CN112899143B - 一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用，属于分析检测领域。在该发明过程中，构建了一种集成化三维折纸器件，通过依次折纸的方式实现样本、洗涤缓冲液和荧光标记试剂连续引入与引出，加样区用来从细胞中提取基因组并作为后续标记反应的反应区。该设备集细胞裂解、基因组提取和基因组损伤检测等过程于一体，避免了传统方法复杂耗时的操作过程，具有便携、简单、快捷、低成本等分析性能，对环境水样、食品安全、药品毒性安全分析具有潜在的应用价值。

Description

一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用。
背景技术
近年来，有关环境污染物的遗传毒性事件时有发生，无论是在人用药品中含有潜在的致癌物质，还是农药、消毒剂、染料等可能携带的致癌物质都有可能在生产使用过程中进入环境对人体健康造成严重威胁，传统检测污染物遗传毒性的方法步骤繁琐、耗时长、需专业人士操作，所以方便、快捷、灵敏的检测这些物质的遗传毒性就显得尤为重要。
TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)可利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将荧光素标记的dUTP(FITC-dUTP)催化聚合到基因组DNA随机断裂暴露的3’-OH末端，实现对基因组DNA 3’-OH断裂类型损伤的检测。基因组DNA磷酸骨架上的磷酸二酯键断裂产生3’-OH末端作为一种常见的DNA断裂类型，可作为评估污染物遗传毒性的一种方法。
纸由于具有低成本、易折叠、环境友好、用完可丢弃等优点在即时诊断(point-of-care testing)领域作为微流控检测平台得到广泛的研究。集成化折纸器件具有以下优点：(1)将样本前处理、试剂存储与转移、目标物检测等复杂的实验操作过程集成到小的纸基器件上，避免了传统检测方法的繁琐冗杂步骤；(2)使用少量的样本、检测试剂即可做出高精度和高灵敏度的检测，检测费用低，分析时间短；(3)由于折纸器件的集成化使得装置小型、便携，同时由于纸可生物降解，用完即可丢弃不需额外处理；(4)纸良好的生物相容性兼容多种生物酶促反应；(5)由于纸多孔结构，不需要额外仪器，只需利用毛细作用，通过不同的折叠顺序即可控制液体的流动。到目前为止，利用集成化折纸器件评估污染物遗传毒性的研究尚未报道。
发明内容
本发明为解决现有的技术问题，本发明的第一目的是构建一种检测基因组3’-OH末端断裂类型损伤的集成化三维折纸器件。
本发明的第二目的在于，提供一种集成化三维折纸器件检测基因组3’-OH末端断裂类型损伤的应用方法。
一种集成化三维折纸器件，所述集成化三维折纸器件包括加样区器件、标记试剂储存区器件和废物吸收垫，加样区器件与标记试剂储存区器件相连并可通过连接处折叠，加样区器件和废物吸收垫相连并可通过连接处折叠；所述加样区器件上设有加样区，标记试剂储存区器件上设有标记试剂储存区；加样区器件与标记试剂储存区器件沿相连处对折后，加样区和标记试剂储存区在位置上相对应；所示加样区器件和标记试剂储存区器件上除加样区和标记试剂储存区以外的区域为疏水区，加样区、标记试剂储存区和废物吸收垫为亲水区；所述加样区包被细胞裂解液，所述标记试剂储存区包被包含了末端脱氧核苷酸转移酶、FITC-dUTP和普鲁兰糖的标记试剂。
进一步地，所述加样区器件的材质包括Whatman Grade 1滤纸、Whatman Grade 5滤纸或Millipore Glass fiber滤纸；标记试剂储存区器件的材质包括纤维素滤纸；废物吸收垫的材质包括滤纸。
进一步地，加样区和标记试剂储存区的形状包括圆形。
进一步地，所述标记试剂为普鲁兰糖、末端脱氧核苷酸转移酶与FITC-dUTP的混合溶液，FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500，普鲁兰糖终浓度>10％(m/v)。
进一步地，加样区器件和标记试剂储存区器件采用喷蜡打印机打印除加样区和标记试剂储存区以外的区域，将加样区器件和标记试剂储存区器件加热至120-130℃，加热2-3min使蜡融化并渗透整个纸器件的厚度，形成疏水区。
一种集成化三维折纸器件的应用，在检测基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤及在评估污水或污染物样品遗传毒性中的应用。
进一步地，一种集成化三维折纸器件的应用，包括如下步骤：
(1)提取暴露于污水或污染物中培养的动物的细胞或使用污染物暴露处理细胞，制备得到待检测的细胞悬浮液；
(2)将避光保存的集成化三维折纸器件平铺，使加样区器件、标记试剂储存区器件和废物吸收垫处于同一平面上；向加样区中加入待检测的细胞悬浮液，室温孵育，进行细胞裂解；
(3)将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组DNA；
(4)将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入ddH2O，使标记试剂储存区的标记试剂洗涤到加样区，室温孵育后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应；
(5)将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用1×PBS洗涤，使未标记的FITC-dUTP洗涤到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上；
(6)对加样区进行拍照检测荧光强度，利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，以实现基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤的检测，以评估污水或污染物样品遗传毒性。
进一步地，步骤(1)中孵育的时间为2-5min，步骤(3)中孵育的时间为5-30min。
