作与条件选择同实施例1，区别在于，以文蛤做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植。

对比例2

一种石花菜的组织培养及其定植方法，操作与条件选择同实施例1，区别在于，以竹片做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植。

对比例3

一种石花菜的组织培养及其定植方法，操作与条件选择同实施例1，区别在于，以棕色粗麻布做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植。

对比例4

一种石花菜的组织培养及其定植方法，操作与条件选择同实施例1，区别在于，以纱布做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植。

效果例1

对实施例1、对比例1～4的组织培养及其定植过程进行观测与记录，探究不同附着基质对石花菜切段的附着率的影响，结果如图3所示。

图3表示的是石花菜切段的附着率随时间和附着基的不同而有所差异(RMANOVA：F_4,25＝44.09，p<0.001；F_4,100＝525.5，p<0.001；F_16,100＝32.56，p<0.001分别代表附着基质，时间和附着基质*时间)。

可以看出，石花菜切段最高附着率出现再第35天的素色棉麻布中，达到了85.19％，其中棕色粗麻布上的切段附着率与其相近为77.78％；切段在素色棉麻布与竹片、棕色粗麻布三种附着基上的附着率均随时间而上升；切段在纱布上的附着率与前三者(素色棉麻布与竹片、棕色粗麻布)相比稍低，其最大附着率仅为53.7％；而文蛤在整个培养周期中附着率最低，且附着后由于文蛤表面比较光滑致使其附着并不牢固，在更换培养基的过程中培养皿略微移动，就可能会使附着的切段脱落。因此，五种附着基质中，切段在文蛤上最不易附着，且附着后并不牢固，非常容易脱落，在第35天时，切段在文蛤上的附着率仅为7.41％。本专利中石花菜切段培养选用了素色棉麻布作为附着基质相较于文蛤与纱布能显著增加藻体的附着率。且在投入海区培养后，素色棉麻布上的附着切段的生长情况比竹片和棕色粗麻的效果要好很多。

效果例2

对实施例1、对比例1～4的组织培养及其定植过程进行观测与记录，不同附着基质对石花菜切段的出芽率的影响，结果如图3所示。

图3表示的是石花菜切段培养的不定芽的形成率因时间和附着基的不同而差异(RMANOVA：F_4,25＝15.56，p<0.001；F_4,100＝678.1，p<0.001；F_16,100＝4.61，p<0.001分别代表附着基质，时间和附着基质*时间)。

可以看出，石花菜切段的最大出芽率出现在第35天的素色棉麻布上，其出芽率为96.3％，竹片和棕色粗麻布在第35天的出芽率与之相近，分别为88.89％和90.74％；在文蛤和纱布两种附着基上，石花菜切段的出芽率在整个培养周期内增长趋势相同，并无显著性差异，在第35天时切段在文蛤和纱布上的出芽率分别为68.52％和74.07％，出芽率显著低于专利所选用的素色棉麻布。在整个培养周期内，切段在五种附着基质上的出芽率随培养时间的增加而上升，其中在第二阶段，各附着基上的切段出芽率均显著上升，后续阶段的上升趋于平缓。综合比较石花菜切段在五种附着基上的出芽情况，以素色棉麻布和棕色粗麻布两种附着基质为最佳。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种石花菜的组织培养及其定植方法，其特征在于，以素色棉麻布做为石花菜的附着基，进行组织培养与定植；包括：

A、苗种的选取与暂养：用毛刷将石花菜在消毒海水中反复刷洗，再将其用无菌海水冲洗，然后置于培养箱中充气暂养；

B、苗种的消毒与切断：取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在消毒海水中反复刷洗，在无菌海水中超声处理，再消毒后用无菌海水冲洗，切段备用，获得段状石花菜；

C、附着基的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部直径大小一致后，煮沸并灭菌，烘干后放凉备用，获得素色棉麻布附着基；

