CN112955444B - 一种新型的小分子cd73抑制剂、其制备方法及其在医药上的应用 - Google Patents

一种新型的小分子cd73抑制剂、其制备方法及其在医药上的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种新型的小分子CD73抑制剂、其制备方法及其在医药上的应用。具体而言，本公开涉及一种通式(I)所示的小分子CD73抑制剂、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂，特别是在制备用于治疗CD73介导的疾病和病症的药物中的用途，其中通式(I)的各取代基与说明书中的定义相同。

Description

一种新型的小分子CD73抑制剂、其制备方法及其在医药上的 应用
技术领域
本公开属于医药领域，涉及一种通式(I)所示的新型小分子CD73抑制剂或其前药、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂，特别是作为制备用于治疗CD73介导的疾病和病症的药物中的用途。
背景技术
CD73又称胞外-5′-核苷酸酶(Ecto-5′-Nucleotidase，EC3.1.3.5，ecto-5′-NT)，是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于质膜的一种糖蛋白。其在不同的组织中表达，特别是在结肠、肾、脑、肝、心脏、肺、脾、淋巴结和骨髓(Antonioli，L.等人，Trends Mol.Med.，2013，19，355-367)。CD73的酶活性是催化核苷单磷酸酯水解成其相应的核苷(例如5-AMP至腺苷)。CD73主要通过其酶促核苷产物，特别是细胞外空间中的腺苷，对上皮离子和液体输送、组织屏障功能控制、缺氧适应、缺血性预处理、抗炎和免疫抑制信号等发挥生理上的作用(Colgan，SP.等人，Purinergic Signaling，2006，2，351-360)。
作为普遍存在的具有神经调节特性的细胞外信号分子，腺苷通过与腺苷受体(受体亚型：A1、A2A、A2B和A3)的相互作用在人体内产生广泛的生理反应，包括在心血管系统里舒张血管和抑制房室传导的性质；在中枢神经系统中起到对局部神经元兴奋性抑制的镇静作用，还具有抗惊厥和神经保护效果(Dunwiddie，T.V.等人，Annu.Rev.Neurosci.2001，24，31-55)；在呼吸系统中收缩支气管效果(Pauwels，R.等人，Drug Development Research，1993，28，318-321)；以及在免疫系统中调解免疫或者炎症的反应(Hasko，G.等人，“A KeyLink between Metabolism and Brain Activity”，2013，233-251)。
CD73在许多癌症类型中广泛表达(Antonioli，L.等人，Trends in Cancer，2016，2(2)，95-109)，并且与许多癌症类型发生可能性的预测相关联(Allard，D.等人，Immunotherapy，2016，8(2)，145-163)。CD73促进癌症转移(Yang，Q.等人，Pathol.Oncol.Res.，2013，19，811-814)和化学耐药性(Loi，S.等人，PNAS，2013，110(27)，11091-11096)。在免疫系统中，CD73在巨噬细胞、淋巴细胞、调节性T细胞、髓源性抑制细胞(MDSCs)和树突细胞的表面上均有发现。主要由CD73产生的细胞外腺苷可以长期积累在肿瘤微环境中，激活腺苷受体，促进肿瘤诱导的单核吞噬细胞，解除抗肿瘤T细胞应答，扩大MDSCs群体，引发免疫抑制，有利于癌细胞逃逸免疫监视，从而促进癌症转化和生长(Antonioli，L.等人，Nature Reviews Cancer，2013，13，842-857)。
目前，作为CD73抑制剂的小分子候选药物大多数处于发现阶段，已公开的专利申请有WO2015164573、WO2017098421、WO2017120508、WO2017153952、US20170044203、WO2018049145、WO2018067424和WO2018094148。但是还没有小分子化合物进入临床研究。因此，有必要发现和开发新的CD73抑制剂，为抑制肿瘤发展和转移提供新的治疗方法，增加抗癌治疗的功效，并通过降低肿瘤微环境中的细胞外腺苷水平来恢复免疫细胞对癌细胞的有效抵抗反应来治疗癌症。
发明内容
因此，本公开的目的在于提供一种通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中：
Y为-O-或-S-；
Z为-O-或-NH-；
W选自-O-、-S-、-N(R10)-和-C(R11)(R12)-；
M选自NH、-O-或-S-；
G1和G2相同或不同，且各自独立地选自-N-或-C(R13)-；
L为亚烷基，其中所述的亚烷基任选进一步被选自烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、羟烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
Q选自-CH2-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-N(Rm)-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S(O)2-C(Rs)(Rt)-、-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-杂环基-、-C(Rm)(Rn)、-CH2-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rs)＝C(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)＝C(Rt)-和-C(Rs)＝C(Rt)-C(Rm)(Rn)；
Rs、Rt、Rm和Rn相同或不同，且各自独立地选自H、D、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基和氨基；
或者Rs和Rt一起形成氧代基；
或者Rm和Rn一起形成氧代基；
R1、R2、R3和R4相同或不同，且各自独立地选自羟基、氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟烷基、氰基、氨基、叠氮基和OR14；
或者R1和R2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基，其中所述的杂环基含有1至3个相同或不同的且选自N、O和S杂原子，其中所述的环烷基和杂环基任选进一步被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基中的一个或多个取代基所取代；
R5选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基和叠氮基；
R6和R7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、-C(Rm)(Rn)-O-C(O)ORd、-C(Rm)(Rn)-O-C(O)Rd、-C(Rm)(Rn)C(O)ORd、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基任选进一步被选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
Rd选自氢原子、烷基和烷氧基；
R8选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基；
R9选自氢原子、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选进一步被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
R10为烷基；
R11和R12相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基和烯基；
R13选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
R14选自-C(O)R15、-C(O)OR15、-S(O)2R15和-P(O)(OR6)(OR7)；
R15选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、羟基和羟烷基；
n为0或1。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其为通式(II)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中：
R1～R9、G1、G2、W、Y、Z、Q、L、M和n如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中W为-O-。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的R2、R4和R5为氢原子。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中R1和R3相同或不同，且各自独立地选自羟基、氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基和羟烷基，优选羟基。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其为通式(III)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中
R6～R9、M、Q、L和n如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的G1为-N-；G2为-CH-。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的R6和R7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基或-C(Rm)(Rn)-O-C(O)ORd；Rm、Rn和Rd如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的Q为-CH2-O-CH2-。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的L为-(CH2)s-；s为1、2或3。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中M为NH。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其为通式(IV)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中：
R8、R9和n如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其为通式(IV-1)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中：
R8和R9如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其为通式(IV-2)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐：
