CN112899304A

CN112899304A - 一种调控大豆分枝数基因st1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用

Info

Publication number: CN112899304A
Application number: CN202110180555.9A
Authority: CN
Inventors: 孙连军; 李骏; 马瑞瑞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112899304B

Abstract

本发明公开了一个调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用，属于分子生物学及基因工程技术领域。本发明通过设计大豆分枝数调控基因ST1，利用构建ST1基因组载体，进行农杆菌转化。不同突变体的分枝数和单株产量与对照相比均显著减少和增加。因此，本发明提供的大豆分枝数调控基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量，具有重要的应用价值，能产生良好的经济效益。

Description

一种调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程技术领域，涉及一种调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用。

背景技术

大豆起源于我国，栽培历史已逾五千年，是人类食用油和植物性蛋白的主要来源，在我国国民膳食体系中占有重要地位。目前，我国是世界上大豆第一消费大国，然而每年消耗的大豆中超过90％都来源于国外进口。因此发掘关于大豆产量的基因对增产和高产品种培育的应用研究具有重要的实践意义。

大豆产量形成的实质是库源关系相互作用的过程。源是光合产物的生产者和供给者，而库则是对源起反馈调节作用的器官，是用于光合产物的累积消耗量。源、库、运输器官关系协调的数量和程度对大豆产量具有重要意义。当能量较少的供应到分枝时，种子接受的能量会更多，进而提升大豆产量。

ST1编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶，利用基因工程技术，构建了基因组载体，转化大豆后发现ST1会负调控大豆分枝数，大豆产量有显著增加相较于对照。这些结果将有助于理解大豆分枝数增减的分子机制，同时可以提高大豆产量具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一个大豆分枝数调控基因ST1以增加大豆分枝数和产量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用，利用携带ST1基因组载体导入失去ST1功能背景的受体大豆，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

作为优选，调控大豆分枝数基因ST1编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

作为优选，构建所述调控大豆分枝数基因ST1基因组载体并转化大豆，获得分枝数减少的转基因大豆。

作为优选，调控大豆分枝数基因ST1基因组载体通过下述方法构建：根据栽培大豆Williams82为参考序列设计引物，并分别在引物上加入BamHI和SalI限制性核酸内切酶位点，扩增得到包含ST1基因起始密码子ATG前约2.5Kb以及终止密码子TGA后约1.5Kb的基因组片段，对PCR产物进行纯化回收；用相同的内切酶对空的植物表达载体进行酶切，回收纯化后将两个回收产物混合进行重组连接，测序确认目的片段已经连接到pTF101载体上，得到含有栽培大豆Williams82的ST1基因的基因组表达载体，将其命名为ST1。

作为优选，植物表达载体是pTF101。

本发明具有如下技术效果：

1.ST1的单倍型分析：我们利用大豆种质1209份重测序数据，依据PCR测序结果，对ST1的变异类型进行了分析，一共发现10种单倍类型，其中1003份为H1单倍型，占比高达82.96％。我们发现H3-H10单倍型在起始密码子ATG后203个碱基的由T转变为C，据预测，这一点突变会导致该基因编码的蛋白质结构的改变，表明(C到T)点突变可能是表型转变的原因。

2.ST1的功能验证：利用构建基因组载体技术，通过农杆菌介导的遗传转化，发现以科丰一号为受体的转基因植株比对照科丰一号植株分枝数显著减少，百粒重则显著高于对照。

3.ST1提升产量：我们对大豆种质1258份农艺性状数据进行分析，发现大豆的分枝数与大豆产量呈负相关关系。

附图说明

图1为ST1的单倍型分析结果图；

依据ST1编码区的12个差异位点(包含10个SNP和2个Indel)对大豆种质1209份重测序数据进行单倍型分型分析，结果发现，它们可以被分成十种单倍型；

图2为ST1蛋白模型预测图；

将ST1-H1和ST1-H3单倍型的氨基酸序列以Fasta格式上传到在线分析工具I-TASSER，进行基因编码蛋白3D结构的预测，并从预测的多个结构模型中选出可信度最高的蛋白模型；

