CN112940315B

CN112940315B - 一种纳米胶原蛋白膜的制备方法与应用

Info

Publication number: CN112940315B
Application number: CN202110164673.0A
Authority: CN
Inventors: 田晓静; 王稳航
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-02-05
Also published as: CN112940315A

Abstract

本发明公开了一种纳米胶原蛋白膜的制备方法及其应用，属于胶原蛋白膜技术领域，制备方法包括以下步骤：(1)以牛皮为原料，采用酸法提取大尺寸胶原，获得大尺寸胶原蛋白；(2)采用高压均质技术制备纳米胶原；(3)采用酸水解法，制备水解度0‑100％的单宁水解物；(4)向纳米胶原中添加上述单宁水解物和漆本科，然后置于适宜温度下交联、成膜、固化、干燥，获得纳米胶原蛋白膜。同时本发明公开了上述纳米胶原蛋白膜在新鲜鱼糜包装中的应用。本发明中的纳米胶原蛋白膜由动物胶原为成膜材料，具有可食用、可降解及抑菌特性，可以满足不同的产品需要，拓宽了胶原蛋白在食品包装中的应用。

Description

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及胶原蛋白膜技术领域，更具体的说是涉及一种纳米胶原蛋白膜的制备方法与应用。

背景技术

人们生活中常用到的食品包装膜大多来自于石油化工中的合成塑料如聚乙烯(PE)和偏聚氯乙烯(PVDC)等，然而这些合成塑料类食品包装膜的广泛应用也带来了严重的环境问题。合成塑料的环境降解速度极慢，需要200-400 年时间，如果采用焚烧法处理塑料废弃物，其产生的有害气体又会严重污染大气、影响人体健康。此外，作为合成塑料原料的化石燃料几近枯竭。在这种情况下，研究开发可生物降解和可再生的新型食品包装膜迫在眉睫。

现有技术中以天然大分子聚合物为基质的可食性包装材料成为研究的热点。胶原具有许多优良的性质与功能，并且应用广泛，但在提取、加工过程中也不可避免地破坏了其在生物体内的原有结构，因而使得胶原在材料方面的机械性能与热性能等相对较差，阻碍了胶原在食品工业中的应用。

肠衣是制作肉肠、腊肠、香肠的原料，也是制作弓弦、医用手术肠线等的原料，而且出口量也较大。我国传统工艺生产的肠衣主要是将收购的原肠先清除粪便，再清洗，洗过之后再浸泡5-6h，然后用竹片刮除油脂、粘膜、灌水分路，最后再用盐腌制装桶。这种传统工艺生产的肠衣，颜色杂、味腥嗅、弹力小、易变质，储存时间短，肠体易产生盐蚀点、靛点、皮质会脱脂，失去光泽。

现有技术中的胶原蛋白肠衣主要利用牛、猪等动物的真皮层为原料，采用物理和化学方法提取非水溶性的胶原蛋白纤维，加入添加剂，再经过机械成型和改性处理，成为可食人造肠衣。但是，现有的胶原蛋白肠衣机械强度不足，且其抑菌性较差。

因此，如何提供一种具有优良力学性能，且良好抑菌性能的能够应用于肠衣的胶原蛋白膜是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有优良力学性能，且良好抑菌性能的胶原蛋白膜，其应用于肉制品包装中具有良好的抑菌能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)在pH为1-3，温度0-10℃条件下，采用酸溶胀法从胶原蛋白原料中提取大尺寸胶原蛋白，并将获得的大尺寸胶原蛋白配制成1.0-5.0wt％大尺寸胶原预成膜液，且调节pH至2-6；

(2)利用高压均质技术，在压力为50-300MPa的条件下对所述大尺寸胶原预成膜液均质，得到纳米尺寸胶原预成膜液；

(3)利用水解法对单宁进行水解，得到水解度0-100％的单宁水解物；

(4)向所述纳米尺寸胶原预成膜液中添加所述单宁水解物和漆酶，并于 0-10℃、100-200rpm条件下振荡交联2-8h，然后成膜、固化、干燥，得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。