其中：
R16和R17与相连接的氮原子一起形成杂环基，所述杂环基优选为螺杂环基；其中所述杂环基除含有1个氮原子之外，还任选含有1～2个相同或不同的选自N、O和S的杂原子，并且所述杂环基任选进一步被选自烷基、烷氧基、卤素、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
R8如通式(I)中所定义。
在本公开的一些实施方案中，根据本公开所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中R8为卤素。
在本公开的一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中所述的R9选自烷基、环烷基和杂环基，其中所述的烷基、环烷基和杂环基任选被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，所述环烷基和杂环基包括环烷基和杂环基稠合芳基和杂芳基的情况；优选选自C1-6烷基、C3-12环烷基、4至12元的杂环基和被苯基取代的C1-6烷基；更优选选自丙基、
在本公开的一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，其中-(M)n-R9选自：
本公开的典型化合物包括但不限于：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐。
本公开的另一方面涉及一种通式(IA)所示的化合物：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，
其中：
Y为-O-或-S-；
Z为O；
Rx为烷基；
W选自-O-、-S-、-N(R10)-和-C(R11)(R12)-；
M选自-NH-、-O-或-S-；
G1和G2相同或不同，且各自独立地选自-N-或-C(R13)-；
L为亚烷基，其中所述的亚烷基任选进一步被选自烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、羟烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
Q选自-CH2-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-N(Rm)-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S(O)2-C(Rs)(Rt)-、-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-杂环基-、-C(Rm)(Rn)-、-CH2-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rs)＝C(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)＝C(Rt)-和-C(Rs)＝C(Rt)-C(Rm)(Rn)；
Rs、Rt、Rm和Rn相同或不同，且各自独立地选自H、D、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基和氨基；
或者Rs和Rt一起形成氧代基；
或者Rm和Rn一起形成氧代基；
R2和R4相同或不同，且各自独立地选自羟基、氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟烷基、氰基、氨基、叠氮基和OR14；
R5选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基和叠氮基；
R8选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基；
R9选自氢原子、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选进一步被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
R10为烷基；
R11和R12相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基和烯基；
R13选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
R14选自-C(O)R15、-C(O)OR15、-S(O)2R15和-P(O)(OR6)(OR7)；
R15选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、羟基和羟烷基；
n为0或1。
本公开的另一方面涉及一种通式(IIIA)所示的化合物：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐，
其中：
Rx为烷基；
M选自-NH-、-O-或-S-；
G1和G2相同或不同，且各自独立地选自-N-或-C(R13)-；
L为亚烷基，其中所述的亚烷基任选进一步被选自烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、羟烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
Q选自-CH2-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-N(Rm)-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S-C(Rs)(Rt)-、-CH2-S(O)2-C(Rs)(Rt)-、-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-苯基-O-C(Rs)(Rt)-、-CH2-杂环基-、-C(Rm)(Rn)-、-CH2-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rs)＝C(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)(Rt)-、-C(Rm)(Rn)-C(Rs)＝C(Rt)-和-C(Rs)＝C(Rt)-C(Rm)(Rn)；
Rs、Rt、Rm和Rn相同或不同，且各自独立地选自H、D、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基和氨基；
或者Rs和Rt一起形成氧代基；
或者Rm和Rn一起形成氧代基；
R8选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基；
R9选自氢原子、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选进一步被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
R13选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
n为0或1。
本公开通式(IA)的典型化合物包括但不限于：
/>
/>
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐。
本公开的另一方面涉及一种制备通式(I)所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
通式(IA)的化合物脱去保护基得到通式(I)的化合物，
其中：
Z为-O-；
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R1和R3为羟基；
R2、R4、R5、R8、R9、Q、L、Y、W、G1、G2、M和n如通式(I)中所定义。
本公开的另一方面涉及一种制备通式(II)所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
通式(IIA)的化合物脱去保护基得到通式(II)的化合物，
其中：
Z为-O-；
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R1和R3为羟基；
R2、R4、R5、R8、R9、Q、L、Y、W、G1、G2、M和n如通式(II)中所定义。
本公开的另一方面涉及一种制备通式(III)所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
通式(IIIA)的化合物脱去保护基得到通式(III)的化合物，
其中：
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R8、R9、Q、L、G1、G2、M和n如通式(III)中所定义。
本公开的另一方面涉及一种制备通式(IV)所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
通式(IVA)的化合物脱去保护基得到通式(IV)的化合物，
其中：
R8、R9和n如通式(IV)中所定义。
本公开的另一方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的本公开通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开进一步涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物在制备用于抑制CD73的药物中的用途。
本公开进一步涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物在制备用于治疗或预防CD73介导的疾病的药物中的用途。
本公开进一步涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物在制备用于治疗或预防腺苷和腺苷受体介导的疾病的药物中的用途。
本公开进一步涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、免疫系统疾病、炎性疾病、神经系统疾病、神经退行性疾病和中枢神经系统疾病、抑郁症、帕金森症、脑和心脏缺血性疾病、睡眠障碍或纤维化的药物中的用途；其中所述的肿瘤优选选自黑色素瘤、脑瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜异位症、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨软骨瘤、骨癌、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、子宫癌、头颈癌、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、淋巴瘤、白血病(如慢性粒细胞白血病、慢性淋巴性白血病、成淋巴细胞白血病或急性髓性白血病)、甲状腺癌、输尿管肿瘤、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌、绒毛膜上皮癌和小儿肿瘤。
本公开还涉及一种抑制CD73的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物。
本公开还涉及一种治疗或预防CD73介导的疾病的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物。