图3为ST1转基因植株与对照表型图；

左图为成熟期以科丰一号为背景的转基因植株，右图为对照科丰一号植株；

图4为ST1转基因植株与对照差异统计图；

A为ST1转基因植株与对照分枝数差异统计，B为ST1转基因植株与对照百粒重差异统计；Branching number：分枝数，100-seed weight：百粒重；

图5为含有ST1背景植株与未含有ST1背景植株生产中表型差异比较；

A为含有ST1背景植株与未含有ST1背景植株分枝数差异统计，B为含有ST1背景植株与未含有ST1背景植株产量差异统计；Branching number：分枝数，Yield：产量。

具体实施方式

本发明公开了一种调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

以下为本发明涉及的实验方法：

(一)ST1的单倍型分析

依据ST1编码区的12个差异位点(包含10个SNP和2个Indel)对大豆种质1209份重测序数据进行单倍型分型分析，结果发现，它们可以被分成十种单倍型；运用软件Excel进行数据整理。

(二)ST1蛋白的高级结构预测

将ST1-H1和ST1-H3单倍型的氨基酸序列以Fasta格式上传到在线分析工具I-TASSER，进行基因编码蛋白3D结构的预测，并从预测的多个结构模型中选出可信度最高的蛋白模型。

(三)ST1的基因组载体构建

1.重组载体的获得

根据栽培大豆Williams82为参考序列设计引物，并分别在引物上加入BamHI和SalI限制性核酸内切酶位点，扩增得到包含ST1基因起始密码子ATG前约2.5Kb以及终止密码子TGA后约1.5Kb的基因组片段，F:ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGGTTCCAATCACGCTATTAGT,R:GCTATGACATGATTACGAATTCTGGTGAGTGTTGAAGAGATTCG,对PCR产物进行纯化回收；用相同的内切酶对pTF101空载体进行酶切，回收纯化后将两个回收产物混合进行重组连接，测序确认目的片段已经连接到pTF101载体上，得到含有栽培大豆Williams82的ST1基因的基因组表达载体。

2.重组农杆菌的获得

将上述重组载体pTF101-ST1冻融法转化根癌农杆菌EHA105，获得含有重组载体pTF101-ST1的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/pTF101-ST1。提取重组农杆菌EHA105/pTF101-ST1的质粒，PCR验证，条带大小与预期相符为阳性重组农杆菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用

<130> MP21002144Z

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaacttgct cagtcttttg aaaacaatct atttgtctgc aacctaagta gaaaccagct 60