优选的，步骤(1)中所述胶原蛋白原料包括牛皮、羊皮、鸡皮、家兔和鱼鳞中的一种或几种，所述大尺寸胶原蛋白直径为1mm左右。

有益效果：本发明利用牛皮为原材料，提取大尺寸胶原，但不仅仅局限于牛皮，同样适用于包括牛皮、羊皮、鸡皮、家兔和鱼鳞中的一种或几种原料混合后进行提取。

优选的，步骤(2)中所述纳米尺寸胶原预成膜液包括纳米尺寸胶原和胶原纤维，所述纳米尺寸胶原直径为10-100nm，所述胶原纤维直径≥1μm。

有益效果：高压均质技术明显降低了胶原尺寸。

优选的，步骤(3)中所述单宁来源于富含单宁的植物，优选五倍子。

优选的，步骤(3)中所述水解法为酸水解法，其中包括以下步骤：

先将单宁溶解于1mol/L硫酸溶液中，配置浓度为20mg/mL的酸性溶液；然后在惰性气体保护下，保持酸性溶液温度100℃，搅拌速度100-200rpm，时间0-20h，得到单宁水解液；再将所述单宁水解液在37℃条件下蒸发浓缩至蒸发前体积的10％左右，再于65℃惰性气体条件下吹至干燥，得到单宁水解物。

有益效果：在惰性气体条件下对单宁进行水解能够保护单宁在加热过程中不被氧化。

优选的，步骤(4)中所述单宁水解物、漆酶与纳米尺寸胶原的添加比为 (1-100)mg:(2-100)U:1g。

有益效果：单宁可以进入蛋白质表面的疏水区域，通过酚羟基与多肽的碳酰基进行多点氢键结合，使蛋白质分子间形成交联，单宁水解物的主要成分为没食子酸，其含有三个相邻的酚羟基和一个羧基，因而其化学反应活性较单宁高，可以与胶原蛋白进行更好地交联。

本发明中的漆酶可以使单宁水解物与胶原蛋白固化交联，从而可以获得具有较优机械性能和抑菌特性的胶原蛋白膜。

优选的，步骤(4)中成膜方式为浇铸法或挤出法，固化和干燥方法为所有可用于可食膜制备和香肠肠衣生产的工艺程序。

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法制备的纳米胶原蛋白膜在肉制品中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种纳米胶原蛋白膜的制备方法与应用。

(1)本发明借助漆酶催化单宁水解物与胶原的交联，提高了纳米胶原蛋白膜的弹性强度、断裂延伸率等机械性能。

(2)本发明中的纳米胶原蛋白膜由动物胶原为原材料制备，具有可食用、可降解及抑菌特性，可以满足不同的产品需要，拓宽了胶原蛋白在食品包装中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为纳米胶原膜的扫描电镜图；

其中图1a-1f分别表示对比例1、实施例1、实施例2、实施例3、实施例 4、实施例5；图1g-1l分别表示实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11

图2附图为纳米胶原膜的厚度值图；

图3附图为纳米胶原膜的拉伸强度、断裂延伸率及杨氏模量图；

图4附图为纳米胶原膜的热变性图；

图5附图为纳米胶原膜的热重分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)从牛皮中提取胶原蛋白前，除去碎肉、脂肪、结缔组织等非胶原组织，然后用蒸馏水清洗、浸泡直至pH为中性，裁剪成10cm×10cm的小块浸泡在pH为2.2的盐酸溶液中，提取环境温度0-10℃。充分溶胀后，用组织镊从溶胀的牛皮上剥离下胶原。将胶原均匀地分散于蒸馏水中，配制成1.0wt％胶原成膜液，用0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液调节其pH至4.5后备用。

(2)通过高压均质技术在压力150MPa的条件下均质3次，将上述直径为1mm的大尺寸胶原制备成直径为46-65nm的纳米尺寸胶原。之后，用 0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液调节其pH至4.5后得到纳米胶原预成膜液，4℃ 下冷藏备用。

(3)采用化学水解法，以硫酸为催化剂制备单宁水解产物。将单宁溶解在1mol/L硫酸溶液中(20mgGT/mL)，注入厚壁耐压瓶内，充氮气以保护单宁在加热过程中不被氧化。避光条件下，在恒温振荡器中加热水解，温度为 100℃，转速为150rpm，水解时间分别为0、2、4、6、20h，水解结束后取出，用冰冷却至室温。上述水解溶液经液液萃取法(溶剂为乙酸乙酯)除去其中的硫酸。将水解溶液与乙酸乙酯等体积混合于烧杯中，避光搅拌10min后转移到分液漏斗中避光静置直至分层，收集有机层于圆底烧瓶中，硫酸层进行二次萃取。获得的有机相在37℃条件下蒸发浓缩至蒸发前体积的10％左右，再于65℃氮气保护下吹至干燥。按照水解时间0h、2h、4h、6h、20h分别命名为GT、2HGT、4HGT、6HGT、20HGT。