D、接种：在无菌培养皿中加入培养基与所述素色棉麻布附着基，然后将所述段状石花菜分散于所述素色棉麻布附着基上，进行密封培养；

E、培养：保持适当光照，经过30～40天的密封培养，获得石花菜幼苗，附着在所述素色棉麻布附着基上；

F、定植：将附着在所述素色棉麻布附着基上的所述石花菜幼苗悬浮于水面以下，给水体充气，使水体呈流动状态，适量添加营养盐，定植生长，获得人工石花菜；

所述培养基由MES培养基、10～15mg/L NaNO₃、1～2mg/L KH₂PO₄、0.1～0.2mg/L吲哚乙酸组成。

2.如权利要求1所述石花菜的组织培养及其定植方法，其特征在于，包括：

A、苗种的选取与暂养：用毛刷将石花菜在消毒海水中反复刷洗，再将其用无菌海水冲洗，然后置于15～20℃，20～30μmol photons m^-2s^-1，光照周期12L：12D，盐度为33～35psu的培养箱中充气暂养3～5天；

B、苗种的消毒与切断：取生长状况良好的石花菜主枝或分枝作为原材料，用毛刷在消毒海水中反复刷洗，然后用超声波清洗仪在无菌海水中超声处理3～5分钟，再用75％～90％酒精消毒10～15s，再转移至1％～2％NaClO中消毒20～30s，最后用无菌海水冲洗4～5遍，用灭菌的手术刀切成2～4mm长的切段备用，获得所述段状石花菜；

C、附着基的选取与处理：选用素色棉麻布作为附着基质，将其裁剪成与无菌培养皿底部直径大小一致后，将其置于开水中煮沸1～1.5小时，再置于高压灭菌锅中100～120℃灭菌20～30分钟，烘干后放凉备用，获得所述素色棉麻布附着基；

D、接种：在无菌培养皿中加入所述培养基与所述素色棉麻布附着基，然后将所述段状石花菜分散于所述素色棉麻布附着基上，每个培养皿接种3～9块石花菜切段，然后用封口膜将其封好进行密封培养；

E、培养：将接种完成的所述无菌培养皿放置在光照培养箱中，温度保持在18～24℃，光照强度20～30μmol photons m^-2s^-1，光周期为12L：12D，所述培养基每5～7天更换一次，经过30～40天的密封培养，获得所述石花菜幼苗，附着在所述素色棉麻布附着基上；

F、定植：将附着在所述素色棉麻布附着基上的所述石花菜幼苗悬浮于水面以下10～20cm，给水体充气，使水体呈流动状态，每5～7天换清洁海水50％～60％，每10～14天刷池并更换清洁海水90％～100％，适量添加营养盐，定植生长，获得所述人工石花菜。

3.如权利要求1所述石花菜的组织培养及其定植方法，其特征在于，步骤B和步骤D在超净工作台内完成。

4.如权利要求1所述石花菜的组织培养及其定植方法，其特征在于，步骤D中，所述培养基的更换通过15ml移液枪完成；步骤F中，所述营养盐的添加量为10～15mg/LNaNO₃、1～2mg/L KH₂PO₄。

5.一种如权利要求1所述石花菜的组织培养及其定植方法使用的定植装置，其特征在于，包括养殖池和定植框架，所述定植框架中间设置苗绳，所述苗绳与附着所述石花菜幼苗的所述素色棉麻布附着基连接；所述定植框架的角通过浮力绳连接浮球，使所述定植框架悬浮在所述养殖池中；所述养殖池上设置气泵，所述气泵连接气石沉入所述养殖池底部；充气时，所述气泵工作吸入空气，通过所述气石从所述养殖池底部进入水体，使水体呈流动状态。

6.如权利要求5所述定植装置，其特征在于，所述定植框架呈正方形，为4根50×50cmUPVC管和4个双通直角接头连接而成。

7.如权利要求5所述定植装置，其特征在于，所述浮球为直径15cm高密度泡沫球，外包裹孔径3×3cm渔网网袋，袋口扎牢后与所述浮力绳连接。

8.如权利要求5所述定植装置，其特征在于，所述浮球浮力绳为直径0.5cm的尼龙绳。

Images