CN112940302B - 金属离子介导的胶原蛋白凝胶、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种金属离子介导的胶原蛋白凝胶、制备方法及应用。本发明通过将胶原蛋白溶液和铁离子或亚铁离子溶液混合反应制备胶原蛋白凝胶。与传统的方法相比，该方法不涉及有毒化学试剂，绿色环保，同时铁元素为人体必需元素，安全性好；该方法能够最大程度地保证胶原蛋白的原有活性，且能显著提高胶原蛋白的力学强度；以该方法制备获得的胶原蛋白凝胶材料无细胞毒性，且具有优良的细胞黏附能力，在临床中有良好的应用潜力。

Description

金属离子介导的胶原蛋白凝胶、制备方法及应用

本申请要求申请日为2020年8月26日、申请号为CN202010873029.6、发明名称为“金属离子介导的胶原蛋白凝胶、制备方法及应用”的中国在先申请的优先权，该在先申请的全部内容均已在本申请中体现。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种金属离子介导的胶原蛋白凝胶、制备方法及应用。

背景技术

水凝胶作为生物医用材料，在药物的递送及可控释放、医用敷料、化妆品等领域广为应用。胶原蛋白由于其良好的生物活性、生物相容性、可生物降解性等优良性质，被制备成胶原蛋白凝胶、胶原海绵、胶原膜等各种形式。其中，胶原蛋白凝胶是一种由亲水大分子交联而成的立体三维网络，它具有良好的亲水性和溶胀性能、理想的柔性和弹性、以及较低的表面张力等特殊性质，与活体组织的结构和性质非常相似，因此在生物医学领域备受关注。

高浓度的胶原蛋白可以自组装形成凝胶，但是该凝胶存在力学性能较差、降解较快等缺陷，因此，常用化学交联剂对胶原蛋白进行交联，来改善胶原蛋白凝胶的力学性质，但是交联剂的添加会引发生物毒性等问题。其中，中国专利CN101543643B以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺为原料，利用碳二亚胺对胶原进行交联制备胶原基复合角膜替代物，该方法中交联剂等化学试剂的残留，会导致严重的安全隐患；中国专利CN103554527B利用糖胺聚糖氧化形成醛基与胶原蛋白混合，通过糖胺聚糖中的醛基与胶原蛋白中的氨基进行交联反应，制备胶原蛋白水凝胶，该方法涉及糖胺聚糖醛基化和酰肼化，制备水凝胶步骤繁琐，生产周期长，且制备中需使用多种化学试剂，会导致细胞毒性。因此，亟需开发一种简单、易控、安全、绿色环保、且能显著改善力学性能的胶原蛋白凝胶的制备方法。

铁是人体必需的微量元素，是构成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素和多种氧化酶的重要成分，在人体很多重要的生理过程中发挥关键作用。发明人意外发现，将胶原蛋白溶液与三价铁离子或二价铁离子溶液混合反应，可制备出具有良好力学性质和细胞粘附性能的胶原蛋白凝胶。该方法与其他方法相比，操作简单、条件温和、绿色环保，既能保持胶原蛋白的生物活性，又可显著改善胶原蛋白的力学性能；并且铁元素为人体必需元素，安全性高，制备的胶原蛋白凝胶可用于胶原膜、胶原海绵、止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料等生物材料。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种胶原蛋白的交联方法，所述方法为：将胶原蛋白溶液与金属离子溶液混合反应，所述金属离子为Fe³⁺或Fe²⁺。

优选地，所述胶原蛋白为动物胶原蛋白，所述动物胶原蛋白是指从动物组织中提取的获得的天然胶原蛋白。

优选地，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，和/或Ⅱ型胶原蛋白，和/或Ш型胶原蛋白。

优选地，所述胶原蛋白为牦牛I型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅱ型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅲ型胶原蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种胶原蛋白凝胶的制备方法，所述方法为：将胶原蛋白溶液与金属离子溶液混合反应，所述金属离子为Fe³⁺或Fe²⁺。

优选地，所述胶原蛋白为动物胶原蛋白，所述动物胶原蛋白是指从动物组织中提取的获得的天然胶原蛋白。

优选地，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，和/或Ⅱ型胶原蛋白，和/或Ш型胶原蛋白。

优选地，所述胶原蛋白为牦牛I型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅱ型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅲ型胶原蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种上述方法制备获得的胶原蛋白凝胶。

