CN112888709A - 标靶cd22的构建体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中描述抗体(例如单链可变片段(scFv)抗体)及构建体，所述构建体包含结合于CD22的胞外结构域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗体部分。本文中还提供使用所述抗体或构建体或其组合物治疗性治疗特征在于CD22表达的疾病(确切地说，B细胞淋巴瘤及白血病)的方法。

Description

标靶CD22的构建体和其用途
背景技术
标靶CD19 B细胞抗原的免疫疗法对B细胞恶性病尤其有效(拉蒂格(Lartigue),标靶肿瘤学(Targeted Oncology),2014年8月1日)。然而，肿瘤细胞失去CD19表达会导致免疫疗法无效及引起癌症复发(格鲁普(Grupp)等人,新英格兰医学杂志(New Engl J Med.)368:1509,2013)。CD19肿瘤抗原逃逸强调需要标靶其它B细胞抗原，如CD22及CD52(格里洛-洛佩兹(Grillo-Lopez)等人,当代药品生物技术(Curr Pharm Biotechnol),2:301,2001)。
发明内容
本发明尤其提供特异性结合CD22，确切地说，人类CD22的构建体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为包含所描述的抗CD22抗体部分的多肽或组合物。举例来说，抗CD22构建体可为对原生形式(例如表达于细胞表面上)的人类CD22显示高特异性的抗体、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)或嵌合信号传导受体(CSR)。在一些实施例中，所提供的构建体可有效地介导特征在于CD22表达的癌细胞(例如淋巴瘤和/或白血病)的杀灭。
尽管本文中广泛论述使用含有人类抗体的构建体的实施例，其中所述人类抗体具有，即，包括人类CDR序列的人类重链及轻链可变区序列，但本发明还提供含有非人类抗体的构建体。在一些实施例中，非人类抗体包含来自如本文中所描述的抗体的人类CDR序列及非人类框架序列。在一些实施例中，非人类框架序列包括任何可用于使用一个或多个如本文中所描述的人类CDR序列产生合成重链和/或轻链可变区的序列，包括例如由小鼠、大鼠、兔、猪、母牛、鹿、绵羊、山羊、猫、犬、猴、鸡等产生的序列。在一些实施例中，所提供的构建体包括通过将一个或多个如本文中所描述的人类CDR序列移植到非人类框架序列(例如小鼠或鸡框架序列)上而产生的抗体。在许多实施例中，所提供的构建体包含或为人类抗体(例如人类单克隆抗体或其片段、人类抗原结合蛋白质或多肽、人类多特异性抗体(例如人类双特异性抗体)、具有人类免疫球蛋白多肽的一个或多个结构组件的人类多肽)。
在一个方面，本发明提供一种抗CD22构建体，其包含特异性结合于CD22的抗体部分，其中所述抗体部分包含：(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:218或212的轻链可变区的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2及LC-CDR3；及(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ IDNO:219或213的重链可变区的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2及HC-CDR3。
在一些实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:218的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:212的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在一些实施例中，抗体部分包含：(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:218的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；及(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:219的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
在一些实施例中，抗体部分包含：(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:212的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；及(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:213的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
在这一方面的一些实施例中，抗体部分包含以下中的一个或多个：具有序列HDIRNY(SEQ ID NO:214)的LC-CDR1、具有序列AAS(SEQ ID NO:215)的LC-CDR2、具有序列QQYDGLPLT(SEQ ID NO:216)的LC-CDR3、具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)的HC-CDR1、具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)的HC-CDR2及具有序列ARYGSAAWMDS(SEQ ID NO:217)的HC-CDR3。在特定实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:209、210及214-217的序列。
在这一方面的一些实施例中，轻链可变区具有与序列DIQLTQSPSSLSTSVGDRVTITCQASHDIRNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQTGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQYDGLPLTFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO:218)具有至少90％一致性的序列。
在这一方面的一些实施例中，重链可变区具有与序列QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGSAAWMDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:219)具有至少90％一致性的序列。
在另一方面，本发明提供一种抗CD22构建体，其包含轻链可变区及重链可变区，其中轻链可变区具有与序列DIQLTQSPSSLSTSVGDRVTITCQASHDIRNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQTGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQYDGLPLTFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO:218)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，并且重链可变区具有与序列ofQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGSAAWMDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:219)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。在一些实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO:218的序列，并且重链可变区包含SEQ ID NO:219的序列。
在本发明的第一方面的一些实施例中，抗体部分包含以下中的一个或多个：具有序列SSNIGNNY(SEQ ID NO:206)的LC-CDR1、具有序列ENN(SEQ ID NO:207)的LC-CDR2、具有序列GTWDSSLSAGAV(SEQ ID NO:208)的LC-CDR3、具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)的HC-CDR1、具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)的HC-CDR2及具有序列ARPYYDD(SEQ ID NO:211)的HC-CDR3。在一些实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:206-211的序列。
在这一方面的一些实施例中，构建体的轻链可变区具有与序列QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAGAVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:212)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。在一些实施例中，重链可变区具有与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYYDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:213)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。在一些实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO:212的序列，并且重链可变区包含SEQ ID NO:213的序列。
在另一方面，本发明提供一种抗CD22构建体，其包含与本文中所描述的抗CD22构建体竞争特异性结合于CD22的抗体部分。
在另一方面，本发明提供一种抗CD22构建体，其包含重链可变区及轻链可变区，并且其中轻链可变区具有与序列QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAGAVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:212)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，并且重链可变区具有与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYYDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:213)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。在特定实施例中，抗CD22构建体具有SEQ ID NO:212的轻链可变区序列及SEQ ID NO:213的重链可变区序列。
在一些实施例中，轻链可变区及重链可变区通过接头(例如具有序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233)的接头)连接。
在一些实施例中，构建体包含λ或κ同型的轻链。
在本文中所描述的方面中的任一个中，抗CD22构建体结合于CD22的胞外区域。在特定实施例中，CD22的胞外区域包含至少7个具有序列DVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRR(SEQ ID NO:205)的氨基酸。在特定实施例中，胞外区域具有SEQ ID NO:205的序列。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，抗CD22构建体为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体。在一些实施例中，抗CD22构建体为单特异性。在一些实施例中，抗CD22构建体为多特异性(例如双特异性)。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，抗CD22构建体进一步包含特异性结合于第二抗原的第二抗体部分。第二抗原可为T细胞(例如细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二抗原选自由以下组成的群组：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。在一些实施例中，第二抗原为自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核球、巨噬细胞或树突状细胞表面上的抗原。
在特定实施例中，第二抗原为CD3ε，并且其中构建体为串联scFv，其包含对具有SEQ ID NO:205的序列的CD22或其一部分具有特异性的N端scFv及对CD3ε具有特异性的C端scFv。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，抗CD22构建体为串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再标靶(DART)抗体、双重可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、锁钥结构(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。在特定实施例中，抗CD22构建体为串联scFv，其包含由肽接头连接的两个scFv(例如包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的肽接头)。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，构建体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域(例如T细胞受体跨膜结构域)及免疫细胞信号传导结构域，其中抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3以及分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在一些实施例中，CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域及免疫细胞信号传导结构域，其中抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在一些实施例中，免疫细胞信号传导结构域来自CD3ζ链。在其它实施例中，免疫细胞信号传导结构域来自CD28、4-1BB、ICOS或OX40。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，构建体为嵌合抗体-T细胞受体(caTCR，其也称为抗体-TCR嵌合分子或构建体(abTCR))，其包含结合于CD22(例如SEQ IDNO:205或其一部分)的胞外结构域及包含TCR跨膜结构域的T细胞受体(TCR)模块(TCRM)。在一些实施例中，caTCR包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，caTCR包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一个TCR相关信号传导模块(例如CD3δε、CD3γε及CD3ζ)。
在一些实施例中，caTCR的胞外结构域包含：(a)第一多肽，其包含有包含重链可变区(VH)及CH1抗体恒定结构域的第一抗原结合区；及(b)第二多肽链，其包含有包含轻链可变区(VL)及CL抗体恒定结构域的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区的VH及CH1抗体恒定结构域以及第二抗原结合区的VL及CL抗体恒定结构域形成特异性结合于CD22的Fab样抗原结合模块。
在一些实施例中，胞外结构域包含特异性结合于CD22的scFv。在一些实施例中，胞外结构域进一步包含至少一种其它特异性结合于至少一个非CD22抗原的抗体部分。在一些实施例中，所述至少一个非CD22抗原表达于B细胞恶性病中。在特定实施例中，胞外结构域进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分。在特定实施例中，胞外结构域进一步包含特异性结合于CD20的抗体部分。在特定实施例中，胞外结构域进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分及特异性结合于CD20的抗体部分。
