CN112939895B - 一种甘氨酰胺类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种甘氨酰胺类衍生物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种甘氨酰胺类衍生物及其制备方法和应用，提供了结构式如下式（I）所示的衍生物，式中R1选自Cl、H；R2选自H、CH3、CH2CH3中的一种；X选自NHCH3、NHCH2CH3、N(CH2CH3)2、吡咯基、哌啶基中的一种。制备时选择不同的苯基戊二酸化合物为原料，分别与氨基茚满盐酸盐衍生物和乙二胺衍生物通过两次酰胺化反应得到目标衍生物。制得的衍生物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物作为S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂，用于抗肿瘤药物的开发。
Description
技术领域
本发明属于新药设计及合成领域，具体是一种甘氨酰胺类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
迄今为止，在全球范围内癌症仍然是导致人类死亡的重要因素，严重危害着人们的健康。目前，恶性肿瘤的发病率和致死率在全球范围内不断上升，在我国主要致死的恶性肿瘤有肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌。多药耐药是导致恶性肿瘤化疗失败、临床治疗无效的主要原因之一，如何克服肿瘤细胞耐药是肿瘤治疗领域面临的一大难题，因此开发新型的抗肿瘤药物用于治疗恶性肿瘤疾病迫在眉睫。
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)催化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)，这是S-腺苷同型半胱氨酸在哺乳动物体内唯一代谢途径。S-腺苷同型半胱氨酸是所有依赖S-腺苷同型甲硫氨酸(SAM)的转甲基反应的产物。SAHase在调节生物体甲基化反应中处于核心地位，研究发现SAHase抑制剂通过抑制SAHase可逆水解成SAH过程，可以影响生物体内DNA的甲基化水平。DNA甲基化对于癌症的发生和发展起到至关重要的作用，DNA甲基化诱导的肿瘤抑制因子沉默在癌症中很常见。由于SAM和SAH是一些DNA甲基转移酶(DNMT)反应中必不可少的底物和产物，当SAH升高或SAM降低都可以导致SAM/SAH的比率降低，只有当SAH升高时，SAM/SAH的比率降低，预示着甲基化能力降低，从而影响DNA甲基化。DNMT抑制剂氮杂胞苷可以通过逆转DNA甲基化而下调原癌基因的表达。SAH是DNMT的有效竞争性抑制剂，与DNMT的催化区域具有很高的结合亲和力，可导致DNA低甲基化和抑癌基因表达的改变。近年来，通过调控生物体甲基化水平，来达到抑制肿瘤细胞的作用，该研究方向受到越来越多的关注。
近年来研究发现SAHase抑制剂具有良好的抗肿瘤活性，对多种人肿瘤细胞株都具有较强的抑制活性，包括肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞等。天然存在的腺苷类SAHase抑制剂，表现出显著的抗肿瘤活性(Yaginuma S,et al.JAntibiot,1981,34:359-366；Zhang L,et al.Oncotarget,2014,5(21):10665-10677)。人工化学合成的腺苷类化合物的抗肿瘤活性也有报道(Aury-Landas J,et al.Cell PhysiolBiochem,2019,53(4):731-745)。近年来人们对天然腺苷类SAHase抑制剂进行了大量的结构改造，改造的基团主要集中在腺嘌呤环、碱基、糖基上。相关文献报道了腺苷类SAHase抑制剂具有免疫抑制、降低同型半胱氨酸水平等生物活性，例如：CN1565453A，WO2009108546等。也有文献报道了一类非腺苷类甘氨酰胺衍生物具有较强SAHase抑制活性(Nakao A,etal.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2014,24(17):4336-4340；Tan X,etal.Chem Pharm Bull(Tokyo),2014,62(1):112-117；EP2275404)。但到目前为止，未见任何文献和专利报道甘氨酰胺类SAHase抑制剂具有抗肿瘤活性。
发明内容
为开拓临床药物的资源，本发明的目的是提供一种甘氨酰胺类衍生物及其制备方法和应用，选择不同的苯基戊二酸为原料，分别与氨基茚满衍生物和乙二胺衍生物通过两次酰胺化反应得到目标衍生物。从而将其作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂，用于抗肿瘤药物的开发。
实现本发明目的的技术方案是：
一种甘氨酰胺类衍生物，结构式如式(I)所示，
式中R1选自Cl或H；
R2选自H、CH3和CH2CH3中的一种；
X选自NHCH3、NHCH2CH3、N(CH2CH3)2、吡咯基和哌啶基中的一种。
式(I)所示衍生物的制备路线如下：
制备方法为：
在有机溶剂中，2-氨基茚满V与乙酸酐(Ac2O)或二碳酸二叔丁酯(Boc2O)发生酰胺化反应制备得到化合物VI，化合物VI再与氢化铝锂发生还原反应制备得到化合物22或23；
将苯基戊二酸衍生物II与乙酸酐(Ac2O)发生缩合反应，得到中间体环状醋酐III；
在有机溶剂中，中间体环状醋酐III与2-氨基茚满V或化合物22或化合物23进行酰胺化反应，制备得到化合物IV，化合物IV再与乙二胺衍生物(VII)发生酰胺化反应，制备得到式(I)所示衍生物。
制备方法中，有机溶剂为无水四氢呋喃、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种；缩合反应温度为90-100℃；酰胺化反应温度为室温，优选温度为25℃，反应时间为6～24小时，优选反应时间是12小时；
所述苯基戊二酸衍生物(II)与2-氨基茚满(V)或化合物22或化合物23、乙二胺衍生物(VII)的摩尔比为1:1～2:1～2。
采用本发明方法，制得以下衍生物：
本发明第三方面，提供了治疗肿瘤性疾病药物组合物，其中包括式(I)、所述的衍生物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
本发明第四方面，提供了将如式(I)所示衍生物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂的应用。
此外，本发明提供了将如式(I)所示衍生物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在制备治疗肿瘤性疾病药物中的应用。
本发明的如式(I)所示的衍生物及其药学上可接受的盐在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比1～70％，较佳的为质量百分比1～30％。
本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药，例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。