(4)将各组单宁水解物溶解在去离子水中，分别量取100mL纳米胶原预成膜液于250mL锥形瓶中，以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入GT，使单宁最终浓度达到1mg/g，充分混匀得到单宁水解物成膜液。

(5)将上述成膜液放于恒温振荡器中(30℃)，110rpm振荡2h，使混合体系充分反应。交联的成膜液于超声波清洗器中去除气泡，浇铸于亚克力玻璃板上，室温下自然干燥48h，得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。将制备的单宁水解物-纳米胶原蛋白膜置于25±0.1℃，相对湿度50±0.1％的恒温恒湿干燥箱中平衡7天。

实施例2

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入2HGT，使单宁最终浓度达到1mg/g。最终得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。

实施例3

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入4HGT，使单宁最终浓度达到1mg/g。最终得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。

实施例4

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入6HGT，使单宁最终浓度达到1mg/g。最终得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。

实施例5

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入20HGT，使单宁最终浓度达到1mg/g。最终得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜。

实施例6

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入漆酶，使漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到漆酶-纳米胶原蛋白膜。

实施例7

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入GT和漆酶，使单宁最终浓度达到1mg/g，漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到单宁水解物- 漆酶-纳米胶原蛋白膜。

实施例8

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入2HGT和漆酶，使单宁最终浓度达到1mg/g，漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到单宁水解物 -漆酶-纳米胶原蛋白膜。

实施例9

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入4HGT和漆酶，使单宁最终浓度达到1mg/g，漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到单宁水解物 -漆酶-纳米胶原蛋白膜。

实施例10

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入6HGT和漆酶，使单宁最终浓度达到1mg/g，漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到单宁水解物 -漆酶-纳米胶原蛋白膜。

实施例11

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

步骤(4)中以纳米尺寸胶原的干物质含量为基础，加入20HGT和漆酶，使单宁最终浓度达到1mg/g，漆酶最终浓度达到12U/g。最终得到单宁水解物 -漆酶-纳米胶原蛋白膜。

对比例1

一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，与实施例1不同的是：

省略步骤(3)～(4)，其他技术参数与实施例1相同。

技术效果验证

一、交联后纳米胶原蛋白膜的表征

1、纳米胶原蛋白膜的扫描电子显微镜(SEM)观察

采用SEM对实施例制备的纳米胶原蛋白膜进行微观结构观察。将膜裁剪成5mm×5mm的尺寸，用导电胶带固定在载物台上，经真空喷金后，用SEM 在15kV的加速电压下，观察样本表面和横截面的形貌特征。

图1显示了单宁水解物和漆酶处理的纳米胶原蛋白膜的表面和横截面的微观结构。在放大2,000倍的情况下，纳米胶原蛋白膜的表面(图1a1)极其光滑，观察不到胶原纤维的存在，原因是高压均质过程中，大尺寸胶原纤维逐渐变短，而在成膜过程中由于水分的蒸发，纤维之间的距离随之减小，相邻的纤维间发生自组装，使得纤维间排列地更加紧密，因此形成的样本表面极其光滑。在单宁水解物组(图1b1-f1)，随着水解度的增加，样本的表面由光滑(图1b1)逐渐变得粗糙，呈现磨砂质感(图1c1-d1)，最终出现块状凸起(图1e1-f1)，这可能是由于水解程度大的单宁水解物中含有更多的羟基和羧基，能与胶原分子链上的羟基和氨基结合，一定程度上束缚了纤维的运动，使得纤维间的堆砌程度变大，导致局部聚集，最终呈现出大团聚区域。与纯纳米胶原蛋白膜相比，只添加漆酶的样本表面出现少量颗粒物(图1 g1)，在添加单宁―漆酶后，样本的表面出现更多的小颗粒(图1h1)，以上现象是由于漆酶能够催化胶原侧链上的芳香族氨基酸氧化使得纳米胶原间形成部分交联，出现少量因交联而产生的颗粒物。当单宁和漆酶同时存在于体系中时，单宁被漆酶催化而偶联在胶原上，使得其活性位点增多，进而提高了漆酶的催化效率，促进了纳米胶原之间的交联反应，因而样本表面呈现更多聚集性蛋白颗粒。随着单宁水解程度的增加，颗粒数量逐渐增多，因为水解程度越高，产生没食子酸的数量越多，体系中的羟基数量越多，与胶原间发生的多点交联越多，使得蛋白质聚集，表现为样本表面出现小颗粒。