在一些实施例中，caTCR与嵌合信号传导受体(CSR)组合表达。在一些实施例中，CSR包含抗CD22抗体部分。在一些实施例中，CSR包含特异性结合非CD22抗原的抗体部分。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，构建体为嵌合信号传导受体(CSR)。在一些实施例中，CSR包含(a)抗CD22抗体部分；(b)跨膜模块；及(c)能够向免疫细胞提供共刺激信号的共刺激免疫细胞信号传导模块，其中CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导结构域。在特定实施例中，抗CD22抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在特定实施例中，抗CD22抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在一些实施例中，CSR与caTCR或CAR组合使用(即，表达)。在一些实施例中，CSR与caTCR或CAR组合表达。
在一些实施例中，CSR与特异性标靶CD22的caTCR或CAR组合表达。在其它实施例中，CSR与不特异性标靶CD22的caTCR或CAR组合表达。
在一些实施例中，CSR进一步包含至少一种其它特异性结合于至少一个非CD22抗原的抗体部分。在特定实施例中，CSR进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分。在特定实施例中，CSR进一步包含特异性结合于CD20的抗体部分。
在一些实施例中，CSR包含来自相同分子的跨膜片段及胞内片段。在特定实施例中，分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特异性结合CD83的配体。在特定实施例中，分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30及CD27。
在其它实施例中，CSR包含来自不同分子的跨膜片段及胞内片段。在一些实施例中，CSR包含选自由以下组成的群组的分子的跨膜片段：T细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链；CD28；CD3ε；CD3ζ；CD45；CD4；CD5；CD8；CD9；CD16；CD22；CD33；CD37；CD64；CD80；CD86；CD134；CD137及CD154(例如CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30或OX40的跨膜片段)。在特定实施例中，跨膜片段包含SEQ ID NO:145-150中的任一个的序列。在一些实施例中，CSR包含选自由以下组成的群组的分子的胞内片段：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特异性结合CD83的配体(例如选自由以下组成的群组的分子的胞内片段：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30及CD27)。在特定实施例中，胞内片段包含SEQ ID NO:151-155中的任一个的序列。在其它实施例中，CSR包含SEQ ID NO:156-171中的任一个的序列。
在本文中所描述的方面中的任一个的一些实施例中，抗CD22构建体为包含抗体部分及效应分子的免疫结合物。效应分子可为选自由以下组成的群组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽及核酸(例如药物或毒素)。在一些实施例中，效应分子可为标记。
在另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本文中所描述的抗CD22构建体中所含的一种或多种多肽。举例来说，核酸分子可编码构建体的轻链可变区(例如SEQ ID NO:212或218)或重链可变区(例如SEQ ID NO:213或219)。在一些实施例中，核酸分子可编码scFv抗体(例如SEQ ID NO:239或240)。在其它实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体(例如抗CD22 CAR或caTCR)中的不同多肽可由多个单独的核酸分子编码。举例来说，本文中所描述的抗CD22构建体(例如抗CD22 CAR或caTCR)中的两个多肽可由两个单独的核酸分子编码。在一些实施例中，核酸分子编码本文中所描述的抗CD22构建体中所含的所有多肽。
在这一方面的一些实施例中，抗CD22构建体为caTCR并与CSR组合表达，并且其中核酸分子编码caTCR中所含的所有多肽及CSR的多肽；或抗CD22构建体为CSR并与caTCR或CAR组合表达，并且其中核酸分子编码CSR的多肽及caTCR或CAR中所含的所有多肽。
在另一方面，本发明提供分别编码本文中所描述的抗CD22构建体中所含的所有多肽的核酸分子的集合。
在这一方面的一些实施例中，抗CD22构建体为caTCR并与CSR组合表达，并且其中核酸分子的集合编码caTCR中所含的所有多肽及CSR的多肽；或抗CD22构建体为CSR并与caTCR或CAR组合表达，并且其中核酸分子的集合编码CSR的多肽及caTCR或CAR中所含的所有多肽。
在另一方面，本发明还提供包含上文所描述的核酸分子的表达盒，其可操作地连接于启动子，所述启动子在一些情况下对核酸内的编码序列为异源的。当使用多个单独的核酸分子编码本文中所描述的抗CD22构建体中的多个多肽时，所述多个单独的核酸分子可安置于多个表达盒中。
在另一方面，本发明提供分别包含编码本文中所描述的抗CD22构建体中所含的所有多肽的核酸分子的表达盒的集合。在一些实施例中，表达盒的集合包含上文所描述的核酸分子的集合。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上文所描述的核酸分子、核酸分子的集合、表达盒或表达盒的集合。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其表达本文中所描述的抗CD22构建体。在一些实施例中，宿主细胞包含本文中所描述的核酸分子、核酸分子的集合、表达盒或表达盒的集合。
在另一方面，本发明提供一种制备本文中所描述的抗CD22构建体的方法，其中所述方法包含：(a)提供包含上文所描述的核酸分子、核酸分子的集合、表达盒或表达盒的集合的宿主细胞，及b)在允许形成抗CD22构建体的条件下，在宿主细胞中表达核酸分子或表达盒。
在另一方面，本发明提供一种医药组合物，其包含上文所描述的抗CD22构建体、编码上文所描述的抗CD22构建体中所含的一个或多个多肽的核酸、编码上文所描述的抗CD22构建体中所含的一个或多个多肽的核酸分子的集合、包含核酸分子的表达盒、包含多个核酸分子的表达盒的集合或表达抗CD22构建体的宿主细胞及一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，医药组合物中的构建体为治疗有效量的。
在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的个体中的B细胞恶性病的方法，其包含向个体投与治疗有效量的本文中所描述的抗CD22构建体、核酸分子、核酸分子的集合、表达盒、表达盒的集合、宿主细胞或医药组合物。
在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的个体中的特征在于CD22过表达的疾病或病症的方法，其包含向个体投与治疗有效量的本文中所描述的抗CD22构建体、核酸分子、核酸分子的集合、表达盒、表达盒的集合、宿主细胞或医药组合物。在一些实施例中，所述方法为治疗疾病的方法。在一些实施例中，所述方法为治疗病症的方法。在一些实施例中，特征在于CD22过表达的疾病或病症为癌症(例如B细胞恶性病)。
在另一方面，本发明提供一种治疗方法，其包含将核酸分子、核酸分子的集合、表达盒或表达盒的集合引入从个体分离的一个或多个原代细胞中及向个体投与包含一个或多个核酸的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在向个体投与细胞之前扩增细胞。在一些实施例中，原代细胞为淋巴细胞。在一些实施例中，原代细胞为T细胞。
在另一方面，本发明提供一种检测样品中的CD22的方法，其包含：(a)使样品与本文中所描述的抗CD22构建体接触；及(b)直接或间接检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。在一些实施例中，抗CD22构建体与可检测标记(例如发色、酶促、放射性同位素、同位素、荧光、毒性、化学发光或核磁共振对比剂)结合。在一些实施例中，通过检测可检测标记来直接检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。在其它实施例中，使用二级抗体间接检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。
在另一方面，本发明提供一种诊断怀疑患有CD22相关疾病或病症的个体的方法，其包含：a)向个体投与有效量的本文中所描述的抗CD22构建体；及b)直接或间接测定抗CD22构建体与个体中的任何CD22之间的结合量，其中结合量高于阈值量表明个体患有CD22相关疾病或病症。
在本文中所描述的方法的一些实施例中，CD22相关疾病或病症为癌症(例如B细胞恶性病)。
在另一方面，本发明提供一种诊断患有B细胞恶性病的个体的方法，其包含：(a)使来源于个体的样品与本文中所描述的抗CD22构建体接触；及(b)测定与样品中的抗CD22构建体结合的细胞的数目，其中与抗CD22构建体结合的细胞的数值高于阈值量表明个体患有B细胞恶性病。
在本文中所描述的方法中的任一种的一些实施例中，疾病、病症或B细胞恶性病为B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一些实施例中，B细胞恶性病为CD22+B细胞恶性病或B细胞相关癌症。在一些实施例中，B细胞恶性病为B细胞淋巴瘤(例如CD22+B细胞淋巴瘤)或B细胞白血病(例如CD22+B细胞白血病)。在特定实施例中B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)选自由以下组成的群组：急性成淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病及无标志性急性成淋巴细胞白血病(null-acute lymphoblastic leukemia)。在本文中所描述的方法中的任一种的一些实施例中，个体为人类。
在另一方面，本发明提供本文中所描述的抗CD22构建体、核酸分子、核酸分子的集合、表达盒、表达盒的集合、宿主细胞所述医药组合物的用途，其用于治疗与阳性CD22表达相关的疾病或病症。
在另一方面，本发明提供本文中所描述的抗CD22构建体、核酸分子、核酸分子的集合、表达盒、表达盒的集合、宿主细胞或医药组合物的用途，其用于制造用以治疗与阳性CD22表达相关的疾病或病症的药剂。
在另一方面，本发明提供本文中所描述的抗CD22构建体的用途，其用于诊断与阳性CD22表达相关的疾病或病症。在一些实施例中，与阳性CD22表达相关的疾病或病症为癌症。
定义
本发明的范围由随附权利要求书界定并且不受本文中所描述的特定实施例限制；所属领域的技术人员阅读本发明，将知晓可等效于此类所描述的实施例，或以其它方式在权利要求书的范围内的各种修改。
一般来说，除非另外明确指示，否则本文中所用的术语与其在所属领域中所理解的含义一致。以下提供某些术语的明确定义；所属领域的技术人员将由上下文了解这些及其它术语在特定情况下在本说明书通篇中的含义。
为了使本发明可更易于理解，首先在下文对某些术语进行定义。以下术语及其它术语的额外定义贯穿本说明书阐述。
投药：如本文中所使用，术语“投药”指代向个体或系统(例如向细胞、器官、组织、生物体或其相关组分或一组组分)投与组合物。普通技术人员将了解，投药途径可例如视接受组合物投药的个体或系统、组合物的性质、投药目的等而变化。举例来说，在某些实施例中，对动物个体(例如人类)的投药可为支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、经肠、皮间、动脉内、皮内、胃内、肝内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、瘤内、静脉内、室内、经粘膜、经鼻、经口、经直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、经阴道和/或玻璃体。在一些实施例中，投药可涉及间歇性给药。在一些实施例中，投药可涉及连续给药(例如灌注)持续至少所选时间段。
亲和力：如所属领域中已知，“亲和力”为特定配体与其搭配物的结合的紧密性的度量。可以不同方式测量亲和力。在一些实施例中，通过定量分析法测量亲和力。在一些此类实施例中，结合搭配物浓度可固定为超过配体浓度，以模拟生理学条件。或者或另外，在一些实施例中，结合搭配物浓度和/或配体浓度可变化。在一些此类实施例中，可在可比较的条件(例如浓度)下比较亲和力与参考物。
亲和力成熟(或亲和力成熟抗体)：如本文中所使用，指代在一个或多个CDR(或在一些实施例中，框架区)中具有一种或多种变化的抗体，与不具有所述一种或多种变化的亲本抗体相比，所述一种或多种变化引起抗体对抗原的亲和力改进。在一些实施例中，亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔级亲和力。亲和力成熟抗体可通过所属领域中已知的多种程序中的任一个产生。马克斯(Marks)等人,1992,生物技术(BioTechnology)10:779-783描述通过VH及VL结构域改组进行的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机突变诱发由以下描述：巴巴斯(Barbas)等人,1994,美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.)91:3809-3813；希尔(Schier)等人,1995,基因(Gene)169:147-155；耶尔顿(Yelton)等人,1995.免疫学杂志(J.Immunol.)155:1994-2004；杰克逊(Jackson)等人,1995,免疫学杂志154(7):3310-9；及霍金斯(Hawkins)等人,1992,分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)226:889-896。具有改进的结合特性的结合剂的选择由德蒂(Thie)等人,2009,分子生物学方法(Methods Mol.Bio.)525:309-22描述。
试剂：如本文中所使用，可指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、醣、脂质、小分子、金属或其组合。在一些实施例中，试剂为或包含天然产物，因为其是在自然界中发现和/或由自然界获得。在一些实施例中，试剂为或包含一种或多种人造实体，因为其经由人工操作来设计、工程改造和/或产生和/或未在自然界中发现。在一些实施例中，试剂可以经分离或纯形式使用；在一些实施例中，试剂可以粗物质形式使用。在一些实施例中，以集合或库的形式提供潜在试剂，例如其可经筛选以鉴定或表征其内的活性剂。可根据本发明使用的试剂的一些特定实施例包括小分子、抗体、适体、核酸(例如siRNA、shRNA、DNA/RNA混合物、反义寡核苷酸、核糖核酸酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施例中，试剂为或包含聚合物。在一些实施例中，试剂不为聚合物和/或大体上不含任何聚合物。在一些实施例中，试剂含有至少一个聚合部分。在一些实施例中，试剂不具有或大体上不含任何聚合部分。