本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。通常的给药剂量可为：约0.1～300mg药物活性成分/kg体重/天。一般来说，每个给药单位剂型可含1～200mg的药物活性成分。
本发明公开了一种甘氨酰胺类衍生物在作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂的独特用途，重点进行了体外抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶活性研究、体外抑制肿瘤细胞活性研究，证实了本发明所述的化合物具有S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制活性，同时具有体外抗肿瘤活性。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1：化合物22-23的制备
将化合物2,3-二氢-1H-茚满-2-胺盐酸盐(V，0.012mol)、三乙胺(0.035mol)，二碳酸二叔丁酯(0.013mol)溶于二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌3h，反应完全后，加入水(20mL×2)洗涤，饱和食盐水洗涤1次，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得白色固体中间体；
在反应瓶中，先加入LiAlH4(0.024mol)，氮气保护，在冰浴下慢慢加入无水四氢呋喃(25mL)，然后将白色固体中间体溶于无水四氢呋喃(35mL)后，在冰浴下，慢慢滴加入反应瓶中；
滴毕，加热至回流，反应完全后，冷却至室温，将反应液倾倒入10％的氢氧化钠水溶液(120mL)中，然后用二氯甲烷(60mL×3)萃取，饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干后加入乙酸乙酯(100mL)，搅拌，用6mol/L的HCl/甲醇溶液调节pH到2，有大量固体析出，冰水冷却，过滤，烘干得化合物22，收率64％；
ESI-MS m/z:148.11[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6+D2O)δ:7.26-7.18(m,4H),3.95-3.91(m,1H),3.28-3.26(m,2H),3.07-3.01(m,2H),2.59(s,3H)。
将化合物2,3-二氢-1H-茚满-2-胺盐酸盐(V，0.012mol)、三乙胺(0.035mol)，醋酸酐(0.013mol)溶于二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌3h，反应完全后，加入水(20mL×2)洗涤，饱和食盐水洗涤1次，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得白色固体中间体；
在反应瓶中，先加入LiAlH4(0.024mol)，氮气保护，在冰浴下慢慢加入无水四氢呋喃(25mL)，然后将白色固体中间体溶于无水四氢呋喃(35mL)后，在冰浴下，慢慢滴加入反应瓶中；
滴毕，加热至回流，反应完全后，冷却至室温，将反应液倾倒入10％的氢氧化钠水溶液(120mL)中，然后用二氯甲烷(60mL×3)萃取，饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干后加入乙酸乙酯(100mL)，搅拌，用6mol/L的HCl/甲醇溶液调节pH到2，有大量固体析出，冰水冷却，过滤，烘干得化合物23，收率52％；
ESI-MS m/z:162.14[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6+D2O)δ:7.26-7.17(m,4H),4.00-3.94(m,1H),3.32(q,J＝7.2Hz,2H),3.04-2.98(m,4H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例2：化合物1-5的制备
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，然后浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)、三乙胺(10.3mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和1-(2-氨基乙基)哌啶(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物1。
化合物1：Rf(CHCl3/MeOH＝15:1,v/v):0.56；收率40.2％；白色固体,mp 186.3-188.1℃；ESI-MS m/z:468.43[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.02(d,J＝7.1Hz,1H),7.64(s,1H),7.28(d,J＝8.5Hz,2H),7.22–7.08(m,6H),4.43–4.23(m,1H),3.56–3.43(m,1H),3.28–2.85(m,4H),2.50(dt,J＝3.5,1.7Hz,2H),2.43–2.28(m,8H),2.13(s,2H),1.52–1.40(m,4H),1.34(s,2H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.57,170.54,143.10,141.65,141.61,131.13,129.83,128.30,126.78,124.89,58.09,54.38,50.01,42.15,42.00,39.43,38.92,36.48,25.85,24.38。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，然后浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)、三乙胺(10.3mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N,N-二乙基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物2。
化合物2：Rf(CHCl3/MeOH＝15:1,v/v):0.53；收率34.3％；白色固体,mp 150.2-153.3℃；ESI-MS m/z:456.44[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.01(d,J＝7.1Hz,1H),7.60(t,J＝5.5Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.21–7.03(m,6H),4.47–4.22(m,1H),3.61–3.39(m,1H),3.17–2.79(m,4H),2.50(dd,J＝3.5,1.7Hz,2H),2.45–2.26(m,8H),2.21(t,J＝6.2Hz,2H),0.88(t,J＝7.1Hz,6H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.52,143.10,141.65,141.61,131.11,129.84,128.29,126.78,124.89,124.88,52.12,50.00,47.02,42.14,42.02,39.43,38.89,37.26,12.18。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，然后浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)、三乙胺(10.3mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N-乙基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物3。