attgtaatta aaagtttaac gctgcatgat ttgagttctg ttttgtcggc ggggactagg 120

gacaaatata ttttttgtta gttaatttgt atatttattg gtgatatgtc tgaagttaag 180

ttaattggcc atgcatgtgt gtgtgtgtgg tagtgagaag aattgagaaa aagaatgtgg 240

tctccaaagt ccaaccaata caaatctcta gctctccctc cctctctctt gtatcccttt 300

atatgaatct tctcagacac gttttcgaga gccccttttt ccttatcata gcctcgcagc 360

agctgatatc tcatgttgtt cttgttccta acaaagtagc attaaaaacc atggcatctt 420

caccggacac cagcaaaacc ataaagctga tgcgttacaa cagctacctc cgcagactca 480

acagcttcaa actccttaag acatccttca tcctcctcct cctcctctac accctctcca 540

cccaccacct cctcctctcc tccgccttcc acggccccgc atgggagaat caggtccgcc 600

actccgccct cccccgccgc ccccacggca tgtcggtgct ggtcaccggc gcggcgggct 660

tcgttggctc ccactgctcc ctctccctga agaagcgcgg cgacggcgtc ctcgggctcg 720

acaacttcaa ctcctactac gacccctccc taaaacgcgc acgccagcac ctcctcgcca 780

aacaccaaat cctcatcatc gaagccgacc taaacgacgc cccgttgctc gccaagatct 840

tcgacgtcgt ttcgttctcc cacgtcctcc acctcgcagc acaagcgggc gtccgctacg 900

ccatgcagaa cccccactcc tacgtggcat ccaacatcgc cggattcgta actcttctag 960

aagcttccaa aaacgctaac ccccagcccg ccatcgtttg ggcctcctcg agttccgtct 1020

atgggctcaa tgacgaaagc ccattctccg aactccaccg tacggaccag cctgcgagcc 1080

tctacgcggc aactaaaaaa gcaggcgaag caatcgcgca cacctataat catatctatg 1140

gactctccct caccggattg cgcttcttca ctgtttatgg gccctgggga aggcccgaca 1200

tggcttactt tttcttcact aagtccattc tccagagaaa gcccattgac gtgtaccaga 1260

cgcatgacga gagagaagtc gcgcgtgact tcacttacat cgacgacgtc gtcaagggct 1320

gcctcggtgc cctcgacacg gcggagaaga gcaccggcgg cgtcgtaggg aagaagcgcg 1380

gccccgcgca gctgagagtt tacaatctcg gtaacacatc gccggtgccg gtgggtaaac 1440

ttgtttccgt gttggagacg ttgctcgggg taaaggcgaa gaagcacgtg atcaaaatgc 1500

ctcgaaacgg cgacgttccg ttcacgcatg ctaacgtgag cttggcgtgg agggacttgg 1560

ggtacaagcc caccacggat ctcgccgctg gtctcagaaa gttcgtgcag tggtacgtcg 1620

ggtattatgg tgttcgctta ggggtagaaa aggaaaaaca cgcagacttg gcttgattca 1680

tcctttccgt gcccctccat tcatttatta taattatatg tttttttgtt gaaacttgtg 1740

aatggtgctg gcggcccatg tgagaatgca taatcatgat ttggtatttt aataaaatgc 1800

tagttgcatc cagtattatt atctgtgcac ccaacactta agatgaaatg acaaaaatat 1860

ctttgatccg taaatcattt aagttgatct ataagagtct tatggatcaa cttaatccgt 1920

attgtttcgt aaaaggttta cggatcatat tgatccgtat caaccttacg gatcaacttg 1980

atttgtacga tttacggact atcctcacac acattcatca caaatgcgga aaaagtgtag 2040

agataatttt ggtattttta taaacttgtg aatttcaaca agtctgcgtg gtgtggcacc 2100

attcacaagt ttcaacaagt tttattaaac ttgtgaatat aaacgtggta tataggtcca 2160

aggtaataaa agcaaggaca agagcaagtg tatatatgta atctatgtgt gaggtggtgg 2220

agggggagct gagctgtatt aatgatgggt gggctctact ttaagctttt ccaacttatt 2280

attgtatttt caaaattaag ttaaattgtg tatagacaat aattatatga catagacatg 2340

caa 2343

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Cys Val Cys Val Val Val Arg Arg Ile Glu Lys Lys Asn Val Val

1 5 10 15

Ser Lys Val Gln Pro Ile Gln Ile Ser Ser Ser Pro Ser Leu Ser Leu

20 25 30

Val Ser Leu Tyr Met Asn Leu Leu Arg His Val Phe Glu Ser Pro Phe

35 40 45

Phe Leu Ile Ile Ala Ser Gln Gln Leu Ile Ser His Val Val Leu Val

50 55 60

Pro Asn Lys Val Ala Leu Lys Thr Met Ala Ser Ser Pro Asp Thr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Ile Lys Leu Met Arg Tyr Asn Ser Tyr Leu Arg Arg Leu Asn