氨基酸：如本文中所使用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上指代可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通式结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸为合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为l-氨基酸。“标准氨基酸”指代通常发现于天然存在的肽中的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”指代除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其以合成方式制备或由天然来源获得。如本文中所使用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代物。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基端氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或用可改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其它化学基团进行的取代来修饰。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包含一或翻译后修饰，如与一个或多个化学实体(例如甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。将由使用术语的上下文显而易见其指代游离氨基酸抑或肽的残基。
动物：如本文中所使用，指代动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”指代任一性别并且处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”指代处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物为哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪、母牛、鹿、绵羊、山羊、猫、犬或猴)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、经基因工程改造的动物和/或克隆。
抗体部分：如本文中所使用，此术语涵盖全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包含两个重链及两个轻链。轻链及重链的可变区负责抗原结合。两种链中的可变区通常含有三个高度可变环，称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3的轻链(LC)CDR及包括HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3的重链(HC)CDR)。本文中所公开的抗体及抗原结合片段的CDR边界可根据卡巴特(Kabat)、科西亚(Chothia)或Al-拉兹卡尼(Al-Lazikani)公约(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat1991)界定或鉴别。重链或轻链的三个CDR插入称为框架区(FR)的侧接片段之间，所述侧接片段的保守性比CDR更高并形成支撑高变环的支架。重链及轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现各种效应功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列分类。五种主要类别或同型的抗体为IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特征为分别存在α、δ、ε、γ及μ重链。若干主要抗体类别分成子类，如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
抗原结合片段或抗原结合部分：如本文中所使用，术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”指代抗体片段，包括例如双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双功能抗体(ds双功能抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体，或结合于抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合于与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可包含接枝于来自一种或多种不同人类抗体的框架区的来自特定人类抗体的一种或多种CDR。
生物活性：如本文中所使用，指代通过相关试剂或实体实现的可观测的生物作用或结果。举例来说，在一些实施例中，特异性结合相互作用为生物活性。在一些实施例中，生物路径或事件的调节(例如诱导、增强或抑制)为生物活性。在一些实施例中，生物活性的存在或程度经由检测通过相关生物路径或事件产生的直接或间接产物来评估。
双特异性抗体：如本文中所使用，指代其中至少一个并且通常两个结合部分为或包含抗体部分的双特异性结合剂。多种不同双特异性抗体结构为所属领域中已知的。在一些实施例中，本身为或包含抗体部分的双特异性抗体中的各结合部分包括VH和/或VL区；在一些此类实施例中，VH和/或VL区为在特定单克隆抗体中发现的那些区域。在一些实施例中，当双特异性抗体含有两个抗体部分时，各包括来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。
如本文中所使用，术语“双特异性抗体”还指具有两个离散结合部分(其各自结合不同目标)的多肽。在一些实施例中，双特异性结合抗体为单一多肽；在一些实施例中，双特异性结合抗体为或包含多个肽，其在一些此类实施例中可彼此共价结合，例如通过交联。在一些实施例中，双特异性结合抗体的两个结合部分识别相同目标(例如抗原)的不同位点(例如表位)；在一些实施例中，其识别不同目标。在一些实施例中，双特异性结合抗体能够同时结合两个目标，其具有不同结构。
载剂：如本文中所使用，指代与组合物一起投与的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。在一些示例性实施例中，载剂可包括无菌液体，如水及油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施例中，载剂为或包括一种或多种固体组分。
CDR：如本文中所使用，术语“CDR”或“互补决定区”意指重链与轻链多肽的可变区内存在的非相邻抗原组合位点。重链及轻链的可变区中的每一个中存在三个CDR，对于各可变区，所述CDR命名为CDR1、CDR2及CDR3。“一组CDR”或“CDR组”指代一组三个或六个在能够结合抗原的单一可变区中出现的CDR或能够结合抗原的同源重链及轻链可变区的CDR。这些特定区域已由卡巴特等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)252:6609-6616(1977)；卡巴特等人,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of proteins of immunological interest)”(1991)；科西亚等人,分子生物学期刊196:901-917(1987)；Al-拉兹卡尼B.(Al-Lazikani B.)等人,分子生物学期刊,273:927-948(1997)；麦卡勒姆(MacCallum)等人,分子生物学期刊262:732-745(1996)；艾宾纳丹(Abhinandan)及马丁(Martin),分子免疫学(Mol.Immunol.),45:3832-3839(2008)；勒弗朗M.P.(Lefranc M.P.)等人,发育免疫学与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.),27:55-77(2003)；及霍内格(Honegger)及普卢克图恩(Plückthun),分子生物学期刊,309:657-670(2001)描述，其中定义包括当彼此比较时，氨基酸残基的重迭或子集。然而，使用任一定义来提及抗体或接枝抗体的CDR或其变异体意图属于如本文所定义及使用的术语的范围内。涵盖如上文所引用的各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基阐述于下表1中作为比较。CDR预测算法及界面为所属领域中已知的，包括例如艾宾纳丹及马丁,分子免疫学,45:3832-3839(2008)；埃勒曼F.(Ehrenmann F.)等人,核酸研究(Nucleic Acids Res.),38:D301-D307(2010)；及阿道夫-布雷福格尔J.(Adolf-BryfogleJ.)等人,核酸研究,43:D432-D438(2015)。此段落中所引用的参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中以用于本发明中并且可能包括于本文的一个或多个技术方案中。
表1
卡巴特<sup>1</sup> 科西亚<sup>2</sup> 麦卡勒姆<sup>3</sup> IMGT<sup>4</sup> AHo<sup>5</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1残基编号遵循前述卡巴特等人的命名法
2残基编号遵循前述科西亚等人的命名法
3残基编号遵循前述麦卡勒姆等人的命名法
4残基编号遵循前述勒弗朗等人的命名法
5残基编号遵循前述霍内格及普卢克图恩的命名法
分化丛集22或CD22：如本文中所使用，除非另有指示，否则指代来自任何脊椎动物来源的任何原生CD22，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人类、食蟹猕猴(cyno))及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未经处理的CD22以及由在细胞中处理所产生的任何形式的CD22。所述术语还涵盖天然存在的CD22的变异体，例如剪接变异体、等位基因变异体及同功异型物。CD22(CD22β)的主要同功异型物在胞外结构域中包含847个氨基酸及七个免疫球蛋白样区域(参见威尔逊G.L.(Wilson,G.L.)等人,实验医学期刊(J.Exp.Med.)173:137-146(1991))。较小同功异型物CD22α在胞外结构域中包含647个氨基酸并且不具有免疫球蛋白样结构域3及4(参见斯塔门科维奇I.(Stamenkovic,I.)及希德B.(Seed,B.),自然(Nature)345:74-77(1990))及威尔逊等人(1991),见上文)。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ IDNO:205或其一部分)。
特征在于CD22过表达的疾病：如本文中所使用，指代特征在于在细胞表面上过表达CD22的细胞或由其引起的疾病或病症。在一些实施例中，特征在于CD22过表达的疾病或病症为CD22+B细胞恶性病。
CD22+B细胞恶性病：如本文中所使用，指代特征在于在细胞表面上过表达CD22的B细胞或由其引起的疾病或病症。在一些实施例中，CD22+B细胞恶性病为B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
嵌合抗原受体(CAR)：本发明的构建体，包括单链可变片段(scFv)，可用于制备嵌合抗原受体，其制备方法及用途通常为所属领域中已知的。嵌合抗原受体(CAR)为人工构建的杂交单链蛋白质或单链多肽，其含有单链可变片段(scFv)作为胞外抗原结合结构域的一部分，连接于跨膜结构域(例如TCR跨膜结构域)，其又连接于胞内免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)信号传导结构域(例如共刺激结构域；例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等的胞内结构域的一部分；TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞内结构域的一部分；CD3ζ的胞内结构域的一部分)。CAR的特征包括其以MHC限制性(在TCR模拟抗体的情况下)或非MHC限制性(在针对细胞表面蛋白质的抗体的情况下)方式，利用单克隆抗体的抗原结合特性重新引导免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)对所选目标的特异性及反应性的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)识别与抗原处理无关的抗原的能力，因此略过肿瘤逃避的主要机制。
存在三代CAR。“第一代”CAR通常为单链多肽，其由与跨膜结构域融合的作为抗原结合结构域的scFv构成，所述跨膜结构域与T细胞受体(TCR)链的细胞质/胞内结构域融合。“第一代”CAR通常具有来自CD3ξ链的胞内结构域，其为内源性TCR中的信号的主要发射器。“第一代”CAR可提供从头抗原识别并且经由其在单一融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域引起CD4+及CD8+T细胞的活化，与HLA介导的抗原呈现无关。
“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的胞内结构域添加到CAR的细胞质尾中以向T细胞提供其它信号。“第二代”CAR包含提供共刺激(例如CD28或4-IBB)及活化(例如CD3ζ)的CAR。临床前研究表明，“第二代”CAR可改进T细胞的抗肿瘤活性。举例来说，经“第二代”CAR修饰的T细胞的稳定功效在标靶慢性成淋巴细胞白血病(CLL)及急性成淋巴细胞白血病(ALL)患者中的CD19分子的临床试验中得到证实。
在一些实施例中，本文中提供的经工程改造的免疫细胞表达“第三代”CAR。“第三代”CAR包含提供多种共刺激作用(例如CD28及4-1BB)及活化作用(CD3ζ)的CAR。
嵌合抗体-T细胞受体构建体或caTCR：如本文中所使用，此术语指代包含两个单独的多肽链的功能性多肽复合物，一个多肽链包括抗体重链可变区(VH)及抗体重链恒定区(CH)，并且另一个多肽链包括抗体轻链可变区(VL)及抗体轻链恒定区(CL)。因此，如本文中所定义，caTCR为2-子单元构建体，每个子单元同与跨膜结构域(例如TCR跨膜结构域)及胞内免疫细胞信号传导结构域融合的细胞膜锚定型抗体重链或轻链大体上类似。在一些实施例中，caTCR不包括共刺激结构域(例如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ的胞内结构域的一部分)。在一些实施例中，caTCR包含a)包含抗体部分的胞外结构域，及b)能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。在一些实施例中，抗CD22 caTCR包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。
如本文中所定义，caTCR包含第一多肽链及第二多肽链，其中第一多肽链包含与抗体CH融合的抗体VH，所述抗体CH与跨膜结构域及胞内免疫细胞信号传导结构域融合，并且第二多肽包含与抗体CL融合的抗体VL，所述抗体CL与跨膜结构域及胞内免疫细胞信号传导结构域融合。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，抗CD22 caTCR为杂二聚体，其包含第一多肽链及第二多肽链。在一些实施例中，第一多肽链及第二多肽链通过至少一个二硫键连接。抗CD22 caTCR的特异性来源于赋予CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)结合特异性的抗体部分。
术语“嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)”及“抗体-TCR嵌合分子或构建体(abTCR)”可互换地使用。caTCR的其它描述及实例可见于例如2017年4月26日提交的美国申请第62/490,576号中，其以全文引用的方式并入本文中。
授受细胞疗法：授受性细胞疗法为治疗性方法，其通常包括分离及离体扩增和/或处理免疫细胞(例如NK细胞或T细胞)并随后向患者投与这些细胞，例如以用于治疗癌症。所投与的细胞可为自体或同种异体。可以任一种已知方式处理细胞以表达经工程改造的受体(包括CAR、caTCR及经工程改造的TCR)，包括例如使用RNA及DNA转染、病毒转导、电致孔，其皆为所属领域中已知的技术。