进一步地，所述步骤(1)所述动物包括斑马鱼，所述细胞包括斑马鱼肝细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明设计了一种集细胞裂解、基因组提取和基因组损伤检测等过程于一体的简单、便携式的折纸器件可实现对基因组3’-OH末端断裂类型损伤的检测。相比较传统检测污染物遗传毒性的方法，本发明所述的集成化三维折纸器件，操作简单，不需要专业人员耗时操作，且仅需几微升样本即可完成检测，对环境水样、食品安全、药品毒性安全分析具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明所述集成化三维折纸器件结构示意图；图1a为器件平面图，图1b为器件三维立体图。
图2为本发明所述集成化三维折纸器件实物图；图2a为器件平面图，图2b为器件三维立体图。
图3为H2O2处理细胞后，不同细胞数基因组3’-OH断裂损伤与S/B的关系图。
图4为利用本发明所述集成化三维折纸器件测试不同污染物遗传毒性分析图。
图5为利用本发明所述集成化三维折纸器件测试某污水厂不同水处理工艺出水遗传毒性分析图。
图中，1、加样区器件；2、标记试剂储存区器件；3、废物吸收垫；4、加样区；5、标记试剂储存区。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
表1：本发明中使用的核酸序列
Figure BDA0002942517740000051
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1不同型号滤纸提取细胞基因组
将不同型号滤纸(Whatman Grade 1、Whatman Grade 5、Millipore Glass fiber、Nitrocellulose blotting membrane 0.45μm、Nitrocellulose blotting membrane 0.2μm)裁剪为大小2mm×3mm的纸片。利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技(北京)有限公司，DP304)从斑马鱼肝细胞(ATCC,CRL-2643TM)中提取斑马鱼肝基因组。取150ng的斑马鱼肝基因组分别滴加到上述不同型号的滤纸纸片上，用50μL 1×PBS洗涤纸片，室温干燥10min。将纸片加到包含有0.5μL上游引物(SEQ ID NO.1)(100μM)、0.5μL下游引物(SEQ ID NO.2)(100μM)、5μL 10×PCR buffer、3μLMgCl2(25mM)、2μL dNTP(each10mM)、1μL Taq DNA Polymerase(5U/μL)，38μL ddH2O的反应体系中进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR扩增程序为95℃，180s，30轮热循环包括94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，最后延伸过程为72℃，10min。扩增完成后，各取5μL反应液在2％(wt/vol)的琼脂糖凝胶中电泳40min，电压120V。Whatman Grade 1、Whatman Grade 5、Millipore Glass fiber、Nitrocellulose blotting membrane 0.45μm、Nitrocellulose blotting membrane 0.2μm对提取基因组的扩增产物量分别可以达到直接在溶液中扩增基因组产物量的89％、86％、78％、54％和39％，在这里选用Whatman Grade 1作为细胞裂解与基因组提取的平台。
实施例2集成化三维折纸器件的构建
如图1所示，一种集成化三维折纸器件，所述集成化三维折纸器件包括加样区器件1、标记试剂储存区器件2和废物吸收垫3，加样区器件1与标记试剂储存区器件2相连，加样区器件1和废物吸收垫3相连。
所述加样区器件1的材质包括Whatman Grade 1滤纸、Whatman Grade 5滤纸或Millipore Glass fiber滤纸，标记试剂储存区器件2的材质包括纤维素滤纸，废物吸收垫3的材质包括滤纸。所述加样区器件1上设有圆形结构的加样区4，标记试剂储存区器件2上设有圆形结构的标记试剂储存区5。加样区器件1与标记试剂储存区器件2沿相连处对折后，加样区4和标记试剂储存区5在位置上相对应。使用时，将废物吸收垫3与标记试剂储存区器件2分别沿相连处折叠至加样区器件1的两侧。
加样区器件1和标记试剂储存区器件2采用喷蜡打印机打印除加样区4和标记试剂储存区5以外的区域，随后将加样区器件1和标记试剂储存区器件2加热至120℃2min使蜡融化并渗透整个纸器件的厚度，形成疏水区；加样区4和标记试剂储存区5为亲水区；废物吸收垫3不做喷蜡打印处理，为亲水区。
实施例3集成化三维折纸器件检测细胞基因组3’-OH末端断裂类型损伤
(1)解剖斑马鱼，提取斑马鱼肝细胞，在含10％胎牛血清(FBS)、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中重悬。1×107个肝细胞0℃暴露于5mM H2O2中60min。
(2)使用Microsoft Office 2010软件对集成化三维折纸器件进行亲疏水区域的设计并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其加热至120℃2min使蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成输水区域，将1.5mm×1.5mm大小的废物吸收垫与加样区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连，将加样区器件的喷蜡打印疏水区域与标记试剂储存区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连。所制备的装置实物图如图2所示。
(3)在加样区加入5μL细胞裂解液(Triton X-100细胞裂解液SS0890，NOVON)，在室温下干燥，避光保存。
(4)将1μL 10×TRB反应缓冲液,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP,6μL 15％(m/v)普鲁兰糖加入标记试剂储存区，室温下干燥后，避光保存。