本公开还涉及一种治疗肿瘤、自身免疫性疾病、免疫系统疾病、炎性疾病、神经系统疾病、神经退行性疾病和中枢神经系统疾病、抑郁症、帕金森症、脑和心脏确血性疾病、睡眠障碍或纤维化的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐，或包含其的药物组合物；其中所述的肿瘤优选选自黑色素瘤、脑瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜异位症、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨软骨瘤、骨癌、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、子宫癌、头颈癌、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、淋巴瘤、白血病(如慢性粒细胞白血病、慢性淋巴性白血病、成淋巴细胞白血病或急性髓性白血病)、甲状腺癌、输尿管肿瘤、膀胱癌、胆囊癌、管癌、绒毛膜上皮癌和小儿肿瘤。
本公开进一步涉及一种通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐或包含其的药物组合物，其用作药物。
本公开还涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐或包含其的药物组合物，其用作CD73抑制剂。
本公开还涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐或包含其的药物组合物，其用于治疗或预防CD73介导的疾病。
本公开还涉及通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用盐或包含其的药物组合物，其用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、免疫系统疾病、炎性疾病、神经系统疾病、神经退行性疾病和中枢神经系统疾病、抑郁症、帕金森症、脑和心脏确血性疾病、睡眠障碍或纤维化；其中所述的肿瘤优选选自黑色素瘤、脑瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜异位症、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨软骨瘤、骨癌、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、子宫癌、头颈癌、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、淋巴瘤、白血病(如慢性粒细胞白血病、慢性淋巴性白血病、成淋巴细胞白血病或急性髓性白血病)、甲状腺癌、输尿管肿瘤、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌、绒毛膜上皮癌和小儿肿瘤。
可将活性化合物制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本公开化合物或组合物的单位剂量的方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。
本公开治疗方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、患者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂(稀释剂)、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。
含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。片剂含有活性成分和用于混合的适宜制备片剂的无毒的可药用的赋形剂。
水悬浮液含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例如尼泊金乙酯或尼泊金正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。
油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。
通过加入水可使适用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒提供活性成分和用于混合的分散剂或湿润剂、悬浮剂或一种或多种防腐剂。适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂可说明上述的例子。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。
可按用于直肠给药的栓剂形式给予本公开化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、患者的年龄、患者的体重、患者的健康状况、患者的行为、患者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物(I)的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
发明的详细说明
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1，1-亚乙基(-CH(CH3)-)、1，2-亚乙基(-CH2CH2)-、1，1-亚丙基(-CH(CH2CH3)-)、1，2-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、1，3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烯基”指分子中含有碳碳双键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。
术语“炔基”指分子中含有碳碳三键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基和环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至8个碳原子(例如3、4、5、6、7或8个碳原子)，最优选包含5至7个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“螺环烷基”指5至20元的单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷基或多螺环烷基，优选为单螺环烷基和双螺环烷基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺环烷基。螺环烷基的非限制性实例包括：
术语“稠环烷基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。稠环烷基的非限制性实例包括：
术语“桥环烷基”指5至20元，任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥环烷基的非限制性实例包括：
所述环烷基环包括上述环烷基稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基(苯基并环戊基)、四氢萘基、苯基并环戊基、苯并环庚烷基等；优选茚满基、四氢萘基。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；最优选包含3至8个环原子，其中1～3个是杂原子；最优选包含5至6个环原子，其中1～2或1～3个是杂原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等，优选四氢吡喃基、哌啶基、吡咯烷基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
所述杂环基环包括上述杂环基(包括单环和多环杂环基，例如螺杂环基，稠杂环基和桥杂环基)稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
等。
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，更优选5至6元，例如苯基和萘基。所述芳基环包括上述芳基稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，含1至3个杂原子；更优选为5元或6元，含1至2个杂原子；优选例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、1H-1，2，3-三唑基、4H-1，2，4-三唑基、4H-1，2，3-三唑基、1H-四唑基、2H-四唑基、5H-四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，优选为咪唑基、吡唑基或嘧啶基、噻唑基；更优选吡唑基或咪唑基。所述杂芳基环包括上述杂芳基稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基独立地任选选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、烯基、炔基、巯基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基、2，4-二甲氧基苄基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基优选为2，4-二甲氧苄基。
术语“环烷基氧基”指环烷基-O-，其中环烷基如上所定义。
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“卤代烷氧基”指烷氧基被一个或多个卤素取代，其中烷氧基如上所定义。
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“羟烷基”指被羟基取代的烷基，其中烷基如上所定义。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“氨基”指-NH2。
术语“氰基”指-CN。
术语“叠氮基”指-N＝N+＝N-。
术语“硝基”指-NO2。
术语“羰基”指C＝O。
术语“羧基”指-C(O)OH。
术语“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或-C(O)O(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
本公开还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“可药用盐”是指本公开化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
本公开化合物的合成方法
为了完成本公开的目的，本公开采用如下技术方案：
方案一
本公开通式(I)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐的制备方法，包括以下步骤：
通式(IA)的化合物脱去保护基得到通式(I)的化合物，
其中：
Z为-O-；
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R1和R3为羟基；