术语“授受性细胞治疗组合物”指代任何包含适用于授受性细胞转移的细胞的组合物。在示例性实施例中，授受性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的群组的细胞类型：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、经TCR(即，异源T细胞受体)修饰的淋巴细胞(例如eTCR T细胞及caTCR T细胞)及经CAR(即，嵌合抗原受体)修饰的淋巴细胞(例如CAR T细胞)。在另一实施例中，授受性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的群组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK-细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞及外周血液单核细胞。在另一实施例中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞或外周血液单核细胞形成授受性细胞治疗组合物。在一个实施例中，授受性细胞治疗组合物包含T细胞。
在一些实施例中，表达于细胞中的抗CD22构建体为CAR(例如“第一代”、“第二代”或“第三代”CAR，如上文所描述)。根据本发明所公开的目标物，本文中提供的经工程改造的免疫细胞的CAR包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及胞内结构域。
在一些实施例中，抗CD22构建体为caTCR。如上文所定义，caTCR为2-子单元构建体，每个子单元同与跨膜结构域(例如TCR跨膜结构域)融合的细胞膜锚定型抗体重链或轻链大体上类似。在一些实施例中，caTCR不包括免疫细胞信号传导结构域(例如共刺激结构域)。在一些实施例中，caTCR本身不包含TCR相关信号传导分子(如CD3δε、CD3γε和/或CD3ζ)，至少不包含功能性TCR相关信号传导分子或TCR相关信号传导分子的功能性片段。在一些实施例中，caTCR包含抗原结合模块(即，胞外抗原结合结构域)，其提供实现CD3募集及信号传导的抗原特异性及T细胞受体模块(TCRM)。抗原结合模块(即，胞外抗原结合结构域)不为天然存在的T细胞受体抗原结合部分。在一些实施例中，抗原结合模块(即，胞外抗原结合结构域)连接于TCRM中的多肽链的氨基端。在一些实施例中，抗原结合模块(即，胞外抗原结合结构域)为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。TCRM包含来源于一个或多个TCR的跨膜域的跨膜模块(TCR-TM)，如αβ和/或γδTCR，并且任选地进一步包含TCR的连接肽或其片段和/或一个或多个TCR胞内结构域或其片段中的一个或两个。在一些实施例中，TCRM包含两个多肽链，各多肽链从氨基端至羧基端包含连接肽、跨膜结构域及任选的TCR胞内结构域。在一些实施例中，TCRM包含一个或多个非天然存在的TCR结构域。举例来说，在一些实施例中，TCRM包含一个或两个非天然存在的TCR跨膜结构域。非天然存在的TCR结构域可为天然存在的TCR的对应结构域，其通过一个或多个氨基酸的取代和/或通过用来自另一TCR的类似结构域的一部分置换对应结构域的一部分而经修饰。caTCR可包含第一多肽链及第二多肽链，其中第一及第二多肽链共同形成抗原结合模块及TCRM。在一些实施例中，第一及第二多肽链为单独的多肽链，并且caTCR为多聚体，如二聚体。在一些实施例中，第一与第二多肽链共价连接，如通过肽键或通过另一种化学键(如二硫键)连接。在一些实施例中，第一多肽链及第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施例中，caTCR进一步包含一个或多个T细胞共刺激信号传导序列。caTCR的实例描述于例如国际公开第WO2017/070608号及2017年4月26日提交的美国临时申请第62/490,576号中，其皆以全文引用的方式并入本文中。
可比性：如本文中所使用，指代两种或更多种试剂、实体、情况、病状组等可彼此不一致但充分类似，以允许在其之间进行比较以使得可基于观测到的差异或类似性合理地得出结论。在一些实施例中，可比较的病状组、情形、个体或群体的特征在于多个大体上一致的特征及一个或少数不同特征。所属领域的普通技术人员将在上下文中理解在任何既定情形中两种或更多种此类试剂、实体、情况、病状组等视为可比较所需要的一致性程度。举例来说，所属领域的普通技术人员应了解，当通过保证在不同情形组、个体或群体下或在所述情况下获得的结果或观测的现象中的差异由变化的那些特征的变化引起或表明所述变化的合理结论的足够数目及类型的大体上一致特征表征时，情形组、个体或群体彼此可比较。
对照物：如本文中所使用，指代所属领域中理解的如下含义：“对照物”为结果与其比较的标准。通常，对照物用于通过分离变量以便得出关于此类变量的结论来强化实验的完整性。在一些实施例中，对照物为与测试反应或分析法同时进行以提供比较的反应或分析法。如本文中所使用，“控制物”可指“对照抗体”。“对照抗体”可为如本文中所描述的人类、嵌合、人类化、CDR接枝、多特异性或双特异性抗体；与如本文中所描述不同的抗体或亲本抗体。在一个实验中，应用“测试”(即测试的变量)。在第二实验中，不应用“对照物”(测试的变量)。在一些实施例中，对照物为历史对照物(即先前进行的测试或分析法的对照物，或先前已知的量或结果)。在一些实施例中，对照物为或包含印刷或以其它方式保存的记录。对照物可为阳性对照物或阴性对照物。
对应于：如本文中所使用，表示氨基酸残基在相关多肽中的位置/一致性。普通技术人员将了解，出于简单性的目的，多肽中的残基通常使用典型编号系统基于参考相关多肽命名，以使得“对应于”位置190处的残基的氨基酸例如无需实际上为特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于在参考多肽中的190处发现的残基；所属领域的普通技术人员容易了解如何鉴别“对应”氨基酸。
检测实体/检测剂：如本文中所使用，指代可检测的任何组件、分子、官能基、化合物、片段或部分。在一些实施例中，单独提供或利用检测实体。在一些实施例中，检测实体与另一试剂结合(例如与其接合)提供和/或利用。检测实体的实例包括(但不限于)：各种配体、放射性核种(例如3H、14C、18F、19F、32P、35S、135I、125I、123I、64Cu、187Re、111In、90Y、99mTc、177Lu、89Zr等)、荧光染料(关于特定示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(如吖啶酯、稳定二氧杂环丁烷等)、生物发光剂、光谱可分辨无机荧光半导体纳米结晶(即量子点)、金属纳米粒子(例如金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁金属离子、酶(关于酶的特定实例，参见下文)、比色标签(如染料、胶态金等)、生物素、洋地黄毒苷、半抗原及可获得免疫血清或单克隆抗体的蛋白质。
效应功能：如本文中所使用，指代由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应功能包括(但不限于)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)及补体介导的细胞毒性(CMC)。在一些实施例中，效应功能为在结合抗原之后操作的功能，独立于抗原结合操作的功能，或其两者。
效应细胞：如本文中所使用，指代介导一种或多种效应功能的免疫系统细胞。在一些实施例中，效应细胞可包括(但可不限于)以下中的一种或多种：单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、兰格汉氏细胞(Langerhans'cell)、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞并且可来自任何生物体，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔及猴。
工程改造：如本文中所使用，通常指已经人工处理的方面。举例来说，在一些实施例中，当两个或更多个不以自然界中的顺序连接在一起的序列经人工处理以在经工程改造的聚核苷酸中彼此直接连接时，所述聚核苷酸可视为经“工程改造”。在一些特定此类实施例中，经工程改造的聚核苷酸可包含发现本质上与第一编码序列可操作结合但不与第二编码序列可操作结合，通过人工连接以使得其与第二编码序列可操作地结合的调节序列。或者或另外，在一些实施例中，各编码多肽组件或结构域的本质上彼此不连接的第一及第二核酸序列可在单一经工程改造的聚核苷酸中彼此连接。类似地，在一些实施例中，如果细胞或生物体已经处理以使得其遗传信息改变(例如已经引入先前不存在的新颖遗传物质或先前存在的遗传物质已经改变或去除)，那么其可视为经“工程改造”。作为惯例并且如所属领域人员所理解，经工程改造的聚核苷酸或细胞的后代通常仍称为经“工程改造”，即使实际处理是对先前实体进行。此外，如所属领域的技术人员将了解，可使用多种可实现如本文所描述的“工程改造”的方法。举例来说，在一些实施例中，“工程改造”可涉及经由使用经程序化以执行分析或比较或以其它方式分析、推荐和/或选择序列、变化等的计算机系统来选择或设计(例如选择或设计核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体)。或者或另外，在一些实施例中，“工程改造”可涉及使用体外化学合成方法和/或重组型核酸技术，如核酸扩增(例如经由聚合酶链反应)、杂交、突变、转化、转染等，和/或多种控制配对方法中的任一种。如所属领域的技术人员将了解，多种现有此类技术(例如对于重组型DNA，寡核苷酸合成以及组织培养及转化(例如电致孔、脂质体转染等))为所属领域中所熟知的并且描述于本发明中通篇引用和/或论述的各种通用及更特定参考文献中。参见例如桑布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约州冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.),1989)。
表位：如本文中所使用，包括由免疫球蛋白(例如抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施例中，表位包含抗原上的多个化学原子或基团。在一些具体例中，当抗原采用相关三维构形时，此类化学原子或基团为表面暴露的。在一些实施例中，当抗原采用此类构形时，此类化学原子或基团在空间中以物理方式彼此接近。在一些实施例中，当抗原采用替代构形(例如经线性化)时，至少一些此类化学原子或基团以物理方式彼此分离。在本发明的一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体结合于包含SEQ ID NO:205的序列的至少7个氨基酸(例如SEQ ID NO:205的序列的至少7个相邻氨基酸)的表位。本文中所描述的抗CD22构建体可结合于包含SEQ ID NO:205的序列的7至50个氨基酸(例如7至50个相邻氨基酸)，例如SEQ ID NO:205的序列的7至45个、7至7至40个、7至35个、7至30个、7至25个、7至20个、7至15个、7至10个、10至50个、15至50个、20至50个、25至50个、30至50个、35至50个、40至50个、45至50个、10至45个、15至40个、20至35个或25至30个氨基酸的表位。
赋形剂：如本文中所使用，指代可包括于医药组合物中例如以提供或促进所需稠度或稳定作用的非治疗剂。适合的医药赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。
表达盒：如本文中所使用，指代在引入宿主细胞中时分别引起RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。
异源：如本文中所使用，指代不天然存在于宿主细胞或宿主生物体中的聚核苷酸或多肽。可使用熟知的重组方法将异源聚核苷酸或多肽引入宿主细胞或宿主生物体中，例如使用包含任选地连接于启动子的异源聚核苷酸的表达盒。
框架或框架区：如本文中所使用，指代可变区减去CDR的序列。因为CDR序列可通过不同系统测定，同样地框架序列相对应地有不同解释。六个CDR将重链及轻链上的框架区分成各链上的四个子区(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，并且CDR3位于FR3与FR4之间。在不将特定子区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如由其它提及的框架区表示单一、天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文中所使用，FR表示四个子区中之一，例如FR1表示最接近可变区的氨基端及相对于CDR1的5'的第一框架区，并且FR表示组成框架区的子区中的两个或更多个。
宿主细胞：如本文中所使用，指代已引入外源DNA(重组或以其它方式)的细胞。技术人员在阅读本发明后应理解此类术语不仅指特定个体细胞，并且还指此类细胞的后代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而于后代中发生，此类后代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍包括于如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞包括选自适用于表达外源DNA(例如重组型核酸序列)的生物界中的任一种的原核及真核细胞。示例性细胞包括原核生物及真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)的菌株等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、毕赤嗜甲醇酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物，如融合瘤或四源杂交瘤。在一些实施例中，宿主细胞为人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，宿主细胞为真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如CHO Kl、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、海拉(HeLa)、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、杰卡特(Jurkat)、道迪(Daudi)、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏细胞(Sertoli cell)、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞及来源于前述细胞的细胞系。在一些实施例中，宿主细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
人类抗体：如本文中所使用，意图包括具有由人类免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变及恒定区的抗体。在一些实施例中，尽管抗体(或抗体部分)的氨基酸序列包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的残基或组件(例如包括序列变化，例如可(最初)通过体外随机或定点突变诱发或通过体内体细胞突变引入的序列变化)，例如在一个或多个CDR及特定CDR3中，但其仍可被视为“人类”。人类抗体、人类抗体部分及其片段可从人类免疫细胞分离或以重组或合成方式产生，包括半合成。
人类化：如所属领域中已知，术语“人类化”通常用于指满足以下条件的抗体(或部分)：其氨基酸序列包括来自在非人类物种(例如小鼠)中产生的参考抗体的VH及VL区序列，但与参考抗体相比还包括所述序列中的意图使其“人类样”程度更高的修饰，即更类似于人类生殖系可变序列。在一些实施例中，“人类化”抗体(或抗体部分)为满足以下条件的抗体(或抗体部分)：免疫特异性结合于相关抗原并且具有含有与人类抗体的氨基酸序列大体上相同的氨基酸序列的框架(FR)区，及具有与非人类抗体的氨基酸序列大体上相同的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人类化抗体包含至少一个并且通常两个可变结构域中的大体上全部(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或大体上所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的CDR区并且所有或大体上所有框架区为具有人类免疫球蛋白共同序列的框架区。在一些实施例中，人类化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常至少一部分人类免疫球蛋白恒定区。在一些实施例中，人类化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域两者。抗体还可包括重链恒定区的CH1、铰链、CH2、CH3及任选的CH4区。在一些实施例中，人类化抗体仅含有人类化VL区。在一些实施例中，人类化抗体仅含有人类化VH区。在某些实施例中，人类化抗体含有人类化VH及VL区。