化合物3：Rf(CHCl3/MeOH＝15:1，v/v):0.43；收率31.5％；白色固体，mp 158.5-161.0℃；ESI-MS m/z:428.39[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝7.1Hz,1H),8.00(t,J＝5.7Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.21–7.17(m,3H),7.14(m,3H),4.39–4.26(m,1H),3.60–3.44(m,1H),3.26–3.14(m,2H),3.12–2.98(m,2H),2.90(q,J＝7.2Hz,2H),2.81(d,J＝3.2Hz,2H),2.53–2.49(m,2H),2.46–2.36(m,4H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)；13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.81,170.54,143.11,141.62,141.57,131.23,129.77,128.43,126.82,124.90,50.03,46.31,42.48,42.11,41.89,39.42,38.65,35.59,11.4。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，然后浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)、三乙胺(10.3mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物4。
化合物4：Rf(CHCl3/MeOH＝15:1，v/v):0.54；收率37.7％；白色固体，mp 151.6-154.3℃；ESI-MS m/z:454.42[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝7.1Hz,1H),7.89(s,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),7.24–7.08(m,6H),4.43–4.19(m,1H),3.53-3.47(m,1H),3.20–2.94(m,4H),2.66(dd,J＝16.0,5.5Hz,4H),2.56–2.46(m,4H),2.45–2.30(m,4H),1.72(s,4H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.90,170.52,143.07,141.65,141.61,131.15,129.87,128.33,126.79,124.89,124.88,54.61,53.81,50.02,42.07,42.03,39.41,38.83,23.34。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，然后浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)、三乙胺(10.3mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N-甲基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物5。
化合物5：Rf(CHCl3/MeOH＝15:1，v/v):0.42；收率24.3％；白色固体，mp 90.0-92.5℃；ESI-MS m/z:414.33[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝7.1Hz,1H),7.94(t,J＝5.5Hz,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.21–7.06(m,6H),4.44–4.25(m,1H),3.61–3.37(m,1H),3.14–2.99(m,4H),2.66–2.53(m,2H),2.52–2.36(m,6H),2.32(s,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.12,170.53,143.11,141.65,131.15,129.82,128.34,126.79,124.88,50.03,49.70,42.00,39.40,38.78,37.01,34.54。
实施例3：化合物6-9的制备
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)哌啶(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干粗品，得到黄色固体。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物6。
化合物6：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1,v/v):0.45；收率32.6％；白色固体，mp 163.5-166.7℃；ESI-MS m/z:434.51[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝7.1Hz,1H),7.61(t,J＝5.6Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,2H),7.19–7.09(m,7H),4.47–4.17(m,1H),3.58–3.43(m,1H),3.03(m,4H),2.50(dt,J＝3.5,1.7Hz,2H),2.42-2.31(m,4H),2.23(s,4H),2.12(td,J＝6.8,2.1Hz,2H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.75,144.29,141.67,141.65,128.38,127.87,126.77,126.51,124.88,58.20,54.46,49.98,42.34,42.17,39.56,39.46,39.31,36.59,25.98,24.50。
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干粗品，得到黄色固体。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物7。