(5)分别取0，100，101，102，103，104，105个斑马鱼肝细胞滴加到含有干燥细胞裂解液的加样区，室温裂解5min，将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入50μL 1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物通过毛细作用洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组。将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入10μL ddH2O，使标记试剂储存区的标记试剂通过毛细作用流动到加样区，室温孵育20min后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应，将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用50μL 1×PBS洗两次，使洗涤废物通过毛细作用到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上。对加样区进行拍照检测荧光强度，利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。结果如图3所示，集成化三维折纸器件可实现对细胞基因组3’-OH断裂损伤的定量检测。
实施例4集成化三维折纸器件评估污染物遗传毒性
(1)解剖斑马鱼，提取斑马鱼肝细胞，在含10％胎牛血清(FBS)、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中重悬。1×107个肝细胞在37℃下分别暴露于192μM氧化锌纳米颗粒、600μM铬酸钾和960μM百草枯中4h。以未进行暴露处理的肝细胞作为对照。
(2)使用Microsoft Office 2010软件对集成化三维折纸器件进行亲疏水区域的设计并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其加热至120℃2min使蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成输水区域，将1.5mm×1.5mm大小的废物吸收垫与加样区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连，将加样区器件的喷蜡打印疏水区域与标记试剂储存区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连。所制备的装置实物图如图2所示。
(3)在加样区加入5μL细胞裂解液，在室温下干燥，避光保存；
(4)将1μL 10×TRB反应缓冲液,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP,6μL 15％(m/v)普鲁兰糖加入标记试剂储存区，室温下干燥后，避光保存。
(5)取104个斑马鱼肝细胞加到加样区，室温裂解5min，将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入50μL 1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物通过毛细作用洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组。将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入10μL ddH2O，使标记试剂储存区的标记试剂通过毛细作用流动到加样区，室温孵育20min后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应，将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用50μL 1×PBS洗两次，使洗涤废物通过毛细作用到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上。对加样区进行拍照检测荧光强度，利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，以实现基因组DNA损伤的检测。结果如图4所示，集成化三维折纸器件可实现对不同污染物遗传毒性的评估。
实施例5集成化三维折纸器件评估污水样品遗传毒性
(1)实验用斑马鱼在连续曝气的水中驯养两周，实验前24h停止喂饲。驯养期间死亡率不超过10％。将斑马鱼分别暴露于某污水厂不同处理工艺(二沉池出水、过滤棉过滤出水、臭氧氧化出水、活性炭吸附出水)出水的水样以及自来水(对照)中72h。解剖斑马鱼，提取斑马鱼肝细胞，在含10％胎牛血清(FBS)、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中重悬。
(2)使用Microsoft Office 2010软件对集成化三维折纸器件进行亲疏水区域的设计并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其加热至120℃2min使蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成输水区域，将1.5mm×1.5mm大小的废物吸收垫与加样区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连，将加样区器件的喷蜡打印疏水区域与标记试剂储存区器件的喷蜡打印疏水区域通过胶带粘连。所制备的装置实物图如图2所示。
(3)在加样区加入5μL细胞裂解液，在室温下干燥，避光保存；
(4)将1μL 10×TRB反应缓冲液,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP,6μL 15％(m/v)普鲁兰糖加入标记试剂储存区，室温下干燥后，避光保存。