本发明的另一目的在于提供一种胶原蛋白凝胶在制备胶原膜、胶原海绵、止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种胶原膜，所述胶原膜由胶原蛋白凝胶真空干燥获得，所述干燥温度不高于胶原蛋白的变性温度。

本发明的另一目的在于提供一种胶原海绵，所述胶原海绵由胶原蛋白凝胶冷冻干燥获得。

本发明的另一目的在于提供一种胶原膜的制备方法，所述方法为：根据上述方法制备获得胶原蛋白凝胶，将所述胶原蛋白凝胶真空干燥即得胶原膜，所述干燥温度不高于胶原蛋白的变性温度。

本发明的另一目的在于提供一种胶原海绵的制备方法，所述方法为：根据上述方法制备获得胶原蛋白凝胶，将所述胶原蛋白凝胶冷冻干燥即得网状的胶原海绵。

本发明的有益效果是：①本发明提供的方法不涉及有毒化学试剂，绿色环保，不需要额外光源照射，条件简单温和；②本发明所述方法制备的胶原蛋白凝胶性质稳定，可以保持完整的三重螺旋结构，没有变性风险；③本发明制备的胶原蛋白凝胶具有良好的力学性质和细胞粘附性能，并且铁元素为人体必需元素，安全性高，完全消除了生物毒性隐患，可广泛用于制备胶原膜、胶原海绵、止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料等生物材料。

附图说明

图1胶原蛋白及其胶原蛋白-Fe凝胶图，其中，a和a’为I型胶原蛋白溶液，b和b’为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，c和c’为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，d和d’为II型胶原蛋白溶液，e和e’为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，f和f’为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶；

图2胶原蛋白及其胶原蛋白-Fe凝胶的流变力学性能，其中，A为I型胶原蛋白凝胶，a和a’为I型胶原蛋白的储能模量和损耗模量，b和b’为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶的储能模量和损耗模量，c和c’为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶的储能模量和损耗模量；B为II型胶原蛋白凝胶，a和a’为II型胶原蛋白的储能模量和损耗模量，b和b’为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶的储能模量和损耗模量，c和c’为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶的储能模量和损耗模量；

图3胶原蛋白及其胶原蛋白-Fe凝胶的细胞毒性，其中，A为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，B为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，C为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，D为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶；

图4胶原蛋白及其胶原蛋白-Fe凝胶的细胞粘附，其中，A和E为BSA，B为I型胶原蛋白，C为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，D为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，F为II型胶原蛋白，G为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，H为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶；

图5胶原蛋白及其Fe介导的胶原蛋白海绵的SEM图，其中，图中A为I型胶原蛋白，B为I型胶原蛋白-Fe²⁺，C为I型胶原蛋白-Fe³⁺；D为II型胶原蛋白，E为II型胶原蛋白-Fe²⁺，F为II型胶原蛋白-Fe³⁺；

图6Fe介导的胶原蛋白成膜结果图，其中，A-C为I型胶原蛋白-Fe³⁺胶原蛋白膜，D-F为I型胶原蛋白-Fe²⁺胶原蛋白膜。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

以下一个或多个实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下一个或多个实施例中所述的胶原蛋白属于生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，由三条具有左手螺旋结构的多肽链相互缠绕形成右手螺旋结构。

以下一个或多个实施例中所述的胶原蛋白可以为天然胶原蛋白、重组胶原蛋白以及仿生胶原蛋白等各种天然来源或其他方式制备的胶原蛋白，优选动物胶原蛋白(天然胶原蛋白)，更优选动物I型胶原蛋白、动物Ⅱ型胶原蛋白、动物Ш型胶原蛋白；更优选牦牛I型胶原蛋白、牦牛Ⅱ型胶原蛋白、牦牛Ⅲ型胶原蛋白。

以下一个或多个实施例中所述的Fe³⁺溶液为氯化铁溶液，任何以其他可溶性铁盐配置的Fe³⁺溶液均可用于介导胶原蛋白凝胶的形成。

以下一个或多个实施例中所述的Fe²⁺溶液为硫酸亚铁溶液，任何以其他可溶性铁盐配置的Fe²⁺溶液均可用于介导胶原蛋白凝胶的形成。

以下一个或多个实施例均在室温条件下进行，但是需要说明的是，本发明在不影响胶原蛋白稳定性和活性的基础上制备了胶原蛋白凝胶，因此，在能够维持胶原蛋白稳定性和活性的温度下均可制备胶原蛋白凝胶。