亲水性：如本文中所使用，术语“亲水性”和/或“极性”指代与水混合或易于溶解于水中的趋势。
疏水性：如本文中所使用，术语“疏水性”和/或“非极性”指代排斥水、不与水组合或不易于溶解于水中的趋势。
改善、增加或降低：如本文中所使用，或其语法等效物，指示相对于基线测量值的值，如在开始本文中描述的治疗之前同一个体的测量值，或在不存在本文中描述的治疗的情况下对照个体(或多名对照个体)的测量值。“对照个体”为罹患与所治疗的个体相同形式的疾病或损伤的个体。在一些实施例中，与接受治疗之前的个体或对照个体相比，本文中所描述的使用抗CD22构建体治疗B细胞恶性病的方法可使个体中的细胞细胞凋亡增加(例如使CD22+肿瘤细胞细胞凋亡增加)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施例中，与接受治疗之前的个体或对照个体相比，本文中所描述的使用抗CD22构建体治疗B细胞恶性病的方法可使个体中的肿瘤尺寸降低(例如使CD22+肿瘤尺寸降低)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
体外：如本文中所使用，指代在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而非在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文中所使用，指代在多细胞生物体(如人类及非人类动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，所述术语可用于指在活细胞(相较于例如体外系统)内发生的事件。
经分离：如本文中所使用，指代如下物质和/或实体：(1)与至少一些在最初产生时与其结合的组分分离(无论在自然界中和/或在实验环境中)，和/或(2)通过人工设计、产生、制备和/或制造。经分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其相关的其它组分分离。在一些实施例中，经分离的试剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文中所使用，如果物质大体上不含其它组分，那么所述物质为“纯”的。在一些实施例中，如所属领域的技术人员将理解，在已与某些其它组分(如一种或多种载剂或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)组合之后，物质可仍视为“经分离”或甚至“纯”的；在此类实施例中，物质的分离或纯度百分比是在不包括此类载剂或赋形剂的情况下计算。仅给出一个实例，在一些实施例中，当a)借助于其衍生起源或来源，不与在自然界中在其原生状态中伴随其的组分中的一些或全部结合；b)其大体上不含与在自然界中产生其的物种相同的物种的其它多肽或核酸；c)由来自不为在自然界中产生其的物种的细胞或其它表达系统的组分表达或另外与所述组分结合时，自然界中存在的生物聚合物(如多肽或聚核苷酸)视为“经分离”。因此，举例来说，在一些实施例中，化学合成或在与在自然界中产生其的系统不同的细胞系统中合成的多肽视为“经分离”的多肽。或者或另外，在一些实施例中，已经历一种或多种纯化技术的多肽可在其已与a)在自然界中与其结合；和/或b)在最初产生时与其结合的其它组分分离的程度上视为“经分离”的多肽。
KD：如本文中所使用，指代结合剂(例如抗体试剂或其结合组分)从其与其搭配物(例如抗体试剂或其结合组分结合的表位)的复合物解离的常量。
koff：如本文中所使用，指代用于将结合剂(例如抗体试剂或其结合组分)从其与其搭配物(例如抗体试剂或其结合组分结合的表位)的复合物解离的解离速率常量。
kon：如本文中所使用，指代用于将结合剂(例如抗体试剂或其结合组分)与其搭配物(例如与抗体试剂或其结合组分结合的表位)结合的结合速率常量。
接头：如本文中所使用，用于指多组件多肽的将不同组件彼此连接的部分。举例来说，所属领域的普通技术人员应理解，结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常包括在将其彼此连接的结构域之间的一段氨基酸。在一些实施例中，包含接头组件的多肽具有通式S1-L-S2的整体结构，其中S1及S2可相同或不同并且表示通过接头彼此结合的两个结构域。在一些实施例中，接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸。在一些实施例中，接头具有3至7个氨基酸、7至15个氨基酸或20至30个(例如20至25个或25至30个)氨基酸。在一些实施例中，接头的特征在于其趋向于不采用刚性三维结构，而实际上向多肽提供可挠性。所属领域中已知可适当地在工程改造多肽(例如融合多肽)时使用的多种不同接头组件(参见例如霍林格P.(Holliger,P.),等人,1993,美国国家科学院院刊90:6444-6448；鲍良克R.J.(Poljak,R.J.)等人,1994,结构(Structure)2:1121-1123)。
多价结合抗体(或多特异性抗体)：如本文中所使用，指代能够结合于可位于相同分子或不同分子上的两个或更多个抗原的抗体。如本文中所描述，在一些实施例中，多价结合抗体经工程改造以具有两个或更多个抗原结合位点，并且通常不为天然存在的蛋白质。如本文中所描述的多价结合抗体指代能够结合两个或更多个相关或不相关目标的结合抗体。多价结合抗体可由单一抗体部分的多个复本或不同抗体部分的多个复本构成。此类抗体能够结合于两个或更多个抗原并且可为四价或多价的。多价结合抗体可另外包含治疗剂，如免疫调节剂、毒素或RNA酶。在一些实施例中，如本文中所描述的多价结合抗体能够同时结合于至少两个具有不同结构的目标，例如两个不同抗原、同一个抗原上的两个不同表位或半抗原和/或抗原或表位。本发明的多价结合抗体可为单特异性(能够结合一个抗原)或多特异性(能够结合两个或更多个抗原)，并且可由两个重链多肽及两个轻链多肽构成。在一些实施例中，各结合位点由每个抗原结合位点，具有总共六个参与抗原结合的CDR的重链可变结构域及轻链可变结构域构成。
核酸：如本文中所使用，在其最广泛意义上，指代任何可并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸为经由磷酸二酯键并入或可并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如将由上下文了解，在一些实施例中，“核酸”指代个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”指代包含个别核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”为或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”为或包含DNA。在一些实施例中，核酸为、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸为、包含一种或多种核酸类似物或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同在于其不利用磷酸二酯主链。举例来说，在一些实施例中，核酸为、包含一种或多种“肽核酸”或由一种或多种“肽核酸”组成，所述肽核酸在所属领域中已知并且在主链中具有肽键而非磷酸二酯键，视为在本发明的范围内。或者或另外，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而非磷酸二酯键。
在一些实施例中，核酸为、包含一种或多种天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞嘧啶核苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷及脱氧胞苷)或由一种或多种天然核苷组成。在一些实施例中，核酸为、包含一种或多种核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶核苷、C-5丙炔基-胞嘧啶核苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞嘧啶核苷、C5-甲基胞嘧啶核苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞嘧啶核苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)或由一种或多种核苷类似物组成。在一些实施例中，核酸包含一种或多种经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖及己醣)，如与天然核酸中的糖相比。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物(如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施例中，核酸通过以下中的一种或多种制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制及化学合成。在一些实施例中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，核酸为单股；在一些实施例中，核酸为双股。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个组件的核苷酸序列，所述至少一个组件编码对多肽进行编码的序列或为所述序列的补体。在一些实施例中，核酸具有酶活性。
可操作地连接：如本文中所使用，指代所描述的组分处于准许其以其预期方式作用的关系中的并接。“可操作地连接”于编码序列的控制序列是以使得编码序列的表达在与控制序列兼容的条件下实现的方式连接。“可操作地连接”的序列包括与相关基因相邻的表达控制序列及以反式起作用或在一定距离起作用以控制所述相关基因的表达控制序列。如本文中所使用，术语“表达控制序列”指代实现所连接的编码序列的表达及处理所需的聚核苷酸序列。表达控制序列包括适当转录起始、终止、启动子及强化子序列；有效RNA处理信号，如剪接及聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，科扎克共同序列(Kozak consensus sequence))；增强蛋白质稳定性的序列；及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质视宿主生物体而不同。举例来说，在原核细胞中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列，而在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子及转录终止序列。术语“控制序列”意图包括其存在对表达及处理来说至关重要的组分，并且还可包括其存在有利的额外组分，例如前导序列及融合搭配物序列。
生理学条件：如本文中所使用，具有其在所属领域中理解的参考细胞或生物体生存和/或再生的条件的含义。在一些实施例中，所述术语指代可在自然界中存在的用于生物体或细胞系统的外部或内部环境条件。在一些实施例中，生理学条件为存在于人类或非人类动物的身体内的条件，尤其存在于手术部位处和/或内的条件。生理学条件通常包括例如温度范围为20-40℃、大气压为1、pH值为6-8、葡萄糖浓度为1-20mM、常压水平下的氧浓度及如在地球上遇到的重力。在一些实施例中，实验室中的条件经处理和/或维持在生理学条件下。在一些实施例中，在生物体中遇到生理学条件。
多肽：如本文中所使用，指代氨基酸的任何聚合链。在一些实施例中，氨基酸通过肽键或经修饰的肽键彼此接合。在一些具体例中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列，因为此氨基酸序列以合成方式设计和/或产生。在一些实施例中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸或其两者或由天然氨基酸、非天然氨基酸或其两者组成。在一些实施例中，多肽可仅包含天然氨基酸或仅包含非天然氨基酸或仅由天然氨基酸或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施例中，多肽可包含D-氨基酸、L-氨基酸或其两者。在一些实施例中，多肽可仅包含D-氨基酸。在一些实施例中，多肽可仅包含L-氨基酸。
在一些实施例中，多肽可包括一个或多个侧基或其它修饰，例如在多肽的N端、多肽的C端处修饰或连接于一个或多个氨基酸侧链或其任何组合。在一些实施例中，此类侧基或修饰可选自由以下组成的群组：乙酰化、酰胺化、脂质化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施例中，多肽可为环状和/或可包含环状部分。在一些实施例中，多肽不为环状和/或不包含任何环状部分。在一些实施例中，多肽为线形的。在一些实施例中，多肽可为或包含订书多肽。在一些实施例中，术语“多肽”可附加于参考多肽、活性或结构的名称；在所述情况下，其在本文中用于指共有相关活性或结构的多肽且因此可视为同一多肽类别或家族的成员。对于每一种此类类别，本说明书提供和/或所属领域的技术人员将知晓在氨基酸序列和/或功能已知的类别内的示例性多肽；在一些实施例中，此类示例性多肽为多肽类别的参考多肽。
在一些实施例中，多肽类别或家族的成员展示与所述类别的参考多肽的显著序列同源性或一致性，与其共有共同序列基元(例如特征序列组件)，和/或与其共有常见活性(在一些实施例中，在可比较的水平下或在指定范围内)；在一些实施例中，与所述类别内的所有多肽。举例来说，在一些实施例中，成员多肽与参考多肽展示至少约30至40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的总序列同源性或一致性程度，和/或包括至少一个展示极高序列一致性(通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的区域(即，在一些实施例中，可为或包含特征序列组件的保守性区域)。此类保守性区域通常涵盖至少三至四个并且通常多达20或更多个氨基酸；在一些实施例中，保守性区域涵盖至少一个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个相邻氨基酸的延伸物。在一些实施例中，适用的多肽可包含亲本多肽的片段或由亲本多肽的片段组成。在一些实施例中，适用的多肽可包含多个片段或由多个片段组成，其中每一个发现于同一亲本多肽中呈与在相关多肽中所发现不同的相对于彼此的空间排列(例如在亲本中直接连接的片段可在相关多肽中空间分离或反之亦然，和/或片段可以与在亲本中不同的顺序存在于相关多肽中)，使得相关多肽为亲本多肽的衍生物。
预防(prevent/prevention)：如本文中所使用，当与疾病、病症和/或病状的出现结合使用时，指代降低罹患所述疾病、病症和/或病状的风险和/或推迟所述疾病、病症或病状的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已推迟预定时间段时，预防可视为完成。
重组：如本文中所使用，意图指代通过重组方式设计、工程改造、制备、表达、产生或分离的多肽(例如抗体或抗体部分)，如使用转染于宿主细胞中的重组型表达载体表达的多肽、从重组型、组合型人类多肽文库分离的多肽(胡根布姆H.R.(Hoogenboom H.R.),1997,TIB技术(TIB Tech.)15:62-70；阿兹伊H.(Azzazy H.)及海史密斯W.E.(HighsmithW.E.),2002,临床生物化学(Clin.Biochem.)35:425-45；加比隆多J.V.(Gavilondo J.V.)及勒瑞克J.W.(Larrick J.W.),2002,生物技术(BioTechniques)29:128-45；胡根布姆H.及查恩斯P.(Chames P.),2000,今日免疫学(Immunol.Today)21:371-8)、从转殖人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如泰勒L.D.(Taylor,L.D.)等人,1992,核酸研究20:6287-95；凯勒曼S-A.(Kellermann S-A.)及格林L.L.(Green L.L.),2002,生物技术新见(Curr.Opin.Biotech.)13:593-7；里特M.(Little,M.)等人,2000,今日免疫学21:364-70；莫菲A.J.(Murphy,A.J.)等人,2014,美国国家科学院院刊111(14):5153-8)或通过涉及将所选序列组件彼此剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施例中，在自然界中发现此类所选序列组件中的一种或多种。在一些实施例中，此类所选序列组件中的一种或多种经计算机仿真设计。在一些实施例中，一个或多个此类所选序列组件由例如来自天然或合成来源的已知序列组件的突变诱发(例如体内或体外)产生。举例来说，在一些实施例中，重组型抗体包含在相关源生物体(例如人类、小鼠等)的生殖系中发现的序列。在一些实施例中，重组型抗体具有由突变诱发(例如体外或体内，例如在转基因动物中)产生的氨基酸序列，使得重组型抗体的VH及VL区的氨基酸序列为当来源于生殖系VH及VL序列及与其相关时，可不体内天然存在于生殖系抗体谱系内的序列。