2、纳米胶原蛋白膜的厚度

使用手持测厚仪测定实施例制备的纳米胶原蛋白膜的厚度。在样本上随机选取10个测量点进行测定，单个样本的厚度为10个测量点的平均值，测厚仪的最小单位是1μm。

在图2中列出了各组样本的厚度，可以看到，纯纳米胶原蛋白膜的厚度为71.6±3.47μm，高于其他组样本，但是结果并不显著，说明单宁水解物和漆酶的添加未对样本的厚度产生显著影响。

3、机械性能

借助质构仪对实施例制备的纳米胶原蛋白膜的拉伸强度和断裂延伸率进行测定。将膜裁剪为20×65mm的尺寸，使用质构仪测定膜的拉伸强度和断裂延伸率，测试相关参数如下：初始距离为30mm，测试速率为1.0mm/s。每个样本测试5组平行，结果取平均值。检测样本在湿状态下的机械性能时，将样本浸泡在25℃，150mL去离子水中12h，测试前用滤纸吸干表面水分。杨氏模量(Y)通过应力―应变曲线弹性范围内的斜率得到。

按式(1)计算拉伸强度(TS)：

式(1)中：

TS为拉伸强度，MPa；

F为样本断裂时最大拉力，MPa；

S为样本横截面面积，mm²。

按式(2)计算断裂延伸率(EAB)：

式(2)中：

EAB为样本断裂时最大延伸率，％；

L为样本断裂前最大拉伸长度，mm；

L₀为设定的初始距离，30mm。

图3列出了实施例制备的纳米胶原蛋白膜的拉伸强度、断裂延伸率和杨氏模量的数据。相比于纯纳米胶原蛋白膜，添加单宁水解物使膜的拉伸强度和断裂延伸率有所提高(95.58MPa，8.98％)。添加漆酶后，单宁水解物-漆酶纳米胶原蛋白膜的拉伸强度和断裂延伸率比只添加单宁水解物有所增加，其中，实施例9中产品的拉伸强度达到100.77MPa，显著高于对比例1 (84.67MPa)，说明膜的抗拉伸能力得到有效提高。这种变化是因为漆酶能够在酸性环境下催化单宁水解物氧化偶联纳米胶原，使得纳米胶原分子间形成氢键和共价键，导致样本的交联度和致密性增加，抵抗外力拉伸的能力提高，从而提高了样本的拉伸强度和断裂延伸率。另外，在图3中还可以看到，纯纳米胶原蛋白膜的杨氏模量为2152.94MPa，添加单宁水解物后数值降低，但随着水解度的增加，样本的杨氏模量呈现先增加后降低的趋势，并且在漆酶的共同作用下增强效果更加显著，这说明在单宁水解物和漆酶交联胶原后，样本的硬度下降，柔软度上升，在外力的作用下能够更好地发生形变，也更具有柔韧性。

4、热变性分析(DSC)

精确称量2-3mg样本，密封于铝制固体坩埚中，以空坩埚为空白对照组进行检测。升温范围为30-200℃，升温速率为10℃/min。

图4是纳米胶原蛋白膜的DSC曲线图，可以看到纯纳米胶原蛋白膜的峰值温度为78.05℃，随着单宁水解程度的增加，样本的峰值温度稍有升高(图 4a)；添加单宁水解物-漆酶后，样本的峰值温度显著高于只添加单宁水解物样本的温度，其峰值温度是纯纳米胶原蛋白膜的1.2-1.3倍(图4b)。以上可以解释为：在单宁水解物组中，少部分没食子酸自动氧化，与胶原通过氢键、疏水作用等连接，提高了体系的热稳定性。而在单宁水解物-漆酶组中，大部分的酚类物质被漆酶氧化成醌式结构，并与胶原发生席夫碱反应和迈克尔加成反应形成共价键，从而显著提高了胶原体系的热稳定性。

5、热重分析(TGA)