化合物7：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.54；收率34.3％；白色固体，mp 154.9-156.8℃；ESI-MS m/z:420.46[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝7.1Hz,1H),7.69(t,J＝5.5Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,2H),7.19–7.10(m,7H),4.40–4.25(m,1H),3.58–3.39(m,1H),3.11-2.96(m,4H),2.50(dt,J＝3.5,1.7Hz,2H),2.42–2.28(m,10H),1.64(dt,J＝6.4,3.3Hz,4H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.82,170.75,144.28,141.67,141.64,128.38,127.88,126.78,126.51,124.88,55.24,53.97,49.99,42.27,42.21,39.45,39.28,38.09,23.55。
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和N-乙基乙二胺(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干粗品，得到黄色固体。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物8。
化合物8：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.42；收率26.2％；白色固体，mp 143.7-146.8℃；ESI-MS m/z:394.46[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.02(d,J＝7.1Hz,1H),7.75(t,J＝5.6Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,2H),7.20–7.06(m,7H),4.40–4.26(m,1H),3.59–3.45(m,1H),3.14–2.93(m,4H),2.52–2.48(m,4H),2.45–2.32(m,6H),1.23(s,1H),0.96(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.02,170.72,144.23,141.67,141.64,128.39,127.87,126.78,126.55,124.88,50.00,48.49,43.38,42.33,42.26,39.46,39.32,38.46,14.91。
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和N,N-二乙基乙二胺(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干粗品，得到黄色固体。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物9。
化合物9：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.57；收率34.8％；白色固体，mp 144.8-146.1℃；ESI-MS m/z:422.51[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝7.1Hz,1H),7.60(t,J＝5.5Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,2H),7.19–7.07(m,7H),4.46–4.12(m,1H),3.60–3.41(m,1H),3.15–2.91(m,4H),2.55–2.48(m,2H),2.44–2.30(m,8H),2.24(t,J＝6.2Hz,2H),0.89(t,J＝7.1Hz,6H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.75,170.73,144.28,141.67,141.65,128.38,127.88,126.78,126.51,124.88,52.11,49.98,47.05,42.31,42.22,39.46,39.28,37.23,12.21。
实施例4：化合物10-13的制备
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和1-(2-氨基乙基)哌啶(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，浓缩至干，得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物10。
化合物10：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.62；收率30.4％；白色固体，mp79.8-82.4℃；ESI-MS m/z:496.47[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.05(s,1H),7.37–7.25(m,4H),7.24–7.02(m,4H),4.89–4.33(m,1H),3.61–3.48(m,1H),3.24–3.03(m,4H),2.99–2.90(m,4H),2.87–2.69(m,4H),2.68–2.54(m,2H),2.52–2.38(m,4H),1.80–1.37(m,6H),1.05–0.87(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.82,170.71,141.74,141.12,131.19,130.08,128.43,126.77,124.78,57.68,55.69,52.81,38.73,36.85,36.35,34.15,29.45,23.12,21.65,16.22,14.69。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/LNaOH调pH＝10，加入60mL水，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物11。
化合物11：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.63；收率32.3％；白色固体，mp 73.3-75.0℃；ESI-MS m/z:482.42[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.02(s,1H),7.45–7.27(m,4H),7.22–6.99(m,4H),4.85–4.63(m,1H),3.63–3.56(m,1H),3.30–3.16(m,4H),3.15–2.97(m,4H),2.94–2.78(m,4H),2.77–2.57(m,2H),2.56–2.39(m,4H),1.86(s,4H),1.05–0.90(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.78,170.73,141.73,141.12,131.19,130.09,128.40,127.05,124.71,57.69,56.19,53.98,38.41,36.85,36.36,35.60,29.45,22.92,16.22,14.69。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N,N-二乙基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物12。