R2、R4、R5、R8、R9、Q、L、Y、W、G1、G2、M和n如通式(I)中所定义。
脱保护基的试剂包括但不限于三氟乙酸、三甲基硅基溴和盐酸。
上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：醋酸、三氟乙酸、甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、1，4-二氧六环、乙二醇二甲醚、水或N，N-二甲基甲酰胺及其混合物。
方案二
本公开通式(II)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐的制备方法，包括以下步骤：
通式(IIA)的化合物脱去保护基得到通式(II)的化合物，
其中：
Z为-O-；
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R1和R3为羟基；
R2、R4、R5、R8、R9、Q、L、Y、W、G1、G2、M和n如通式(II)中所定义。
脱保护基的试剂包括但不限于三氟乙酸、三甲基硅基溴和盐酸。
上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：醋酸、三氟乙酸、甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、1，4-二氧六环、乙二醇二甲醚、水或N，N-二甲基甲酰胺及其混合物。
方案三
本公开通式(III)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐的制备方法，包括以下步骤：
通式(IIIA)的化合物脱去保护基得到通式(III)的化合物，
其中：
Rx为烷基；
R6和R7为氢原子；
R8、R9、Q、L、G1、G2、M和n如通式(III)中所定义。
脱保护基的试剂包括但不限于三氟乙酸、三甲基硅基溴和盐酸。
上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：醋酸、三氟乙酸、甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、1，4-二氧六环、乙二醇二甲醚、水或N，N-二甲基甲酰胺及其混合物。
方案四
本公开通式(IV)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、前药、混合物形式或其可药用的盐的制备方法，包括以下步骤：
通式(IVA)的化合物脱去保护基得到通式(IV)的化合物，
其中：
R8、R9和n如通式(IV)中所定义。
脱保护基的试剂包括但不限于三氟乙酸、三甲基硅基溴和盐酸。
上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：醋酸、三氟乙酸、甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、1，4-二氧六环、乙二醇二甲醚、水或N，N-二甲基甲酰胺及其混合物。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400和500 Ultrashield核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantageMAX))和Shimadzu LCMS-2020液相色谱-质谱仪。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)、Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)和ShimadzuOPTIONBOX-L高压液相色谱仪(Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱)。
手性HPLC分析测定使用LC-10A vp(Shimadzu)或者SFC-analytical(BergerInstruments Inc.)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
柱层析色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
手性制备柱层析使用Prep Star SD-1(Varian Instruments Inc.)或SFC-multigram(Berger Instruments Inc.)。
CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。
激酶平均抑制率及IC50值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品、上海毕得医药科技有限公司等公司。
实施例中无特殊说明，反应均能够在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，监测反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析色谱法的洗脱剂体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：二氯甲烷/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
实施例1
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
6-氯-N-环戊基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺1b
将化合物4，6-二氯-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶1a(1.75g，9.26mmol，毕得)加入甲醇溶剂(45.0mL)中，向该溶液加入三乙胺(1.40g，1.49mmol)和环戊胺(790mg，9.28mmol)，搅拌反应6小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1b(690mg，产率：31％)。
MS m/z(ESI)：238.1[M+1]。
第二步
(二乙氧基膦酰基)甲基2-硝基苯磺酸酯1d
将二乙基(羟甲基)膦酸酯1c(1.00g，5.95mmol，国药)和吡啶(941mg，11.90mmol)加入二氯甲烷溶剂(40.0mL)中，加入2-硝基苯磺酰氯(1.58g，7.14mmol)，搅拌反应2小时。加入乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)，水层用乙酸乙酯萃取(50mL)。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1d(1.50g，产率：71％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16-8.18(m，1H)，7.80-7.87(m，3H)，4.45-4.47(m，2H)，4.17-4.24(m，4H)，1.33-1.36(m，6H)。
第三步
叔丁基(((3aR，4R，6S，6aR)-6-(碘代甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)二甲基硅烷1f
将((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇1e(4.00g，12.56mmol，采用文献“Tetrahedron，2012，68，1540-1546”公开的方法制备而得)、碘(7.01g，27.63mmol)、三苯基膦(6.59g，25.12mmol)和咪唑(2.57g，37.68mmol)加入甲苯溶剂(50.0mL)中，将混合物于110℃加热反应3小时。冷却至室温后，加入乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)，水层用乙酸乙酯萃取(50mL)。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1f(5.10g，产率：94％)。
MS m/z(ESI)：429.1[M+1]。
第四步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-N-环戊基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺1g
将碳酸铯(10.04g，30.81mmol)加入到化合物1b(2.44g，10.27mmol)和化合物1f(4.40g，10.27mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(35.0mL)溶液中，该混合物于70℃加热反应36小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1g(1.00g，产率：18％)。
MS m/z(ESI)：538.3[M+1]。
第五步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇1h
将正四丁基氟化铵(628mg，2.79mmol)加入到化合物1g(1.00g，1.86mmol)的四氢呋喃(20.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1h(610mg，产率：77％)。
MS m/z(ESI)：424.2[M+1]。
第六步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二乙酯1i
将化合物1h(200mg，0.47mmol)、化合物1d(250mg，0.71mmol)和干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶剂(5.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(241mg，1.41mmol)。将混合物于70℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物1i(200mg，产率：74％)。
MS m/z(ESI)：574.2[M+1]。
第七步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
将化合物1i(800mg，1.39mmol)加入干燥的二氯甲烷溶剂(40.0mL)中，向该溶液加入三甲基硅基溴(2.13g，13.94mmol)，搅拌反应4小时，然后在0℃下加入饱和碳酸氢钠溶液(2.0mL)并搅拌10分钟。反应液通过减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残余物(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物1(400mg，产率：60％)。
MS m/z(ESI)：478.1[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.06(s，1H)，4.50-4.58(m，4H)，4.16-4.18(m，2H)，4.14-4.15(m，1H)，3.56-3.65(m，4H)，2.07-2.10(m，2H)，1.29-1.68(m，6H)。
实施例2