85 90 95

Ser Phe Lys Leu Leu Lys Thr Ser Phe Ile Leu Leu Leu Leu Leu Tyr

100 105 110

Thr Leu Ser Thr His His Leu Leu Leu Ser Ser Ala Phe His Gly Pro

115 120 125

Ala Trp Glu Asn Gln Val Arg His Ser Ala Leu Pro Arg Arg Pro His

130 135 140

Gly Met Ser Val Leu Val Thr Gly Ala Ala Gly Phe Val Gly Ser His

145 150 155 160

Cys Ser Leu Ser Leu Lys Lys Arg Gly Asp Gly Val Leu Gly Leu Asp

165 170 175

Asn Phe Asn Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Arg Ala Arg Gln His

180 185 190

Leu Leu Ala Lys His Gln Ile Leu Ile Ile Glu Ala Asp Leu Asn Asp

195 200 205

Ala Pro Leu Leu Ala Lys Ile Phe Asp Val Val Ser Phe Ser His Val

210 215 220

Leu His Leu Ala Ala Gln Ala Gly Val Arg Tyr Ala Met Gln Asn Pro

225 230 235 240

His Ser Tyr Val Ala Ser Asn Ile Ala Gly Phe Val Thr Leu Leu Glu

245 250 255

Ala Ser Lys Asn Ala Asn Pro Gln Pro Ala Ile Val Trp Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Ser Val Tyr Gly Leu Asn Asp Glu Ser Pro Phe Ser Glu Leu His

275 280 285

Arg Thr Asp Gln Pro Ala Ser Leu Tyr Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly

290 295 300

Glu Ala Ile Ala His Thr Tyr Asn His Ile Tyr Gly Leu Ser Leu Thr

305 310 315 320

Gly Leu Arg Phe Phe Thr Val Tyr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Asp Met

325 330 335

Ala Tyr Phe Phe Phe Thr Lys Ser Ile Leu Gln Arg Lys Pro Ile Asp

340 345 350

Val Tyr Gln Thr His Asp Glu Arg Glu Val Ala Arg Asp Phe Thr Tyr

355 360 365

Ile Asp Asp Val Val Lys Gly Cys Leu Gly Ala Leu Asp Thr Ala Glu

370 375 380

Lys Ser Thr Gly Gly Val Val Gly Lys Lys Arg Gly Pro Ala Gln Leu

385 390 395 400

Arg Val Tyr Asn Leu Gly Asn Thr Ser Pro Val Pro Val Gly Lys Leu

405 410 415

Val Ser Val Leu Glu Thr Leu Leu Gly Val Lys Ala Lys Lys His Val

420 425 430

Ile Lys Met Pro Arg Asn Gly Asp Val Pro Phe Thr His Ala Asn Val

435 440 445

Ser Leu Ala Trp Arg Asp Leu Gly Tyr Lys Pro Thr Thr Asp Leu Ala

450 455 460

Ala Gly Leu Arg Lys Phe Val Gln Trp Tyr Val Gly Tyr Tyr Gly Val

465 470 475 480

Arg Leu Gly Val Glu Lys Glu Lys His Ala Asp Leu Ala

485 490

Claims

1.一个调控大豆分枝数基因ST1以减少大豆分枝数进而增加产量的应用，其特征在于，利用携带ST1基因组载体导入失去ST1功能背景的受体大豆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调控大豆分枝数基因ST1编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，构建所述调控大豆分枝数基因ST1基因组载体并转化大豆，获得分枝数减少的转基因大豆。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控大豆分枝数基因ST1基因组载体通过下述方法构建：根据栽培大豆Williams82为参考序列设计引物，并分别在引物上加入BamHI和SalI限制性核酸内切酶位点，扩增得到包含ST1基因起始密码子ATG前约2.5Kb以及终止密码子TGA后约1.5Kb的基因组片段，对PCR产物进行纯化回收；用相同的内切酶对空的植物表达载体进行酶切，回收纯化后将两个回收产物混合进行重组连接，测序确认目的片段已经连接到pTF101载体上，得到含有栽培大豆Williams82的ST1基因的基因组表达载体，将其命名为ST1。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是pTF101。