以下一个或多个实施例中所述的胶原蛋白凝胶是指在Fe³⁺或Fe²⁺溶液介导下制备的胶原蛋白凝胶。

以下一个或多个实施例中所制备的胶原蛋白凝胶具有良好的力学性能，可用于制备止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料等生物材料。

以下一个或多个实施例中未对反应pH值进行特殊说明的，反应pH值均为胶原蛋白溶液本身的pH。

以下一个或多个实施例中以硫酸亚铁和氯化铁水溶液为Fe²⁺和Fe³⁺的来源，但并不局限于硫酸亚铁和氯化铁水溶液，其他能够提供Fe²⁺和Fe³⁺的溶液均可作为Fe²⁺和Fe³⁺的来源。并且在本发明，所述硫酸亚铁和氯化铁与胶原蛋白的浓度比分别为0.25-13:1和0.005-1:1时均能交联形成胶原蛋白-Fe凝胶，并可成功制备出胶原蛋白海绵、胶原蛋白膜等生物材料。因此，当Fe²⁺和Fe³⁺与胶原蛋白的摩尔浓度比分别为500:3-10000:1和10:3-2000:3时均能交联形成胶原蛋白-Fe凝胶，并可成功制备出胶原蛋白海绵、胶原蛋白膜等生物材料。但是本发明并不局限于上述摩尔浓度比，只要在引入Fe²⁺和Fe³⁺后，能够介导胶原蛋白形成凝胶的Fe²⁺和Fe³⁺与胶原蛋白的浓度比均在本发明的保护范围之内。

实施例1胶原蛋白-Fe凝胶的制备

取一定量的硫酸亚铁(现配现用)和氯化铁分别配置成一定浓度的硫酸亚铁和氯化铁水溶液。在pH为4.5-7.0的10mg/ml胶原蛋白溶液中分别加入13mg/ml硫酸亚铁和0.3mg/ml氯化铁水溶液配制牦牛胶原蛋白-Fe³⁺混合溶液及牦牛胶原蛋白-Fe²⁺混合溶液，室温放置0.5-12h使其形成凝胶。

胶原蛋白及其胶原蛋白-Fe形成凝胶的结果图如图1所示，其中，a和a’为I型胶原蛋白溶液，b和b’为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，c和c’为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，d和d’为II型胶原蛋白溶液，e和e’为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，f和f’为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶。结果表明，牦牛I型胶原蛋白溶液和II型胶原蛋白溶液在室温放置0.5-12h后仍然为呈可流动的溶液状态，即，未发生交联；而在牦牛I型胶原蛋白溶液和II型胶原蛋白溶液中加入Fe³⁺/Fe²⁺，室温放置0.5-12h后牦牛I型胶原蛋白溶液变成不可流动的凝胶状态，即形成胶原蛋白凝胶。上述结果表明，在Fe³⁺/Fe²⁺的介导下，胶原蛋白溶液交联形成胶原蛋白凝胶。

实施例2胶原蛋白-Fe凝胶的流变力学性能测定

根据实施例1制备薄厚均一的1cm×1cm×1mm的胶原蛋白-Fe凝胶，然后将其置于流变仪的样品台上，固定流变仪的扫描频率，测试凝胶随应变变化的储存模量G’(Pa)及损耗模量G”(Pa)。

结果如图2所示，其中，A为I型胶原蛋白凝胶，a和a’为I型胶原蛋白的储能模量和损耗模量，b和b’为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶的储能模量和损耗模量，c和c’为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶的储能模量和损耗模量；B为II型胶原蛋白凝胶，a和a’为II型胶原蛋白的储能模量和损耗模量，b和b’为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶的储能模量和损耗模量，c和c’为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶的储能模量和损耗模量A-a和A-a’为I型胶原蛋白的储能模量和损耗模量，A-b和A-b’为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶的储能模量和损耗模量。根据实验结果得出，与I型胶原蛋白溶液相比，Fe²⁺和Fe³⁺介导的I型胶原蛋白凝胶的储能模量(G’)分别增加了71Pa和22Pa，表明其力学性能增强；与II型胶原蛋白凝胶相比，Fe²⁺和Fe³⁺介导的II型胶原蛋白凝胶的储能模量(G’)分别增加了255Pa和122Pa，表明其力学性能显著增强。