参考物：如本文中所使用，描述标准物、对照物或如本文中所描述与其进行比较的其它适合的参考物。举例来说，在一些实施例中，参考物为标准或对照试剂、动物、个体、群体、样品、序列、一系列步骤、一组条件或值，相关试剂、动物、个体、群体、样品、序列、一系列步骤、一组条件或值与其进行比较。在一些实施例中，参考物大体上与相关测试或测定同时测试和/或测定。在一些实施例中，参考物为任选地在有形介质中实施的历史参考物。通常，如所属领域的技术人员将理解，参考物在与相关评估中利用的条件类似的条件下测定或表征。
特异性结合：如本文中所使用，指代结合剂在发生结合的环境中区分可能的搭配物的能力。当存在其它潜在目标时，与一种特定目标相互作用的结合剂称为与其相互作用的目标“特异性结合”。在一些实施例中，特异性结合通过检测或测定结合剂与其搭配物之间的结合程度来评估；在一些实施例中，特异性结合通过检测或测定结合剂-搭配物复合物的解离程度来评估；在一些实施例中，特异性结合通过检测或测定结合剂竞争其搭配物与另一实体之间的替代性相互作用的能力来评估。在一些实施例中，通过在一系列浓度下进行此类检测或测定来评估特异性结合。在一些实施例中，通过测定同源与非同源目标之间的结合亲和力差异评估特异性结合。举例来说，结合剂对同源目标的结合亲和力可为对非同源目标的结合亲和力的约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
特异性：如所属领域中已知，“特异性”为特定配体区分其结合搭配物与其它潜在结合搭配物的能力的度量。
个体：如本文中所使用，意谓任何哺乳动物，包括人类。在本发明的某些实施例中，个体为成年人、青年或婴儿。在一些实施例中，使用术语“个体(individual)”或“患者”并且意图可与“个体(subject)”互换。本发明还涵盖医药组合物的投药和/或子宫内治疗方法的性能。
大体上：如本文中所使用，术语“大体上”指代呈现总或接近总范围或程度的相关特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员应理解，生物及化学现象很少(如果曾经)进行完全和/或继续进行到完全或获得或避免绝对结果。因此，本文中使用术语“大体上”以获得许多生物及化学现象中所固有的完整性的潜在缺乏。
大体上序列同源性：如本文中所使用，词组“大体上同源性”指代氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的普通技术人员将了解，如果两个序列在对应位置含有同源残基，那么其通常视为“大体上同源”。同源残基可为一致残基。或者，同源残基可为具有适当地类似结构和/或功能特性的不一致残基。举例来说，如所属领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。用一种氨基酸取代另一相同类型可通常视为“同源”取代。典型氨基酸分类如下概述：
Figure BDA0002777825040000291
如所属领域中所熟知，氨基酸或核酸序列可使用多种算法中的任一种比较，包括可在市售计算机程序中获得的算法，如用于核苷酸序列的BLASTN，及用于氨基酸序列的BLASTP、间隙式BLAST及PSI-BLAST。示例性此类程序描述于阿特舒尔(Altschul)等人,1990,分子生物学期刊,215(3):403-410；阿特舒尔等人,1996,酶学方法(Meth.Enzymology)266:460-480；阿特舒尔等人,1997,核酸研究25:3389-3402；巴森文尼斯(Baxevanis)等人,生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南(Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins),威利(Wiley),1998；及米塞纳(Misener)等人(编),生物信息学方法和方案(分子生物学方法,第132卷)(Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132)),胡马纳出版社(Humana Press),1999中。除鉴别同源序列以外，上文所提及的程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的对应残基中的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多在相关残基延伸物上同源，那么其视为大体上同源。在一些实施例中，相关延伸物为完整序列。在一些实施例中，相关延伸物为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或更多个残基。
表面等离激元共振：如本文中所使用，指代允许例如经由在生物传感器矩阵内检测蛋白质浓度的变化(如通过使用BIAcore系统(瑞典乌普萨拉(Uppsala,Sweden)及新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,N.J.)的药物生物传感器公司(Pharmacia Biosensor AB))实时地分析特异性结合相互作用的光学现象。关于进一步描述，参见琼森U.(Jonsson,U.)等人,1993,临床生物学年鉴(Ann.Biol.Clin.)51:19-26；琼森U.等人,1991,生物技术11:620-627；强森B.(Johnsson,B.)等人,1995,分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)8:125-131；及强森B.等人,1991,分析生物化学(Anal.Biochem.)198:268-277。
治疗剂：如本文中所使用，通常指代在向生物体投与时引发所需药理学作用的任何药剂。在一些实施例中，如果药剂在适合的群体中展现统计显著效果，那么其视为治疗剂。在一些实施例中，适合的群体可为模型生物体的群体。在一些实施例中，适合的群体可由各种准则定义，如某一年龄群体、性别、遗传背景、先前存在的临床病状等。在一些实施例中，治疗剂为可用于缓解、改善、减轻、抑制、预防疾病、病症和/或病状、延迟其发作、降低其严重程度和/或减小其一种或多种症状或特征的发生率的物质。在一些实施例中，“治疗剂”为在可出售以向人类投与之前已经或需要由政府机构批准的药剂。在一些实施例中，“治疗剂”为医学处方所需要以用于向人类投与的药剂。
治疗有效量：如本文中所使用，意谓产生所需投药作用的量。在一些实施例中，所述术语指代当根据治疗性给药方案向罹患或易患疾病、病症和/或病状的群体投与时足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在一些实施例中，治疗有效量为降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发生率和/或严重程度，和/或延迟其发作的量。所属领域的普通技术人员将了解，术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功治疗。实情为，治疗有效量可为当向需要此类治疗的患者投与时，在相当大数目的个体中提供特定所需药理学响应的量。在一些实施例中，提及治疗有效量可为提及如在一种或多种特定组织(例如受疾病、病症或病状影响的组织)或体液(例如血液、唾液、血清、汗液、泪液、尿液等)中测量的量。所属领域的普通技术人员应了解，在一些实施例中，治疗有效量的特定药剂或疗法可在单次给药中调配和/或投与。在一些实施例中，治疗有效的药剂可以多次给药，例如作为给药方案的一部分调配和/或投与。
治疗：如本文中所使用，术语“治疗(treatment)”(也呈“治疗(treat/treating)”)在其最广泛意义上指代部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或病因、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的物质(例如所提供的组合物)的任何投药。在一些实施例中，此类治疗可向未呈现相关疾病、病症和/或病状的病征的个体和/或仅呈现疾病、病症和/或病状的早期病征的个体投与。或者或另外，在一些实施例中，可向呈现相关疾病、病症和/或病状的一种或多种已确定的病征的个体投与治疗。在一些实施例中，治疗可为对已诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的个体进行的治疗。在一些实施例中，治疗可为对已知具有一种或多种在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展风险增加相关的敏感性因素的个体进行的治疗。
变异体：如本文中所使用，术语“变异体”指代展示与参考实体的显著结构一致性，但与参考实体结构上的不同的处在于与参考实体相比，一个或多个化学部分的存在或水平的实体。在许多实施例中，变异体还在功能上与其参考实体不同。一般来说，特定实体是否恰当地视为参考实体的“变异体”是基于其与参考实体的结构一致性的程度。如所属领域的技术人员将了解，任何生物或化学参考实体皆具有某些特征结构组件。根据定义，变异体为共有一种或多种此类特征结构组件的不同化学实体。仅给出一些实例，多肽可具有包含多个在线性或三维空间中具有相对于彼此的指定位置和/或促进特定生物功能的氨基酸的特征序列组件，核酸可具有包含多个在线性或三维空间中具有相对于彼此的指定位置的核苷酸残基的特征序列组件。举例来说，变异型多肽可因氨基酸序列中的一种或多种差异和/或共价连接于多肽主链的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)中的一种或多种差异而与参考多肽不同。在一些实施例中，变异型多肽与参考多肽展示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总序列一致性。或者或另外，在一些实施例中，变异型多肽不与参考多肽共有至少一个特征序列组件。
在一些实施例中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，变异型多肽共有参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，变异型多肽不具有参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，变异型多肽与参考多肽相比展示一种或多种生物活性的水平降低。在许多实施例中，如果相关多肽具有与亲本的氨基酸序列一致，但在特定位置具有少量序列变化的氨基酸序列，那么将所述相关多肽视为亲本或参考多肽的“变异体”。通常，与亲本相比，变异体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基经取代。在一些实施例中，与亲本相比，变异体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个经取代的残基。变异体通常具有极少数目(例如少于5、4、3、2或1个)的经取代的功能性残基((即，参与特定生物活动的残基)。此外，与亲本相比，变异体通常具有不超过5、4、3、2或1个插入或缺失，并且通常不具有插入或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个，并且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲本或参考多肽多肽为在自然界中发现的多肽。如所属领域的普通技术人员将理解，特定相关多肽的多种变异体可通常在自然界中发现，尤其当相关多肽为感染剂多肽时。
载体：如本文中所使用，指代能够输送已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种载体为“质粒”，其指代可与额外DNA区段连接的环形双股DNA环。另一种载体为病毒载体，其中额外DNA区段可与病毒基因组连接。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合于宿主细胞的基因组中，并且借此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
野生型：如本文中所使用，术语“野生型”具有其在所属领域中所理解的含义，指代具有如自然界中在“正常”(相对于突变、变异、患病、更改等来说)状态或情况下所发现的结构和/或活性的实体。所属领域的普通技术人员将了解，野生型基因及多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
附图说明
图1A-1E展示仅结合于全长CD22的市售小鼠抗人类CD22抗体(Biolegend，目录号363505)的代表性MFI。全长CD22表达于杰卡特细胞(图1B)及拉吉(Raji)细胞(图1D)中。
图2A及2B展示在流式细胞测量术分析法中，表达全长CD22(杰卡特-CD22-全长)或CD22的结构域5-7(杰卡特-CD22(D5-D7)-GFP)的人类CD22+拉吉细胞(拉吉)及杰卡特细胞的噬菌体克隆1及2结合的代表性MFI。使用CD22-杰卡特细胞作为阴性对照。
图3A及3B展示在流式细胞测量术分析法中，天然表达CD22的NALM-6细胞的噬菌体克隆1及2结合的代表性MFI。
图4A-4C说明抗CD22 CAR(克隆2)显示针对CD22+靶细胞的特异性及强效杀灭活性，如通过IFN-γ释放分析法所测量。
图5A及5B说明抗CD22 CAR(克隆2)显示针对K562+CD22靶细胞的特异性杀灭并且不杀灭K562细胞。
图6展示m971不与抗CD22 CAR(克隆2)竞争，如通过流式细胞测量术所测量。
图7展示表达构建体2及4以及构建体组合1、3、5及6中的任一种的caTCR T细胞在NALM6细胞及拉吉细胞中皆具有高杀灭功效。
图8展示表达构建体2及4以及构建体组合1、3、5及6中的任一种的caTCR T细胞具有来自NALM6及拉吉细胞的高IFN-γ释放量。
图9A及9B展示表达构建体2及4以及构建体组合3、5及6中的任一种的抗CD22-caTCR T细胞在NALM6细胞中，在长达至少三周内并且在三轮或更多轮目标接合之后保持高杀灭功效。图9A展示靶细胞数目并且图9B展示总细胞数目。
图10A及10B展示表达构建体2及4以及构建体组合1、3、5及6中的任一种的抗CD22-caTCR T细胞在拉吉细胞中，在长达约五周内并且在总共五轮目标接合之后具有显著杀灭功效。
图11展示表达构建体2、15-21及22中的任一种的caTCR T细胞在NALM6细胞、拉吉细胞及K562细胞中具有高杀灭功效。
图12A-12F展示表达构建体2、22、24-27及28中的任一种的caTCR T细胞在NALM6细胞、拉吉细胞及K562细胞中具有高杀灭功效。
图13A及13B展示表达构建体组合1及23中的任一种的抗CD22-caTCR T细胞在NALM6细胞中保持高杀灭功效。
具体实施方式
本发明涉及研究具有特异性结合于CD22的胞外区域的能力的抗CD22构建体。本发明还提供此类构建体的用途，其用于治疗B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)。
I.CD22
分化丛集22或CD22为仅在B细胞分化的成熟阶段期间表达的135-kDa唾液酸结合细胞表面受体(多肯(Dorken.),免疫学杂志136:4470,1986)。人类中的CD22的主要形式为CD22β，其含有七个结构域(威尔逊等人,实验医学期刊173:137,1991)。变异形式CD22α不具有结构域3及4(斯塔门科维奇及希德,自然345:74,1990)。已证实与人类CD22的配体结合与结构域1及2(也称为表位1及2)相关联(恩格尔(Engel)等人,实验医学期刊181:1581,1995)。全长人类CD22的氨基酸序列展示于以下SEQ ID NO:204中。SEQ ID NO:205还展示含有与抗CD22克隆1及克隆2结合的CD22的结构域5-7的胞外区域(参见实例1)。抗CD22克隆1包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1-3，及分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1-3。抗CD22克隆2包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1-3，及分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1-3。