化合物12:Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.59；收率34.2％；白色固体，mp 53.4-57.4℃；ESI-MS m/z:484.46[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝3.7Hz,1H),7.49–7.28(m,4H),7.29–7.12(m,4H),4.85–4.74(m,1H),3.70–3.58(m,1H),3.33–3.27(m,2H),3.14–3.04(m,4H),3.02–2.95(m,4H),2.92–2.80(m,2H),2.75–2.57(m,2H),2.57–2.47(m,2H),1.19–1.14(m,6H),1.09–0.94(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.96,170.30,141.73,141.12,131.20,130.08,128.42,127.05,124.78,57.68,56.19,50.46,47.26,39.24,36.97,36.35,34.29,16.21,14.68,9.12。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N-乙基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物13。
化合物13:Rf(CHCl3/MeOH＝20:1,v/v):0.47；收率32.4％；白色固体，mp 55.3-58.4℃；ESI-MS m/z:456.35[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.98(s,1H),7.37–7.25(m,4H),7.23–7.07(m,4H),4.84–4.64(m,1H),3.61–3.54(m,1H),3.27–3.12(m,4H),2.98–2.87(m,4H),2.85–2.75(m,4H),2.69–2.53(m,2H),2.50(s,2H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H),1.05–0.89(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.93,170.35,141.73,141.12,131.15,130.04,128.43,127.05,124.79,57.69,56.14,46.32,42.48,38.62,36.94,36.34,35.61,16.22,14.69,11.44。
实施例5：化合物14-16的制备
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-甲基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/LNaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物14。
化合物14：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.48；收率29.6％；白色固体，mp 76.8-79.5℃；ESI-MS m/z:434.49[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.30–7.87(m,1H),7.31–7.24(m,4H),7.22–7.10(m,5H),5.35-5.09(m,1H),3.61–3.54(m,1H),3.29–3.23(m,3H),3.09–2.99(m,4H),2.98–2.82(m,4H),2.66(d,J＝9.2Hz,2H),2.61–2.41(m,6H),1.86(s,4H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.98,171.10,144.62,141.66,128.58,128.02,127.01,126.69,124.73,57.07,54.02,52.97,39.35,38.81,36.15,35.67,30.36,27.72,22.96。
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-甲基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)哌啶(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物15。
化合物15：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.57；收率31.7％；白色固体，mp 72.3-75.1℃；ESI-MS m/z:448.48[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.05(s,1H),7.46–7.24(m,4H),7.22–7.03(m,5H),5.45–4.70(m,1H),3.73–3.51(m,1H),3.33(s,3H),3.11–2.95(m,2H),2.94–2.83(m,4H),2.81–2.72(m,2H),2.66(d,J＝9.3Hz,2H),2.62(d,J＝23.2Hz,2H),2.57–2.37(m,4H),1.86–1.30(m,6H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.08,171.06,144.56,141.66,128.58,128.02,126.90,126.69,124.73,57.06,55.79,52.85,36.14,35.84,34.20,30.35,29.47,27.72,23.18,21.65。
在三颈反应瓶中，加入3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-甲基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，加入水(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，9.6mmol)和N,N-二乙基乙二胺(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1～20:1，v/v)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物16。