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(((S)-1-苯乙基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
(二叔丁氧基膦酰基)甲基2-硝基苯磺酸酯2b
将二叔丁基(羟甲基)膦酸酯2a(1.00g，4.46mmol，采用专利申请“US20140088314”公开的方法制备而成)和吡啶(706mg，8.92mmol)加入二氯甲烷溶剂(40.0mL)中，加入2-硝基苯磺酰氯(1.58g，7.14mmol)，搅拌反应2小时。加入乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)，水层用乙酸乙酯萃取(50mL)。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物2b(1.20g，产率：66％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.15-8.17(m，1H)，7.82-7.83(m，3H)，4.26-4.29(m，2H)，1.51(s，18H)。
第二步
(S)-6-氯-N-(1-苯乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺2c
将化合物1a(2.00g，10.58mmol)加入乙腈溶剂(20.0mL)中，向该溶液加入碳酸氢钠(1.78g，21.16mmol)和(S)-1-苯乙胺(1.28g，10.58mmol)，搅拌反应16小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物2c(1.00g，产率：35％)。
MS m/z(ESI)：274.0[M+1]。
第三步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-N-((S)-1-苯乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺2d
将碳酸铯(1.43g，4.38mmol)加入到化合物2c(400mg，1.46mmol)和化合物1f(688mg，1.61mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热反应36小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物2d(260mg，产率：31％)。
MS m/z(ESI)：574.3[M+1]。
第四步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(((S)-1-苯乙基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇2e
将正四丁基氟化铵(95mg，0.42mmol)加入到化合物2d(160mg，0.28mmol)的四氢呋喃(3.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物2e(120mg，产率：94％)。
MS m/z(ESI)：457.9[M-1]。
第五步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(((S)-1-苯乙基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯2f
将化合物2e(100mg，0.22mmol)、化合物2b(160mg，0.39mmol)和干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶剂(3.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(112mg，0.66mmol)。将混合物于70℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物2f(100mg，产率：69％)。
MS m/z(ESI)：665.9[M+1]。
第六步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(((S)-1-苯乙基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸2
将化合物2f(22mg，0.033mmol)加入到三氟乙酸溶剂(2.0mL)中，向该溶液加入水(0.5mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物2(12mg，产率：71％)。
MS m/z(ESI)：513.8[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.11(s，1H)，7.42-7.44(m，2H)，7.31-7.35(m，2H)，7.24-7.26(m，1H)，5.53-5.54(m，1H)，4.45-4.48(m，3H)，4.06-4.16(m，3H)，3.65-3.69(m，4H)，1.61-1.62(m，3H)。
实施例3
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(((R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
(R)-6-氯-N-(2，3-二氢-1H-茚-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺3a
将化合物1a(2.22g，11.74mmol)加入乙腈溶剂(50.0mL)中，向该溶液加入三乙胺(3.56g，35.24mmol)和(R)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(2.0g，11.78mmol，毕得)，搅拌反应16小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物3a(2.00g，产率：59％)。
MS m/z(ESI)：286.1[M+1]。
第二步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-N-((R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺3b
将碳酸铯(3.42g，10.49mmol)加入到化合物3a(1.00g，3.49mmol)和化合物1f(1.49g，3.47mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(20.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热反应16小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物3b(600mg，产率：29％)。
MS m/z(ESI)：586.3[M+1]。
第三步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(((R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇3c
将正四丁基氟化铵(144mg，0.64mmol)加入到化合物3b(250mg，0.43mmol)的四氢呋喃(30.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物3c(150mg，产率：75％)。
MS m/z(ESI)：470.1[M-1]。
第四步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(((R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯3d
将化合物3c(100mg，0.21mmol)和化合物2b(104mg，0.25mmol)溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶剂(10.0mL)中，加入叔丁醇镁(108mg，0.63mmol)。将混合物于60℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物3d(100mg，产率：70％)。
MS m/z(ESI)：677.9[M+1]。
第五步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(((R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸3
将化合物3d(100mg，0.15mmol)加入到二氯甲烷(5.0mL)中，加入三氟乙酸(1.0mL)，向该溶液加入水(0.2mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物3(20mg，产率：26％)。
MS m/z(ESI)：524.2[M-1]。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.11-9.13(m，1H)，8.16(s，1H)，7.16-7.31(m，4H)，5.79-5.85(m，1H)，4.42-4.51(m，4H)，4.27-4.31(m，1H)，3.99-4.05(m，2H)，3.88(s，2H)，3.47-3.50(m，3H)，3.26-3.35(m，2H)，2.87-3.32(m，3H)，1.94-2.00(m，1H)。
实施例4
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(丙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
6-氯-N-正丙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺4a
将化合物1a(2.0g，10.58mmol)加入乙腈溶剂(50.0mL)中，向该溶液加入三乙胺(3.21g，31.72mmol)和正丙胺(625mg，10.57mmol)，搅拌反应16小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物4a(1.5g，产率：67％)。
MS m/z(ESI)：212.0[M+1]。
第二步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-N-正丙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺4b
将碳酸铯(2.47g，7.57mmol)加入到化合物4a(535mg，2.53mmol)和化合物1f(2.16g，5.04mmol)的二甲基亚砜(20.0mL)溶液中，将混合物于80℃加热反应16小时。冷却至环境温度后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物4b(220mg，产率：17％)。
MS m/z(ESI)：512.3[M+1]。
第三步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(丙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇4c