实施例3胶原蛋白-Fe凝胶的细胞毒性

将完全贴壁生长的HeLa细胞用0.25％胰酶消化，用完全培养液(1％FBS，2％Penicillin–Streptomycin，DMEM培养基)配制成细胞密度为1×10⁵个/mL的细胞悬液。分别移取100μL细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h。吸出完全培养液，在实验组中加入经高糖DMEM培养基稀释的Fe²⁺和Fe³⁺介导的胶原蛋白凝胶(胶原蛋白凝胶的终浓度分别为30μg/ml，3μg/ml和0.3μg/ml)，以加入胶原蛋白溶液的细胞作为对照组，空白组为DMEM培养基培养的细胞，继续于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h。最后向各组加入CCK-8试剂，在细胞培养箱内孵育1-4h，使用酶标仪在450nm波长下测各孔吸光度值(OD值)。其胞存活率(％)＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100％。

实验结果如图3所示，其中，A为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，B为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，C为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，D为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶。结果表明，I型胶原蛋白和II型胶原蛋白溶液在Fe³⁺/Fe²⁺介导下形成的胶原凝胶无细胞毒性，安全性良好。

实施例4胶原蛋白-Fe凝胶的细胞粘附

用PBS将Fe²⁺和Fe³⁺介导的胶原蛋白凝胶稀释10倍，选用未TC处理的24孔细胞培养板，分别用1％的BSA，300μg/ml的胶原蛋白和300μg/ml的Fe²⁺和Fe³⁺介导的胶原蛋白凝胶处理孔板，每孔加入300μL样品，并于4℃冰箱中孵育24h。之后将HeLa细胞用高糖DMEM培养基配制成细胞密度为1×10⁵个/mL的细胞悬液。将24孔板中的液体吸出，每孔加入300μL细胞悬液，在细胞培养箱中培养5h后，通过倒置显微镜观察细胞黏附效果。

结果如图4所示，其中，A和E为BSA，B为I型胶原蛋白，C为I型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，D为I型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶，F为II型胶原蛋白，G为II型胶原蛋白-Fe³⁺凝胶，H为II型胶原蛋白-Fe²⁺凝胶。结果表明，在相同的细胞培养条件下，BSA中的细胞状态为圆形，说明细胞基本无贴壁，BSA的细胞粘附性能差；I型胶原蛋白和II型胶原蛋白溶液中细胞状态大多数为梭型，说明细胞平铺生长在胶原蛋白上，胶原蛋白具有良好的细胞粘附性能；Fe²⁺和Fe³⁺介导的胶原蛋白凝胶的细胞状态和胶原蛋白的相似，说明也具有良好的细胞粘附性能。

实施例5 Fe介导的胶原蛋白海绵的制备

取一定量的硫酸亚铁(现配现用)和氯化铁分别配置成一定浓度的硫酸亚铁和氯化铁水溶液。在pH为4.5-7.0的5mg/ml胶原蛋白溶液中分别加入13mg/ml硫酸亚铁和1mg/ml氯化铁水溶液配制牦牛胶原蛋白-Fe³⁺混合溶液及牦牛胶原蛋白-Fe²⁺混合溶液，真空干燥箱进行低温脱泡后，室温放置0.5-12h使其形成凝胶，之后低温预冻14h，抽真空冷冻干燥24h，即可形成Fe介导的胶原海绵。

将制备的胶原海绵样品固定在扫描电子显微镜的样品台上，喷金25秒，然后用扫描电子显微镜在操作电压5.0kV下检测样品形貌。胶原蛋白-Fe海绵的扫描电子显微镜(SEM)结果如图5所示，其中，A为I型胶原蛋白，B为I型胶原蛋白-Fe²⁺，C为I型胶原蛋白-Fe^{3 +}；D为II型胶原蛋白，E为II型胶原蛋白-Fe²⁺，F为II型胶原蛋白-Fe³⁺。上述结果表明，在Fe^{3 +}/Fe²⁺的介导下形成的胶原海绵呈现出网孔状结构，具有较大的比表面积，可为细胞增殖、分化提供良好的场所。

实施例6 Fe介导的胶原蛋白膜的制备

取一定量的硫酸亚铁(现配现用)和氯化铁分别配置成一定浓度的硫酸亚铁和氯化铁水溶液。在pH为4.5-7.0的3mg/ml胶原蛋白溶液中分别加入7.5mg/ml硫酸亚铁和0.5mg/ml氯化铁水溶液配制牦牛胶原蛋白-Fe³⁺混合溶液及牦牛胶原蛋白-Fe²⁺混合溶液，真空干燥箱进行低温脱泡后，室温放置0.5-12h使其形成凝胶，之后27℃烘箱干燥24h以上，即可形成Fe介导的胶原膜。