化合物16：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.54；收率30.6％；白色固体，mp 63.3-65.9℃；ESI-MS m/z:436.49[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.03(s,1H),7.36–7.24(m,4H),7.21–7.12(m,5H),5.63–4.89(m,1H),3.63–3.54(m,1H),3.33(s,3H),3.05(d,J＝7.1Hz,4H),2.93–2.89(m,4H),2.83–2.76(m,2H),2.68–2.59(m,4H),2.55–2.44(m,2H),1.19–1.03(m,6H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.20,171.05,144.55,141.66,128.57,128.02,126.90,126.69,124.73,57.05,50.47,47.26,38.83,36.14,35.83,34.22,30.34,27.71,9.08。
实施例6：化合物17-18的制备
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-甲基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/LNaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1-20:1)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物17。
化合物17：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.60；收率33.3％；白色固体，mp 78.5-81.7℃；ESI-MS m/z:468.42[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.02(s,1H),7.39–7.25(m,4H),7.20–6.95(m,4H),5.36–5.05(m,1H),3.73–3.46(m,1H),3.33(s,3H),3.29–3.22(m,2H),3.11–2.95(m,4H),2.92–2.77(m,4H),2.74–2.67(m,2H),2.63–2.56(m,2H),2.51–2.49(m,2H),1.87(s,4H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.78,170.89,143.70,141.65,131.20,130.03,128.45,126.91,124.74,57.01,53.99,53.01,38.18,36.14,35.82,35.59,30.37,27.72,22.93。
在三颈反应瓶中，加入3-(4-氯苯基)戊二酸(4.1mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(10.3mmol)和N-甲基-2-氨基茚满盐酸盐(4.1mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(30mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，4.9mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，8.2mmol)和N,N-二乙基乙二胺(4.9mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1-20:1)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物18。
化合物18：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1,v/v):0.58；收率29.8％；白色固体，mp 63.8.3-66.1℃；ESI-MS m/z:470.41[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.03(d,J＝4.4Hz,1H),7.30(ddd,J＝11.5,8.4,4.0Hz,4H),7.23–7.05(m,4H),5.35–4.76(m,1H),3.64–3.52(m,1H),3.05(s,3H),3.01–2.88(m,4H),2.81–2.75(m,2H),2.72–2.66(m,2H),2.62–2.56(m,2H),2.52–2.46(m,2H),1.17–1.09(m,6H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.93,170.86,143.62,141.65,131.20,130.00,128.44,126.90,124.73,57.00,50.44,47.24,39.04,35.81,34.25,30.34,29.46,27.71,9.09。
实施例7：化合物19-21的制备
在三颈反应瓶中，将3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DPEA，9.6mmol)和N-乙基乙二胺(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1-20:1)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物19。
化合物19：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1,v/v):0.45；收率27.4％；白色固体，mp 63.8-65.2℃；ESI-MS m/z:422.41[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.00(s,1H),7.30–7.23(m,4H),7.21–7.10(m,5H),4.79–4.70(m,1H),3.62–3.55(m,1H),3.26–3.12(m,4H),2.98–2.86(m,4H),2.83–2.73(m,4H),2.68–2.53(m,2H),2.50(s,2H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H),1.03–0.89(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.15,170.55,141.74,141.12,128.54,128.05,126.67,124.78,57.75,56.09,46.36,42.47,38.99,36.98,36.34,35.60,29.48,14.68,11.43。
在三颈反应瓶中，将3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/LNaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1-20:1)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物20。