将正四丁基氟化铵(145mg，0.64mmol)加入到化合物4b(220mg，0.43mmol)的四氢呋喃(20.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物4c(60mg，产率：35％)。
MS m/z(ESI)：398.1[M+1]。
第四步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(丙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯4d
将化合物4c(60mg，0.15mmol)、化合物2b(92mg，0.22mmol)和干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶剂(10.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(76mg，0.44mmol)。将混合物于60℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物4d(50mg，产率：55％)。
MS m/z(ESI)：604.1[M+1]。
第五步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(丙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸4
将化合物4d(50mg，0.082mmol)加入到二氯甲烷(5.0mL)中，加入三氟乙酸(1.0mL)，向该溶液加入水(0.2mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物4(10mg，产率：27％)。
MS m/z(ESI)：452.1[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.06(s，1H)，4.51-4.54(m，2H)，4.43-4.44(m，1H)，4.11-4.17(m，3H)，3.49-3.71(m，6H)，1.67-1.73(m，2H)，0.98-1.02(m，3H)。
实施例5
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(环庚基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
/>
第一步
6-氯-N-环庚基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺5a
将化合物1a(2.00g，10.58mmol)加入乙腈溶剂(20.0mL)中，向该溶液加入碳酸氢钠(1.78g，21.16mmol)和环庚胺(1.45g，12.81mmol)，搅拌反应16小时。过滤，滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5a(2.00g，产率：71％)。
MS m/z(ESI)：266.2[M+1]。
第二步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-N-环庚基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺5b
将碳酸铯(1.43g，4.38mmol)加入到化合物5a(200mg，0.753mmol)和化合物1f(387mg，0.903mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(5.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热反应12小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5b(220mg，产率：52.0％)。
MS m/z(ESI)：566.2[M+1]。
第三步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环庚基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇5c
将正四丁基氟化铵(600mg，2.66mmol)加入到化合物5b(300mg，0.28mmol)的四氢呋喃(5.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5c(60mg，产率：25％)。
MS m/z(ESI)：452.2[M+1]。
第四步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环庚基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯5d
将化合物5c(55mg，0.122mmol)、化合物2b(75mg，0.18mmol)和干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶剂(3.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(52mg，0.30mmol)。将混合物于70℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5d(35mg，产率：44％)。
MS m/z(ESI)：657.9[M+1]。
第五步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(环庚基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸5
将化合物5d(35mg，0.053mmol)加入到三氟乙酸溶剂(2.0mL)中，向该溶液加入水(0.2mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物5(15mg，产率：56％)。
MS m/z(ESI)：506.2[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.06(s，1H)，4.51-4.53(m，2H)，4.42-4.47(m，1H)，4.15-4.17(m，1H)，4.14-4.15(m，2H)，4.07(br，1H)，3.57-3.67(m，4H)，2.01-2.04(m，2H)，1.28-1.76(m，12H)。
实施例6
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
6-氯-4-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶6a
将化合物1a(1.50g，7.94mmol)加入乙腈溶剂(20.0mL)中，向该溶液加入碳酸氢钠(1.65g，11.94mmol)和2-氮杂螺[3.5]壬烷(1.00g，7.99mmol，韶远)，搅拌反应16小时。过滤，减压浓缩滤液，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物6a(2.00g，产率：91％)。
MS m/z(ESI)：278.2[M+1]。
第二步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-4-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶6b
将碳酸铯(1.20g，3.69mmol)加入到化合物6a(500mg，1.80mmol)和化合物1f(0.78mg，1.82mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热反应12小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物6b(800mg，产率：77％)。
MS m/z(ESI)：578.2[M+1]。
第三步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇6c
将正四丁基氟化铵(153mg，0.68mmol)加入到化合物6b(250mg，0.43mmol)的四氢呋喃(5.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物6c(180mg，产率：90％)。
MS m/z(ESI)：464.2[M+1]。
第四步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯6d
将化合物6c(100mg，0.22mmol)、化合物2b(133mg，0.32mmol)和N，N-二甲基甲酰胺溶剂(3.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(74mg，0.43mmol)。将混合物于70℃加热反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物6d(110mg，产率：76％)。
MS m/z(ESI)：669.9[M+1]。
第五步
((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(2-氮杂螺环[3.5]壬-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸6
将化合物6d(50mg，0.075mmol)加入到三氟乙酸溶剂(2.0mL)中，向该溶液加入水(0.2mL)，室温搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物6(15mg，产率：39％)。
MS m/z(ESI)：518.6[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.98(s，1H)，4.57-4.61(m，1H)，4.44-4.46(m，2H)，4.09-4.14(m，4H)，4.05(br，1H)，3.95(s，2H)，3.71-3.73(d，3H)，3.64-3.65(m，1H)，1.75-1.77(m，4H)，1.52-1.56(m，4H)，1.45-1.47(m，2H)。
实施例7
(((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸
第一步
2，3-二氢-1H-茚-1-甲酸甲酯7b
将2，3-二氢-1H-茚-1-羧酸7a(10.00g，61.65mmol，毕得)溶于甲醇溶剂(200.0mL)中，滴加浓硫酸(3.0mL)，加热至60℃，搅拌18小时。向反应液中加水(70mL)淬灭，用乙酸乙酯(200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。得到标题化合物7b(8.00g，产率73％)。
第二步
1-(羟基甲基)-2，3-二氢-1H-茚-1-羧酸7c
将化合物7b(7.00g，39.72mmol)、甲醛(9.67g，119.18mmol，纯度37％)和碳酸钾(16.47g，119.17mmol)加入至二甲基亚砜(70.0mL)中，搅拌反应18小时。向反应液中加入20mL水，用乙酸乙酯(70mL)萃取。水相用1N盐酸调pH至3左右，用乙酸乙酯(70mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。得到标题化合物7c(6g，产率78％)。