胶原蛋白成膜结果如图6所示，其中，A-C为I型胶原蛋白-Fe³⁺，D-F为I型胶原蛋白-Fe²⁺。从B-C和D-F可以看出，在Fe³⁺/Fe²⁺的介导下，胶原蛋白形成了质地均匀、平滑完整的柔性胶原膜；并且从A和D可以看出，通过Fe³⁺/Fe²⁺的介导下形成的胶原蛋白膜能够清楚的看到位于胶原蛋白膜底下的文字信息，说明Fe³⁺/Fe²⁺的介导下形成的胶原蛋白膜具有良好的透光性。上述结果表明，在Fe³⁺/Fe²⁺的介导下，可形成质地均匀、平滑完整的柔性胶原膜，且具有较好的透光性。

上述实施例仅以牦牛I型或牦牛Ⅱ型胶原蛋白为例，制备了胶原蛋白凝胶、胶原蛋白海绵及胶原蛋白膜，所述方法同样适用于其他胶原蛋白(包括Ⅲ型胶原蛋白)，并可用于制备其他生物材料，包括止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料等。

上述实施例以硫酸亚铁和氯化铁水溶液为Fe²⁺和Fe³⁺的来源，但并不局限于硫酸亚铁和氯化铁水溶液，其他能够提供Fe²⁺和Fe³⁺的溶液均可作为Fe²⁺和Fe³⁺的来源。并且在所述硫酸亚铁和氯化铁与胶原蛋白的浓度比分别为0.25-13:1和0.005-1:1时均能交联形成胶原蛋白-Fe凝胶，并可成功制备出胶原蛋白海绵、胶原蛋白膜等生物材料。因此，当Fe²⁺和Fe³⁺与胶原蛋白的摩尔比分别为500:3-10000:1和10:3-2000:3均能交联形成胶原蛋白-Fe凝胶，并可成功制备出胶原蛋白海绵、胶原蛋白膜等生物材料。但是本发明并不局限于上述浓度比例范围，任何能够介导胶原蛋白交联的任何浓度比均在本发明的保护范围之内。

综上，本发明通过胶原蛋白溶液和Fe³⁺或Fe²⁺离子溶液在室温下混合反应制备获得胶原蛋白凝胶，该方法条件温和，操作简单，且使用的铁元素为人体必需元素，不需添加任何化学交联剂，安全性好，完全排除生物毒性风险；制备的胶原蛋白凝胶能够保持完整的三重螺旋结构，且具有良好的力学性质和细胞粘附性能，可广泛用于制备胶原膜、胶原海绵、止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料中的生物材料。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法为：将胶原蛋白溶液与金属离子溶液混合反应，所述金属离子为Fe³⁺或Fe²⁺；所述胶原蛋白溶液pH为4.5-7.0。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白为动物胶原蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，和/或Ⅱ型胶原蛋白，和/或Ш型胶原蛋白。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白为牦牛I型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅱ型胶原蛋白，和/或牦牛Ⅲ型胶原蛋白。

5.根据权利要求1-4任一所述方法制备获得的胶原蛋白凝胶。

6.如权利要求5所述的胶原蛋白凝胶在制备胶原膜、胶原海绵、止血材料、药物缓释载体、组织工程支架、人工皮肤、人工血管、骨修复材料、角膜移植材料中的应用。

7.一种胶原膜，其特征在于，所述胶原膜由权利要求5所述的胶原蛋白凝胶真空干燥获得，所述干燥温度不高于胶原蛋白的变性温度。

8.一种胶原海绵，其特征在于，所述胶原海绵由权利要求5所述胶原蛋白凝胶冷冻干燥获得。

9.一种胶原膜的制备方法，其特征在于，所述方法为：根据权利要求1-4任一所述方法制备获得胶原蛋白凝胶，将所述胶原蛋白凝胶真空干燥即得胶原膜，所述干燥温度不高于胶原蛋白的变性温度。

10.一种胶原海绵的制备方法，其特征在于，所述方法为：根据权利要求1-4任一所述方法制备获得胶原蛋白凝胶，将所述胶原蛋白凝胶冷冻干燥即得网状的胶原海绵。

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