化合物20：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1,v/v):0.52；收率33.4％；色固体，mp 60.1-62.6℃；ESI-MS m/z:448.43[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.04(s,1H),7.27(dd,J＝14.9,6.8Hz,4H),7.20–7.08(m,5H),4.82–4.64(m,1H),3.67–3.52(m,1H),3.30–3.13(m,4H),3.09–2.93(m,4H),2.82–2.72(m,4H),2.68–2.54(m,2H),2.51–2.45(m,4H),1.93(s,2H),1.79(s,2H).,1.03–0.89(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.00,170.52,141.75,141.15,128.56,128.11,127.03,126.77,124.79,57.76,56.12,53.76,42.21,39.00,36.34,35.56,32.01,29.91,22.93,14.67。
在三颈反应瓶中，将3-苯基戊二酸(4.8mmol)和Ac2O(20mL)，搅拌，加热至100℃，反应2h，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入无水四氢呋喃(20mL)，三乙胺(12.0mmol)和N-乙基-2-氨基茚满盐酸盐(4.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，反应液浓缩至干，倒入水中(60mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得油状物。在上述油状物中，加入二氯甲烷(30mL)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5.8mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DPEA，9.6mmol)和1-(2-氨基乙基)哌啶(5.8mmol)，室温下搅拌过夜。反应完全后，用5mol/L NaOH调pH＝10，加入60mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干得到黄色固体粗品。用氯仿/甲醇(100:1-20:1)作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物21。
化合物21：Rf(CHCl3/MeOH＝20:1，v/v):0.53；收率32.1％；白色固体，mp55.6-57.0℃；ESI-MS m/z:462.45[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.06(s,1H),7.36–7.22(m,4H),7.22–7.09(m,5H),4.77–4.66(m,1H),3.62–3.55(m,1H),3.30–3.13(m,4H),2.99–2.89(m,4H),2.82–2.67(m,4H),2.65–2.53(m,2H),2.50(s,2H),1.90–1.30(m,6H),1.03–0.89(m,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.09,170.49,141.75,141.12,128.54,128.10,127.03,126.76,124.78,57.76,55.72,52.80,42.16,39.07,36.73,36.34,34.14,23.13,21.59,16.21,14.67。
实施例8：甘氨酰胺类衍生物体外活性测试
一、体外抑制SAHase活性测试
仪器：滤光片型多功能酶标仪(瑞士TECAN Infinite F500)。
试剂：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase，EC 3.3.1.1，美国prospecbio公司)；S-腺苷同型半胱氨酸(SAH，Sigma-Aldrich有限公司)；腺苷脱氨酶(ADA，百灵威科技有限公司)；3-脱氮腺苷(C3-Ado,百灵威科技有限公司)；ThioGlo 1Fluorescent Thiol Reagent(百灵威科技有限公司)；磷酸缓冲盐溶液(PBS，北京索莱宝科技有限公司)。
试剂的准备：1、将5mg S-(5'-腺苷)-L-同型半胱氨酸(SAH)溶于260μL纯化的H2O中。将储备溶液(50mM)分成小瓶使用，并保存在-20℃下。
2、将1mg ThioGlo1溶于263.5μL DMSO中。将储备溶液(10mM)分成等分的小瓶使用，并储存在-20℃下。
试剂配制：1、用PBS反应缓冲液1:74倍稀释5mM的SAH底物，每个孔需要25μL。
2、用PBS反应缓冲液稀释待测化合物成25μM、5μM的待测化合物。
3、配置含5％的DMSO反应缓冲溶液。
4、用DMSO 1:500倍稀释ThioGlo1(10mM)储液，得到20μM的工作液体，每个孔需要100μL。
5、用PBS反应缓冲液配置含1mM EDTA和0.03U ADA的混合液，每孔需要5μL。
6、用PBS反应缓冲液稀释SAHase，使其浓度为0.5mU每孔，每孔需要10μL。
7、预冷异丙醇。
操作步骤：1、准备96孔黑板于室温下待用。
2、往待测化合物孔分别加入10μL待测化合物，需要两个复孔。
3、往全活性孔和空白对照孔加入10μL 5％DMSO反应缓冲液，需要两个复孔。
4、往所有反应孔(除了空白对照孔外)加入10μL 0.5mU的SAHase。
5、往空白对照孔加入10μL PBS反应缓冲液。
6、往所有反应孔加入0.5μL的EDTA和ADA混合液。
7、37℃孵育2min。
8、往底物对照孔加入25μL PBS反应缓冲液，需要两个复孔。
9、往除了底物对照孔外的所有反应孔加入25μL的SAH底物溶液开始反应。
10、37℃孵育10min。
11、往所有孔加入50μL的预冷的异丙醇终止反应。
12、向所有反应孔加入100μL的ThioGlo1检测试剂。
13、常温避光孵育10min后，用多功能酶标仪检测其在510nm处的发射荧光380nm激发荧光信号值。
实验结果见表1：
表1目标化合物对SAHase抑制活性
C3-Ado：3-脱氮腺苷。
从表1可以看出，所有化合物都表现出了显著的体外抑制SAHase活性，其中化合物1、2、10、12、13、19都表现出较强的体外抑制SAHase活性，并且体外SAHase抑制活性优于阳性化合物3-脱氮腺苷(C3-Ado)。
二、体外抗肿瘤活性研究
1.实验材料
细胞株：MGC-803(人胃癌细胞株)、HELA(人宫颈癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)。
2.实验溶液的配置
含10％胎牛血清的DMEM完全培养基：将DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium)细胞培养基、胎牛血清和青链霉素溶液按100:10:1配置成细胞完全培养基。于4℃下低温保存。
MTT溶液：将3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，250mg)溶于50mL的PBS溶液中，摇晃均匀后，配制成5mg/mL的MTT溶液，于4℃下保存可以保存2-3周，使用时要用0.22μm微孔滤膜过滤后使用。