MS m/z(ESI)：191.0[M-1]。
第三步
N-苄基-1-(羟甲基)-2，3-二氢-1H-茚-1-甲酰胺7d
将化合物7c(6.00g，31.21mmol)、苯基甲胺(3.34g，31.21mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(8.97g，46.82mmol)、1-羟基苯并三唑(7.12g，46.82mmol)、二异丙基乙基胺(8.06g，62.43mmol)加入至N，N-二甲基甲酰胺溶剂(60.0mL)中，搅拌反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7d(8.00g，产率91％)。
MS m/z(ESI)：282.0[M+1]。
第四步
(1-(苄基氨基甲酰基)-2，3-二氢-1H-茚-1-基)甲基甲磺酸酯7e
将化合物7d(8.00g，28.43mmol)和三乙胺(2.87g，28.43mmol)溶于二氯甲烷溶剂(60.0mL)中，于0℃滴加甲基磺酰氯(3.25g，28.44mmol)，搅拌反应3小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7e(8.00g，产率78％)。
MS m/z(ESI)：360.1[M+1]。
第五步
1-苄基-2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚]-2-酮7f
将化合物7e(8.00g，22.25mmol)和碳酸钾(6.14g，44.51mmol)溶于乙腈溶剂(100.0mL)中，加热至70℃搅拌反应18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7f(5.00g，产率85％)。
MS m/z(ESI)：264.0[M+1]。
第六步
1-苄基-2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚]7g
将三氯化铝(5.06g，37.98mmol)溶于四氢呋喃溶剂(20.0mL)中，于0℃分批加入四氢铝锂(2.16g，56.96mmol)，并于0℃搅拌反应1小时。滴加预制的10mL化合物7f(5.00g，18.98mmol)的四氢呋喃溶液，室温搅拌18小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7g(4.00g，产率84％)。
MS m/z(ESI)：250.2[M+1]。
第七步
2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚]7h
将化合物7g(4.00g，16.04mmol)、甲酸铵(3.04g，48.13mmol)、氢氧化钯(1.12g，1.60mmol，纯度20％)加入至甲醇溶剂(100.0mL)中，氢气氛下加热至70℃搅拌18小时。加入甲醇(50mL)，过滤，滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物7h(1.90g，产率74％)。
MS m/z(ESI)：160.2[M+1]。
第八步
6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶7i
将化合物1a(660mg，3.492mmol)加入乙腈溶剂(10mL)中，向该溶液加入碳酸氢钠(317mg，3.774mmol)和化合物7h(500mg，3.14mmol)，搅拌反应16小时。向反应液中加入50mL水，用乙酸乙酯(50mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到标题化合物7i(800mg，产率：81％)。
MS m/z(ESI)：312.0[M+1]。
第九步
1-(((3aS，4R，6R，6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶7j
将碳酸铯(1.195g，3.654mmol)加入到化合物7i(380mg，1.218mmol)和化合物1f(523mg，1.221mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热36小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7j(200mg，产率：26％)。
MS m/z(ESI)：612.3[M+1]。
第十步
((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲醇7k
将正四丁基氟化铵(150mg，0.666mmol)加入到化合物7j(200mg，0.326mmol)的四氢呋喃(5.0mL)溶液中，搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7k(100mg，产率：61％)。
MS m/z(ESI)：497.9[M-1]。
第十一步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸二叔丁酯7l
将化合物7k(100mg，0.2mmol)、化合物2b(99mg，0.24mmol)和N，N-二甲基甲酰胺溶剂(3.0mL)混合在一起，加入叔丁醇镁(103mg，0.3mmol)。将混合物于70℃加热18小时。反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7l(60mg，产率：42％)。
MS m/z(ESI)：703.9[M+1]。
第十二步
(((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-(2′，3′-二氢螺[氮杂环丁烷-3，1′-茚基]-1-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸7
将化合物7l(60mg，0.085mmol)加入到三氟乙酸(0.5mL)和二氯甲烷(1mL)中，向该溶液加入水(0.05mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物7(5mg，产率：10％)。
MS m/z(ESI)：552.2[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.02(s，1H)，7.51(dd，2H)，7.24-7.28(m，3H)，5.35(t，1H)，4.62-4.88(m，3H)，4.47-4.45(m，4H)，4.18-4.17(m，2H)，4.16-4.15(m，1H)，3.63-3.68(m，4H)，2.99(t，2H)，2.52-2.55(m，2H)，2.04(br，1H)，1.63(br，1H)。
实施例8
((((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酰基)二(氧基))二(亚甲基)二异丙基二碳酸酯8
第一步
((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦酸8a
将化合物1(100mg，0.21mmol)加入丙酮溶剂(30.0mL)中，向该溶液加入浓硫酸(184mg，1.88mmol)，搅拌反应1小时。加入固体碳酸氢钠(1000mg，11.90mmol)搅拌10分钟，过滤，滤液减压浓缩，得到标题化合物8a(85mg，产率：78％)。
MS m/z(ESI)：518.1[M+1]。
第二步
((((((3aR，4R，6R，6aS)-6-((6-氯-4-(环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)甲基)膦膦酰基)二(氧基))二(亚甲基)二异丙基二碳酸酯8b
将二异丙基乙基胺(749mg，5.80mmol)和四正丁基溴化铵(177mg，0.62mmol)加入到化合物8a(200mg，0.39mmol)和氯甲基异丙基碳酸酯(883mg，5.79mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，将混合物于70℃加热24小时。冷却至室温后，反应液通过减压浓缩，残余物用硅胶柱层析色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8b(160mg，产率：55％)。
MS m/z(ESI)：750.2[M+1]。
第三步
((((((2R，3S，4R，5R)-5-((6-氯-4-环戊基氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酰基)二(氧基))二(亚甲基)二异丙基二碳酸酯8
将化合物8b(240mg，0.32mmol)加入到三氟乙酸溶剂(2.5mL)中，向该溶液加入水(0.25mL)，搅拌反应0.5小时。反应液通过减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(Shimadzu OPTIONBOX-L高压液相色谱仪，Gimini 5um NX-C18 100x21.2mm色谱柱，洗脱体系：乙腈，水)，得到标题化合物8(140mg，产率：62％)。
MS m/z(ESI)：710.1[M+1]。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.91(s，1H)，5.68-5.75(m，4H)，4.90-4.98(m，2H)，4.57-4.61(m，2H)，3.74-4.25(m，8H)，2.14-2.22(m，3H)，1.70-1.80(m，6H)，1.31-1.33(m，12H)。
测试例：
生物学评价
测试例1本公开化合物对CD73酶的体外抑制活性
CD73酶为胞外-5′-核苷酸酶，其将细胞外核苷5′单磷酸转化为核苷，以AMP或CMP作为优选的底物。
在该测定中，使用从中国仓鼠卵巢细胞系(R&D Systems)表达的重组人CD73将胞苷一磷酸(CMP)转化为胞苷和磷酸。在添加底物之前，将CD73酶与化合物预温育2小时。然后通过孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒测量磷酸盐的量。
实验材料及仪器
孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒：R&D Systems
重组人5′-核苷酸酶(CD73)：R&D Systems
HEPES缓冲液：Gibco，cat#15630-080
CMP：Sigma，cat#C1006
NaCl 5M：Boston Bioproducts，BM-244
TECAN读板器：TECAN
实验步骤
化合物首先用DMSO配成10mM溶液，再用DMSO 1∶3系列稀释，一共做12个浓度点(抑制性高的化合物从最高浓度10μM开始1∶3系列稀释)。在384孔板的每个孔中，将0.34nM重组人5′-核苷酸酶(CD73)和所测的化合物，在含有20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)、137mM NaCl、0.001％吐温20的测定缓冲液中培养，于37℃预孵育2小时。每个孔中的最终反应体积为12μL。化合物的最高浓度为125μM，DMSO浓度为1.25％。预孵育后，将3μL溶解在测定缓冲液中的CMP加入到每个反应孔中，最终的CMP浓度为45μM。将反应于37℃孵育15分钟，然后向每个反应孔中加入3μL孔雀石绿试剂A。在离心机中短暂旋转板30秒。于室温再孵育10分钟后，向每个反应孔中加入3μL孔雀石绿试剂B。反应板在离心机中短暂旋转30秒。于室温孵育20分钟后，在TECAN读板器上在OD620处读取信号。含有CD73酶、底物CMP和DMSO(无化合物)的反应用作测定阳性对照，而含有底物CMP和不含CD73酶的DMSO的反应用作测定阴性对照。通过使用GraphPad Prism中的适当程序绘制化合物浓度的对数和抑制百分比来计算IC50值。