SEQ ID NO:204(全长人类CD22；带下划线：如实例1中所描述的噬菌体呈现中使用的CD22的部分；粗体并且带下划线：CD22的跨膜结构域)：
Figure BDA0002777825040000341
SEQ ID NO:205(含有CD22的结构域5-7的胞外区域；对应于SEQ ID NO:204的氨基酸414-687)：
Figure BDA0002777825040000342
CD22与多种癌症有关，例如B细胞相关癌症。B细胞相关癌症包括(但不限于)恶性淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、多发性骨髓瘤及慢性淋巴细胞性白血病(CLL，B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞))。在通过限制稀释研究进行的人类急性成淋巴细胞性白血病(ALL)鼠类异种移植物中概述CD22表达，其提高可在白血病起始细胞上表达CD22的可能性(莫里佐(Morisot)等人，白血病(Leukemia)24:1859,2010)。此外，发现在45名患者(包括39名用抗CD22定向疗法治疗的患者)的连续研究中维持CD22表达，表明CD22-B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)的发展为不常见的(莫里佐等人,白血病24:1859,2010)。测试在BCP-ALL中标靶CD22的适合性(哈索(Haso)等人,血液(Blood)121:1165,2013)。分析来自111名BCP-ALL患者的成淋巴细胞的CD22表达并且发现皆为CD22阳性，其中中值CD22表达量为3500个位点/细胞。
此外，CD22在超过90％的非霍奇金氏淋巴瘤群体中大量表达(切萨诺(Cesano)等人,血液100:350a,2002)。NHL，主要由B淋巴细胞引起的异质癌症组，占所有新近诊断的癌症的约4％(杰马尔(Jemal)等人,CA：临床医师癌症杂志(CA Cancer J Clin),52:23,2002)。侵袭性NHL占成年人NHL的约30-40％(哈里斯(Harris)等人,血液学杂志(HematolJ.)1:53,2001)并且包括弥漫性大型B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤及多形性大细胞淋巴瘤。一线组合化学疗法仅可治疗不到一半的侵袭性NHL患者，并且大部分患者最终死于其疾病(费雪(Fisher),肿瘤学(Oncol.)27(增刊12):2,2000)。还存在证据表明CD22表达可通过阻止细胞凋亡而使B细胞变成致瘤性(奥提波比(Otipoby)等人,自然(伦敦)384:634,1996)。CD22可充当B细胞活化复合物的组分(萨托(Sato)等人,免疫学研讨文辑(Semin.Immunol.)10:287,1998)及粘着分子(恩格尔等人,免疫学杂志150:4719,1993)。在与其天然配体结合之后，CD22快速内化，提供原代B细胞中的共刺激信号及赘生性B细胞中的促凋亡信号(萨托等人,免疫力(Immunity)5:551,1996)。
II.抗CD22构建体及构建体组合
在一个方面，本发明提供抗分化丛集22(CD22)构建体，其包含特异性结合于CD22(即，结合于SEQ ID NO:205的序列或其一部分)的抗体部分。在一些实施例中，抗CD22构建体为经分离的抗CD22构建体。抗CD22构建体的特异性来源于特异性结合于CD22(即，结合于SEQ ID NO:205的序列或其一部分)的抗CD22抗体部分，如全长抗体或其抗原结合片段。预期抗CD22构建体包括例如全长抗CD22抗体、多特异性(如双特异性)抗CD22抗体、抗CD22嵌合抗原受体(CAR)、抗CD22嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)、抗CD22嵌合共刺激受体(CSR)及抗CD22免疫结合物。本文中所描述的抗CD22构建体可包含抗体部分，其为全长抗CD22抗体或多特异性(如双特异性)抗CD22抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为抗体部分，其为全长抗CD22抗体或多特异性(如双特异性)抗CD22抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为抗CD22嵌合抗原受体(CAR)或抗CD22免疫结合物。
在一些实施例中，抗CD22构建体可为多特异性(例如双特异性)。多特异性抗CD22构建体具有针对超过一个目标的抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体具有一个针对CD22的抗体部分及一个或多个针对一种或多种非CD22抗原(例如CD19、CD20，一种表达于B细胞恶性病中的非CD22抗原)的其它抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体可为双特异性、三特异性、四特异性或五特异性。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体可为caTCR、CSR、CAR、全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体、串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再标靶(DART)抗体、双重可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、锁钥结构(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。
本发明提供抗CD22构建体及使用此类抗体治疗CD22相关疾病的方法。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体识别及结合于SEQ ID NO:205的序列内的表位。抗CD22构建体可结合于包含至少7个SEQ ID NO:205的序列内的氨基酸(例如至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个氨基酸)的表位。在一些实施例中，抗CD22构建体可结合于包含至少7个SEQ ID NO:2的序列内的相邻氨基酸(例如至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个氨基酸)的表位。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体结合于SEQ ID NO:205的序列。本文中所描述的抗CD22构建体可包含抗体部分，其为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为scFv抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可包含抗体部分，其为选自由以下组成的群组的抗体类(即，同型)的成员：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或其片段。
抗CD22构建体可包含特异性结合于CD22的抗体部分，其中抗体部分包含一个或多个如本文中所描述的CDR、重链可变区和/或轻链可变区。在一个实施例中，特异性结合于CD22(即，结合于SEQ ID NO:205的序列或其一部分)的抗CD22构建体包含抗体部分，其中抗体部分包含：(1)轻链可变区，其包含轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2及LC-CDR3，及(2)重链可变区，其包含重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2及HC-CDR3，并且其中抗体部分包含以下中的一个或多个：具有序列SSNIGNNY(SEQ ID NO:206)的LC-CDR1、具有序列ENN(SEQID NO:207)的LC-CDR2、具有序列GTWDSSLSAGAV(SEQ ID NO:208)的LC-CDR3、具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)的HC-CDR1、具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)的HC-CDR2及具有序列ARPYYDD(SEQ ID NO:211)的HC-CDR3。在一些实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:206-211的序列。
在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体中的抗体部分可包含轻链可变区，其具有与序列QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAGAVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:212)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，其中所述抗体部分包含具有SEQ ID NO:206的序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:207的序列的LC-CDR2及具有SEQID NO:208的序列的LC-CDR3。在一些实施例中，轻链可变区(例如SEQ ID NO:212)可进一步经人类化。举例来说，轻链可变区可包含非人类CDR及框架区和/或恒定区，其经人类化或来源于人类抗体序列。在特定实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO:212的序列。在一些实施例中，具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3的抗CD22构建体的轻链为λ同型的轻链。
在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体中的抗体部分可包含重链可变区，其具有与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYYDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:213)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，其中所述抗体部分包含具有SEQ ID NO:209的序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:210的序列的HC-CDR2及具有SEQID NO:211的序列的HC-CDR3。在一些实施例中，重链可变区(例如SEQ ID NO:213)可进一步经人类化。举例来说，重链可变区可包含非人类CDR及框架区和/或恒定区，其经人类化或来源于人类抗体序列。在特定实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO:213的序列。
在另一实施例中，特异性结合于CD22(即，结合于SEQ ID NO:205的序列或其一部分)的抗CD22构建体包含抗体部分，其中抗体部分包含：(1)轻链可变区，其包含轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2及LC-CDR3，及(2)重链可变区，其包含重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2及HC-CDR3，并且其中抗体部分包含以下中的一个或多个：具有序列HDIRNY(SEQ IDNO:214)的LC-CDR1、具有序列AAS(SEQ ID NO:215)的LC-CDR2、具有序列QQYDGLPLT(SEQ IDNO:216)的LC-CDR3、具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)的HC-CDR1、具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)的HC-CDR2及具有序列ARYGSAAWMDS(SEQ ID NO:217)的HC-CDR3。在一些实施例中，抗体部分包含SEQ ID NO:209、210、214-217的序列。
在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体中的抗体部分可包含轻链可变区，其具有与序列DIQLTQSPSSLSTSVGDRVTITCQASHDIRNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQTGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQYDGLPLTFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO:218)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，其中所述抗体部分包含具有SEQ ID NO:214的序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:215的序列的LC-CDR2及具有SEQ ID NO:216的序列的LC-CDR3。在一些实施例中，轻链可变区(例如SEQ ID NO:218)可进一步经人类化。举例来说，轻链可变区可包含非人类CDR及框架区和/或恒定区，其经人类化或来源于人类抗体序列。在特定实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO:218的序列。在一些实施例中，具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3的抗CD22构建体的轻链为λ同型的轻链。
在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体中的抗体部分可包含重链可变区，其具有与序列QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGSAAWMDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:219)具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列，其中所述抗体部分包含具有SEQ ID NO:209的序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:210的序列的HC-CDR2及具有SEQ ID NO:217的序列的HC-CDR3。在一些实施例中，重链可变区(例如SEQ ID NO:219)可进一步经人类化。举例来说，重链可变区可包含非人类CDR及框架区和/或恒定区，其经人类化或来源于人类抗体序列。在特定实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO:219的序列。
本发明还包括抗CD22构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分与具有分别具有SEQID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3以及分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3的抗体部分在结合方面进行竞争。本发明还包括抗CD22构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分与包含具有SEQ ID NO:212的序列的轻链可变区及具有SEQ ID NO:213的序列的重链可变区的抗体部分在结合方面进行竞争。熟练技术人员具有用于鉴别此类竞争性抗体部分的一般知识、技能及方法。