PBS磷酸缓释液：将NaCl(18g)、Na2HPO4(1.15g)和KH2PO4(0.2g)，完全溶于1000mL去离子水，放入蒸汽灭菌器中高压灭菌，冷却到室温后，于4℃下保存。
待测化合物的配制：将化合物1-21以及5-氟尿嘧啶溶于1mL的DMSO中，配制成10mM的待测化合物母液。于-20℃下保存。
3.实验方法(MTT法)
化合物1-21以及5-氟尿嘧啶对上述肿瘤细胞株的细胞毒性通过MTT法测得。
4.实验步骤：
1)细胞复苏
将细胞从-80℃冰箱中取出，在37℃水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作台中移入4mL无菌离心管中加入3mL DMEM完全培养基，在离心机以1000转/分转速离心5分钟。弃去上清液，沉淀中加入3mL DMEM细胞培养基，用移液枪轻轻吹打细胞使其悬浮后移入细胞培养皿中，静置37℃细胞培养箱内。
2)细胞传代
从培养箱中取出细胞培养皿，弃去细胞培养皿中的DMEM完全培养基，加入PBS溶液(pH 7.4)2-3mL晃动清洗，弃掉PBS溶液。然后在培养皿中加入1-2mL胰蛋白酶溶液晃动均匀，加盖置于37℃细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察细胞是否自细胞培养皿壁上脱离，加DMEM细胞培养基3mL，滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后，移入大的干净无菌培养皿中，加入DMEM细胞培养基4-6mL吹打均匀，置于37℃细胞培养箱内。24h后，显微镜下观察细胞生长状态，重复进行。在整个培养过程中，需要在显微镜下观察细胞状态，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生长期。
3)细胞冻存
选择在显微镜下观察处于对数生长期、且细胞状态良好的细胞，弃去细胞培养DMEM细胞培养基，加入PBS溶液(pH 7.4)2-3mL晃动清洗两次，弃去PBS溶液，加入2mL的0.25％的胰蛋白酶晃动均匀，加盖置于37℃细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察细胞是否自细胞培养皿壁上脱离，待完全脱离下来后加入2ml的培养基，移至4mL离心管中，在离心机以1000转/分转速离心5分钟，弃去上清液，加入1mL冻存液，轻轻吹打均匀，转移到冻存管中，在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者，按标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min，装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
4)样品制备
将待测化合物母液取出解冻用PBS溶液作梯度稀释，得到浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL 3.125μg/mL的稀释样品。
5)对照品制备
将5-氟尿嘧啶母液取出用PBS溶液作梯度稀释，配制浓度为10mg/mL的溶液。再用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL3.125μg/mL的稀释样品。
6)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，经苔盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至2×105细胞/mL。在96孔板中，每孔加入180μL细胞，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。
7)将稀释好的样品加入96孔板中，每孔20μL每个浓度作三个平行测试。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为阴性对照。
8)将加入样品的平底96孔板在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48小时。
9)待细胞培养到44h时候，往96孔板中待测孔每孔中加入20μL的5mg/mL MTT溶液，继续在培养箱中保温孵育4小时。
10)孵育培养结束后，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使生成的甲臢晶体充分溶解。
11)在酶联免疫检测器上测定细胞在490nm的光吸收值(OD)。
12)根据光吸收值计算化合物处理后细胞相对存活率。抑制率计算公式如下：
生长抑制率(％)＝(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)]×100％。
13)通过SPASS软件计算化合物对各肿瘤细胞株抑制的IC50，结果见下表2。
从表2可以看出，多个化合物对MGC-803(人胃癌细胞株)、HELA(人宫颈癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)表现出较好的抑制活性，对肝正常细胞(LO2)抑制活性都弱于5-氟尿嘧啶。其中化合物1、10、11、12、13、18对HELA(宫颈癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)表现出较强抑制活性，尤其化合物10对这些肿瘤细胞的抑制活性都优于5-氟尿嘧啶。
表2目标化合物的体外抗肿瘤活性
5-FU：5-氟尿嘧啶。
Claims (4)
1.如下结构式所示的甘氨酰胺类衍生物1、2、10、12、13、18或 19，具体结构式为：
2.权利要求1所述的甘氨酰胺类衍生物1、2、10、12、13、18或 19的制备方法，其特征在于，制备路线如下：
制备方法为：
在有机溶剂中，2-氨基茚满V与乙酸酐Ac2O或二碳酸二叔丁酯Boc2O发生酰胺化反应制备得到化合物VI，化合物VI再与氢化铝锂发生还原反应制备得到化合物22或23；
将苯基戊二酸衍生物II与乙酸酐Ac2O发生缩合反应，得到中间体环状醋酐III；
在有机溶剂中，中间体环状醋酐III与2-氨基茚满V或化合物22 或化合物23进行酰胺化反应，制备得到化合物IV，化合物IV再与乙二胺衍生物VII发生酰胺化反应，制备得到式I所示衍生物；
制备方法中，所述苯基戊二酸衍生物II与2-氨基茚满V 或化合物22 或化合物23、乙二胺衍生物VII的摩尔比为1:1～2: 1～2；
所述有机溶剂为无水四氢呋喃、二氯甲烷或 N,N-二甲基甲酰胺中的一种；
所述酰胺化反应温度为室温，反应时间为6~24小时；
所述缩合反应温度为90-100 ℃。
3.权利要求1所述的甘氨酰胺类衍生物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在制备治疗肿瘤性疾病药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述治疗肿瘤性疾病药物为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂药物。
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