本公开化合物对CD73酶活性的体外抑制通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见下表1。
表1本公开化合物对CD73酶活性的体外抑制的IC50值
实施例编号 IC50(nM)
1 0.09
3 0.17
4 0.25
5 2.9
6 0.3
7 3.4
结论：本公开化合物在体外对CD73酶活性具有明显的抑制作用。
测试例2本公开化合物对人黑色素瘤A375细胞上膜结合的CD73酶活性的抑制作用。
在该测定中，在化合物和CMP存在下，使用人黑素瘤A375细胞(ATCC CRL-1619)表面上的膜结合CD73酶活性将胞苷-磷酸(CMP)转化为胞苷和磷酸。然后通过孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒测量磷酸盐的量。
实验材料及仪器
孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒：R&D Systems，Cat#DY996
A375细胞系：ATCC，Cat#CRL-1619
DMEM：ATCC，Cat#，30-2002
Trypsin-EDTA 0.25％：Gibco，Cat#25-200-056
FBS：Gibco，Cat#16-140-071
青霉素-链霉素：Gibco，Cat#15-140-122
CMP：Sigma，Cat#C1006
DMSO：Fisher Chemical，Cat#D128-1
HEPES：Gibco，Cat#15630-080
NaCl 5M：Boston Bioproducts，Cat#BM-244
KCl 2M：Ambion，Cat#AM9640G
CaCl2 2M：Fisher，Cat#BP9742
NaHCO3 7.5％：Gibco，Cat#25080-094
葡萄糖：Gibco，Cat#A2494001
TECAN读板器：TECAN
实验步骤
使用含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基培养A375细胞。在测定前一天，使用胰蛋白酶采集A375细胞并进行细胞计数。在100μL培养基(2500细胞/孔)中将细胞接种到96孔板中。第二天，准备含有20mM HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、1.3mM CaCl2、4.2mM NaHCO3和1mg/mL葡萄糖的测定缓冲液。在37℃水浴中加热缓冲液。在含有50μM CMP的测定缓冲液中，以最高浓度10μM开始制备3.16倍系列稀释的化合物，并确保每种稀释液含有等量的DMSO(0.1％)。
从细胞培养板中轻轻取出培养基，用测定缓冲液轻轻洗涤细胞层一次，然后将200μL连续稀释的化合物溶液转移到相应的孔中。将200μL测定缓冲液加入阴性对照孔中，并将200μLDMSO/CMP/测定缓冲液加入阳性对照孔中。
在37℃，5％CO2孵育4小时后，将100μL上清液从每个孔转移到透明的平底96孔板中。将孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒中的20μL试剂A加入每个孔中。于室温孵育10分钟。每孔加入10μL试剂盒中的试剂B，点击板子以帮助混合。于室温孵育20分钟。然后使用TECAN读板器在OD620读取数据。
数据处理
NC为阴性对照；PC为阳性对照。
通过使用GraphPad Prism中的适当程序绘制化合物浓度的对数和抑制百分比来计算IC50值。
通过上述测定法测定本公开化合物对人黑色素瘤A375细胞上膜结合的CD73酶活性的生化抑制作用，得到的IC50值示于下表2中。
表2本公开化合物对人黑素瘤A375细胞上膜结合的CD73酶活性抑制的IC50值
实施例编号 IC50(nM)
1 2.5
2 59
3 9.1
5 20
6 80
7 98
结论：本公开化合物对A375细胞中的CD73酶活性具有显著的抑制作用。
药代动力学评价
测试例3本公开化合物的小鼠药代动力学测试
1、概述
以小鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定了小鼠注射给予实施例1化合物和灌胃给予实施例8化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本公开化合物在小鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
2、试验方案
2.1试验药品
实施例1化合物和实施例8化合物。
2.2试验动物
C57小鼠18只，雌性，平均分为2组，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006。
2.3药物配制
称取实施例1化合物，加5％体积的DMSO和5％吐温80(上海泰坦科技有限公司)使其溶解，然后加入90％生理盐水配制成0.1mg/ml无色澄明溶液。
称取实施例8化合物，加1.5％体积的DMSO和98.5％HBSS(Life technologies公司)配制成0.5mg/ml白色均匀混悬液。
2.4给药
一组C57小鼠禁食过夜后注射给药实施例1，给药剂量均为1mg/kg，给药体积均为0.1ml/10g。
另一组C57小鼠禁食过夜后灌胃给药实施例8，给药剂量均为10mg/kg，给药体积均为0.2ml/10g。
3、操作
小鼠注射给药实施例1化合物，于给药前及给药后0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、11.0、24.0小时采血0.1ml(每个时间点3只动物)，置于肝素化试管(来源？)中，3500转/分钟离心10分钟后分离血浆，于-20℃保存。
小鼠灌胃给药实施例8化合物，于给药前及给药后0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、11.0、24.0小时采血0.2ml(每个时间点3只动物)，置于预加入肝素化钠(国药集团化学试剂有限公司)的离心管管中，3500转/分钟离心10分钟后分离血浆，于-20℃保存。
测定不同浓度的药物注射给药后小鼠血浆中的待测化合物含量：取给药后各时刻的小鼠血浆25μl，加入内标溶液喜树碱(中国生物制品检定所)50μl(100ng/mL)和乙腈175μl，涡旋混合5分钟，离心10分钟(3700转/分钟)，血浆样品取上清液1μl进行LC/MS/MS(API4000三重四极杆串联质谱仪(No.3)，美国Applied Biosystems公司；Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱系统，日本Shimadzu公司。)分析。
4、药代动力学参数结果
本公开化合物的药代动力学参数如下表3所示。实施例8在小鼠血浆中的浓度低于定量下线，但检测到了产物实施例1。
表3本公开化合物的药代动力学参数
结论：本公开化合物的药代吸收较好，具有药代动力学优势；实施例8为实施例1的前药。

Claims (18)

1.一种通式(III)所示的化合物或其可药用的盐：
其中：
G1为-N-；
G2为-C(R13)-；
L为-(CH2)s-；s为1、2或3；
-(M)n-R9为
Q为-CH2-O-C(Rs)(Rt)-；
Rs和Rt相同或不同，且各自独立地为H或卤素；
R6和R7为氢原子；
R8为氢原子或卤素；
R13为氢原子或卤素。
2.根据权利要求1所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中G1为-N-；G2为-CH-。
3.根据权利要求1或2所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中Q为-CH2-O-CH2-。
4.根据权利要求1或2所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(IV)所示的化合物或其可药用的盐：
其中：
-(NH)n-R9为
R8如权利要求1中所定义。
5.根据权利要求1或2所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R8为卤素。
6.化合物或其可药用的盐，其选自：
7.一种通式(IIIA)所示的化合物或其可药用的盐：
其中：
Rx为C1-6烷基；
G1为-N-；
G2为-C(R13)-；
L为-(CH2)s-；s为1、2或3；
-(M)n-R9为
Q选自-CH2-O-C(Rs)(Rt)-；
Rs和Rt相同或不同，且各自独立地为H或卤素；
R8为氢原子或卤素；
R13为氢原子或卤素。
8.化合物或其可药用的盐，其选自：
9.一种制备根据权利要求1所述的通式(III)所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
通式(IIIA)的化合物脱去保护基得到通式(III)的化合物，
其中：
Rx为C1-6烷基；
R6和R7为氢原子；
R8、-(M)n-R9、Q、L、G1和G2如权利要求1中所定义。
10.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于抑制CD73的药物中的用途。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗或预防CD73介导的疾病的药物中的用途。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗或预防腺苷和腺苷受体介导的疾病的药物中的用途。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤、子宫内膜异位症、免疫系统疾病、炎性疾病、神经系统疾病、抑郁症、帕金森症、脑和心脏缺血性疾病、睡眠障碍或纤维化的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，所述的用途为在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述肿瘤选自黑色素瘤、脑瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨软骨瘤、骨癌、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、头颈癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、输尿管肿瘤、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌、绒毛膜上皮癌和小儿肿瘤。
17.根据权利要求14所述的用途，所述的免疫系统疾病为自身免疫性疾病。
18.根据权利要求14所述的用途，所述的神经系统疾病为神经退行性疾病或中枢神经系统疾病。
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