精确称量3-5mg样本，在流速为100cm³/min的氮气保护下进行热稳定性分析。升温范围为25-600℃，升温速率为10℃/min。

图5展示了样本在热重分析实验中的相关结果。在图5a,b中可以看到，样本的热降解主要分为自由水蒸发(T_m1)和胶原热分解(T_m2)两个阶段。

图5中c图展示了样本在分解阶段的外延起始温度、外延终止温度、分解温度和重量损失率。从图中可以看到，添加单宁水解产物后，样本的起始温度、分解温度和终止温度均有所降低，但是变化并不明显；而当漆酶和单宁水解物共同存在时，上述温度均有所提高，这表明体系的热稳定性升高，原因可能是在漆酶的催化下，水解物中的羟基和羧基与胶原上的羟(-OH)、酰胺基(-CO-NH-)、氨基(-NH₂)和羧基(-COOH)等基团，通过席夫碱反应和迈克尔加成反应以共价键连接，形成分子间交联，导致分子链的运动受到更大的阻碍，使得体系需要更多的热量以完成分解，因而上升了样本的热分解温度。另外，与纯纳米胶原蛋白膜样本相比(35.36％)，单宁水解物- 漆酶的添加使得样本在分解阶段的重量损失减少，随着水解程度的增加，重量损失呈现递减趋势，这进一步说明在漆酶催化下，单宁水解物和胶原的活性基团之间形成更加稳定的交联键，保护了侧氨基或端氨基不被分解，阻碍了脱氨和脱水反应的进行，从而降低了样本的重量损失。

6、生鲜保鲜应用研究

为探究样本在生鲜肉类保鲜中的实际应用效果，测定了制备的纳米胶原膜在4℃贮藏条件下对鳕鱼肉糜的包装效果和抗菌特性。首先，将冷冻鳕鱼肉进行缓冻，用匀浆机打至细腻的鱼糜状态。将蛋白膜裁剪成6×6cm的规则形状，包裹5g鱼糜，用U型手动打卡机对鱼糜封口后，置于酒精消毒杀菌后的铁盘上，覆盖保鲜膜以保持水分，在4℃环境下分别储存0、2、4、6、8天。不覆盖膜的新鲜鱼糜为阴性对照组，以添加ε-聚赖氨酸盐酸盐的膜包裹的鱼糜为阳性对照组(添加量为0.3mg/g纳米胶原)。

在包装效果方面，所有贮藏期间的鱼糜均能保持原有形状，未出现破裂、渗出等现象，被鱼糜浸湿的胶原膜触感柔软，不易破裂，表现出一定的弹性和拉伸性，因此，样本能够作为包装材料应用于实际生产和生活中。

表1展示了冷藏贮藏期间(4℃，0-8天)鱼糜内部(除去膜)的菌落总数变化。

表1.纳米胶原蛋白膜包裹的鳕鱼糜内部菌落总数

由上表可以看出，在第2天，各组样本的差异较明显，其中，添加单宁- 漆酶的样本数值与阳性对照组(ε-聚赖氨酸盐酸盐组)均较小，其原因为在贮藏的最初阶段，胶原膜中的漆酶和单宁能够缓慢向鱼糜内部释放，抑制了内部微生物的生长和繁殖。同时，这些胶原膜也能有效阻止外部微生物进入鱼糜，从而控制鱼糜中微生物缓慢增长。

在整个贮藏期间，阴性对照组的菌落总数在所有样本中最高，表明制备的纳米胶原膜能够有效防止空气和操作面上的微生物在鱼糜表面定殖，进而减少鱼糜内部微生物数量。添加单宁-漆酶的鱼糜中菌落总数增长较为缓慢，能够达到阳性对照组的相应水平。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(3)利用水解法对单宁进行水解，得到单宁水解物；

(4)向所述纳米尺寸胶原预成膜液中添加所述单宁水解物和漆酶，并于0-10℃、100-200rpm条件下振荡交联2-8h，然后成膜、固化、干燥，得到单宁水解物-纳米胶原蛋白膜；

步骤(4)中所述单宁水解物、漆酶与纳米尺寸胶原的添加比为(1-100)mg:(2-100)U:1g；

所述大尺寸胶原蛋白直径为1mm；

步骤(3)中所述水解法为酸水解法，其中包括以下步骤：

先将单宁溶解于1mol/L硫酸溶液中，配置浓度为20mg/mL的酸性溶液；然后在惰性气体保护下，保持酸性溶液温度100℃，搅拌速度100-200rpm，时间2-20h，得到单宁水解液；再将所述单宁水解液在37℃条件下蒸发浓缩至蒸发前体积的10％，再于65℃惰性气体条件下吹至干燥，得到单宁水解物。

2.根据权利要求1所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原蛋白原料包括牛皮、羊皮、鸡皮、家兔和鱼鳞中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述纳米尺寸胶原预成膜液包括纳米尺寸胶原和胶原纤维，所述纳米尺寸胶原直径为10-100nm，所述胶原纤维直径≥1μm。

4.根据权利要求1所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述单宁来源于五倍子。

5.根据权利要求1所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述漆酶来源于细菌、真菌以及漆树。

6.根据权利要求1所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(4)中成膜方式为浇铸法或挤出法。

7.一种如权利要求1-6任一所述的一种纳米胶原蛋白膜的制备方法制备的纳米胶原蛋白膜在肠衣中的应用。