(5)取104个斑马鱼肝细胞加到加样区，室温裂解5min，将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入50μL 1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物通过毛细作用洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组。将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入10μL ddH2O，使标记试剂储存区的标记试剂通过毛细作用流动到加样区，室温孵育20min后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应，将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用50μL 1×PBS洗两次，使洗涤废物通过毛细作用到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上。对加样区进行拍照检测荧光强度，利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，以实现基因组DNA损伤的检测。结果如图5所示，集成化三维折纸器件可实现对污水厂不同水处理工艺出水水样遗传毒性的评估。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 1
ggcccatcca tcgttcacag 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 2
cgagagttta ggttggtcgt tcg 23

Claims (9)

1.一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述集成化三维折纸器件用于检测基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤及评估污水或污染物样品遗传毒性；所述集成化三维折纸器件包括加样区器件(1)、标记试剂储存区器件(2)和废物吸收垫(3)，加样区器件(1)与标记试剂储存区器件(2)相连并可通过连接处折叠，加样区器件(1)和废物吸收垫(3)相连并可通过连接处折叠；所述加样区器件(1)上设有加样区(4)，标记试剂储存区器件(2)上设有标记试剂储存区(5)；加样区器件(1)与标记试剂储存区器件(2)沿相连处对折后，加样区(4)和标记试剂储存区(5)在位置上相对应；所示加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)上除加样区(4)和标记试剂储存区(5)以外的区域为疏水区，加样区(4)、标记试剂储存区(5)和废物吸收垫(3)为亲水区；所述加样区(4)包被细胞裂解液，所述标记试剂储存区(5)包被包含了末端脱氧核苷酸转移酶、FITC-dUTP和普鲁兰糖的标记试剂。
2.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述加样区器件(1)的材质包括Whatman Grade 1滤纸、Whatman Grade 5滤纸或Millipore Glass fiber滤纸；标记试剂储存区器件(2)的材质包括纤维素滤纸；废物吸收垫(3)的材质包括滤纸。
3.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，加样区(4)和标记试剂储存区(5)的形状包括圆形。
4.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述标记试剂为普鲁兰糖、末端脱氧核苷酸转移酶与FITC-dUTP的混合溶液，FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500，普鲁兰糖终浓度>10％(m/v)。
5.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)采用喷蜡打印机打印除加样区(4)和标记试剂储存区(5)以外的区域，将加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)加热至120-130℃，加热2-3min使蜡融化并渗透整个纸器件的厚度，形成疏水区。
6.权利要求1-5中任一项所述的一种集成化三维折纸器件的应用，其特征在于，在检测基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤及在评估污水或污染物样品遗传毒性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取暴露于污水或污染物中培养的动物的细胞或使用污染物暴露处理细胞，制备得到待检测的细胞悬浮液；
(2)将避光保存的集成化三维折纸器件平铺，使加样区器件、标记试剂储存区器件和废物吸收垫处于同一平面上；向加样区中加入待检测的细胞悬浮液，室温孵育，进行细胞裂解；
(3)将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组DNA；
(4)将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入ddH2O，使标记试剂储存区的标记试剂洗涤到加样区，室温孵育后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应；
(5)将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用1×PBS洗涤，使未标记的FITC-dUTP洗涤到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上；
(6)对加样区进行拍照检测荧光强度，对反应区的荧光强度扫描并定量，以实现基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤的检测，以评估污水或污染物样品遗传毒性。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中孵育的时间为2-5min，步骤(4)中孵育的时间为5-30min。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)所述动物包括斑马鱼，所述细胞包括斑马鱼肝细胞。
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