本发明还包括抗CD22构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分与具有分别具有SEQID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3以及分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3的抗体部分在结合方面进行竞争。本发明还包括抗CD22构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分与包含具有SEQ ID NO:218的序列的轻链可变区及具有SEQ ID NO:219的序列的重链可变区的抗体部分在结合方面进行竞争。熟练技术人员具有用于鉴别此类竞争性抗体部分的一般知识、技能及方法。
单链可变片段(scFv)抗体
本文中所描述的抗CD22构建体可包含抗体部分，其为单链Fv(scFv)抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为scFv抗体。scFv抗体可包含轻链可变区及重链可变区，其中轻链可变区及重链可变区可使用重组方法通过合成接头接合，以产生单一多肽链。在一些实施例中，scFv可具有结构“(N端)轻链可变区-接头-重链可变区(C端)”，其中重链可变区借助于接头接合于轻链可变区的C端。在其它实施例中，scFv可具有结构“(N端)重链可变区-接头-轻链可变区(C端)”，其中轻链可变区借助于接头接合于重链可变区的C端。接头可为包括2至200个(例如2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个)氨基酸的多肽。适合的接头可含有可挠性氨基酸残基，如甘氨酸及丝氨酸。在某些实施例中，接头可含有GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:220)、GGSG(SEQ ID NO:221)或SGGG(SEQ ID NO:222)的基元，例如多重或重复基元。在一些实施例中，接头可具有序列GSGS(SEQ ID NO:223)、GSGSGS(SEQ IDNO:224)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:225)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:226)、GGSGGS(SEQ ID NO:227)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:228)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:229)、GGSG(SEQ ID NO:230)、GGSGGGSG(SEQ ID NO:231)或GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:232)。在其它实施例中，接头还可含有除甘氨酸及丝氨酸以外的氨基酸，例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233)。
纯化标签
在一些实施例中，纯化标签可接合于本文中所描述的抗CD22构建体(例如抗CD22scFv)。纯化标签指代可用于多肽的纯化、分离或鉴别的具有任何长度的肽。纯化标签可接合于多肽(例如接合于多肽的N或C端)以帮助纯化多肽和/或从例如细胞溶解物混合物分离多肽。在一些实施例中，纯化标签结合于对纯化标签具有特异性亲和力的另一部分。在一些实施例中，此类特异性结合于纯化标签的部分连接于固体负载物，如基质、树脂或琼脂糖珠粒。可接合于抗CD22构建体(例如抗CD22 scFv)的纯化标签的实例包括(但不限于)六组氨酸肽、血球凝集素(HA)肽、FLAG肽及myc肽。在一些实施例中，两个或更多个纯化标签可接合于构建体，例如六组氨酸肽及HA肽。六组氨酸肽(HHHHHH(SEQ ID NO:234))以微摩尔亲和力结合于镍功能化琼脂糖亲和管柱。在一些实施例中，HA肽包括序列YPYDVPDYA(SEQ IDNO:235)或YPYDVPDYAS(SEQ ID NO:236)。在一些实施例中，HA肽包括呈串联形式的整数倍个序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:235)或YPYDVPDYAS(SEQ ID NO:236)，例如3xYPYDVPDYA或3xYPYDVPDYAS。在一些实施例中，FLAG肽包括序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:237)。在一些实施例中，FLAG肽包括呈串联形式的整数倍个序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:237)，例如3xDYKDDDDK。在一些实施例中，myc肽包括序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:238)。在一些实施例中，myc肽包括呈串联形式的整数倍个序列EQKLISEEDL，例如3xEQKLISEEDL。
抗CD22 scFv抗体
在一些实施例中，具有分别具有SEQ ID NO:206-211的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3的抗CD22构建体可为scFv抗体。在一些实施例中，与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的重链可变区可借助于接头接合于与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的轻链可变区的N或C端。在特定实施例中，抗CD22 scFv抗体具有下文展示的SEQ ID NO:239的序列。
SEQ ID NO:239(抗CD22 scFv抗体；纯文本(无粗体或下划线)：轻链可变区及重链可变区；粗体：接头；及带下划线：纯化标签(六组氨酸标签及HA标签)
Figure BDA0002777825040000401
在一些实施例中，具有分别具有SEQ ID NO:214-216、209、210及217的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3的抗CD22构建体可为scFv抗体。在一些实施例中，与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的重链可变区可借助于接头接合于与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的轻链可变区的N或C端。在特定实施例中，抗CD22 scFv抗体具有下文展示的SEQ ID NO:240的序列。
SEQ ID NO:240(抗CD22 scFv抗体；纯文本(无粗体或下划线)：轻链可变区及重链可变区；粗体：接头；及带下划线：纯化标签(六组氨酸标签及HA标签)
Figure BDA0002777825040000402
多特异性抗体
本文中所描述的抗CD22构建体可包含抗体部分，其为多特异性抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可为多特异性抗体。多特异性抗体可包含抗CD22结合部分及第二结合部分(如第二抗原结合部分)。多特异性抗体为对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性的抗体(例如双特异性抗体对两种抗原或表位具有结合特异性)。还涵盖具有超过两种特异性的多特异性抗体。举例来说，可制备三特异性抗体(参见例如塔特(Tutt)等人免疫学杂志147:60(1991))。应了解，所属领域的技术人员可选择本文中所描述的个别多特异性抗体的适合的特征以彼此组合，以形成本发明的多特异性抗体。
因此，举例来说，在一些实施例中，提供一种多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体，其包含a)抗CD22结合部分，其特异性结合于CD22的胞外区域(即，结合于SEQ ID NO:205的序列或其一部分)，及b)第二结合部分(如抗原结合部分)。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于不同抗原。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于细胞(如细胞毒性细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于淋巴细胞(如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核球、巨噬细胞或树突状细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于效应T细胞，如细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或T杀伤细胞)。
在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于肿瘤抗原。肿瘤抗原的实例包括(但不限于)α胎蛋白(AFP)、CA15-3、CA27-29、CA19-9、CA-125、钙视网膜蛋白、癌胚抗原、CD34、CD99、CD117、染色颗粒素、细胞角蛋白、结蛋白、上皮膜蛋白质(EMA)、因子VIII、CD31 FL1、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素、角蛋白、CD45、淋巴细胞标记物、MART-1(Melan-A)、Myo Dl、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、前列腺特异性抗原、S100蛋白质、平滑肌肌动蛋白(SMA)、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、肿瘤M2-PK及波形蛋白。
在一些实施例中，双特异性抗体中的第二抗原结合部分结合于CD3。在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于CD3ε。在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于CD3ε的促效表位。如本文中所使用，术语“促效表位”意谓(a)在结合多特异性抗体时，任选地在结合同一个细胞上的若干个多特异性抗体时，使所述多特异性抗体活化T细胞受体(TCR)信号传导及诱导T细胞活化的表位，和/或(b)仅由CD3的ε链的氨基酸残基构成并且当在T细胞上，在其天然情形中呈现时(即，由TCR、CD3γ链等包围)，可用于多特异性抗体的结合的表位，和/或(c)在结合多特异性抗体时，不引起CD3ε相对于CD3γ的空间位置的稳定化的表位。
在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于效应细胞(包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM)表面上的抗原。在其它实施例中，第二抗原结合部分结合于补体系统的组分，如C1q。C1q为活化血清补体系统的C1酶复合物的子单元。在其它实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于Fc受体。在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于Fcγ受体(FcγR)。FcγR可为存在于自然杀伤(NK)细胞表面上的FcγRIII或存在于巨噬细胞、单核球、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞表面上的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBI、FcγRIIB2及FcγRIIIB中的一种。在一些实施例中，第二抗原结合部分为Fc区或其功能片段。如此情形中所使用的“功能性片段”指代抗体Fc区的片段，其仍能够以足够的特异性及亲和力结合于FcR，确切地说，FcγR，以允许携有FcγR的效应细胞(确切地说，巨噬细胞、单核球、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞)通过细胞毒性溶解或吞噬作用杀死靶细胞。功能性Fc片段能够竞争性抑制初始、全长Fc部分与如活化FcγRI的FcR的结合。在一些实施例中，功能性Fc片段保持其对活化FcγR的亲和力的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，Fc区或其功能片段为增强型Fc区或其功能片段。如本文中所使用，术语“增强型Fc区”指代一种Fc区，其经修饰以增强Fc受体介导的效应功能，确切地说，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体介导的吞噬作用。此可如所属领域中已知地实现，例如通过以引起对活化受体(例如表达于自然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIA(CD16A))的亲和力增加和/或与抑制性受体(例如FcγRIIB1/B2(CD32B))的结合减少的方式改变Fc区。
在一些实施例中，多特异性抗CD22抗体实现杀灭呈现CD22的靶细胞和/或可有效再引导CTL以溶解呈现CD22的靶细胞。在一些实施例中，本发明的多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体展示在10至500ng/ml范围内的体外EC50，并且能够在约1:1至约50:1(如约1:1至约15:1，或约2:1至约10:1)的CTL与靶细胞的比率下经由CTL诱导约50％的靶细胞的再引导溶解。
在一些实施例中，多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体能够交联经刺激或未经刺激的CTL及靶细胞，以此方式使靶细胞溶解。此提供以下优点：多特异性抗CD22抗体无需产生目标特异性T细胞克隆或树突状细胞的常见抗原呈现即可发挥其所需活性。在一些实施例中，本发明的多特异性抗CD22抗体能够再引导CTL以在不存在其它活化信号的情况下溶解靶细胞。在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于CD3(例如特异性结合于CD3ε)，并且无需经由CD28和/或IL-2进行的信号传导即可再引导CTL以溶解靶细胞。
用于测量多特异性抗CD22抗体同时结合于两种抗原(例如两种不同细胞上的抗原)的偏好性的方法属于所属领域的技术人员的正常能力范围内。举例来说，当第二结合部分特异性结合于CD3时，可使多特异性抗CD22抗体与CD3+/CD22-细胞及CD3-/CD22+细胞接触。接着可通过如所属领域中已知的显微法或荧光活化细胞分选(FACS)评估多特异性抗CD22抗体阳性单细胞的数目及由多特异性抗CD22抗体交联的细胞的数目。
多特异性抗CD22抗体可包含a)抗CD22结合部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及b)第二抗原结合部分。在另一实施例中，多特异性抗CD22抗体可包含a)抗CD22结合部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及b)第二抗原结合部分。
在一些实施例中，多特异性抗CD22抗体为例如双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线形二聚scDb(LD-scDb)、圆形二聚scDb(CD-scDb)、双重双功能抗体、串联scFv、串联双scFv(例如双特异性T细胞接合子)、串联三scFv、三功能抗体、双特异性Fab2、双微型抗体、四功能抗体、scFv-Fc-scFv融合物、双亲和力再标靶(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、IgG-scFab、scFab-ds-scFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合物、锁钥结构(DNL)抗体、杵臼结构(KiH)抗体(通过KiH技术制备的双特异性IgG)、DuoBody(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)、杂多聚抗体或异结合抗体。在一些实施例中，多特异性抗CD22抗体为串联scFv(例如串联二-scFv，如双特异性T细胞接合子)。
串联scFv
在一些实施例中，多特异性抗CD22抗体为串联scFv，其包含有包含抗CD22结合部分的第一scFv及第二scFv(在本文中也称为“串联scFv多特异性抗CD22抗体”)。在一些实施例中，串联scFv多特异性抗CD22抗体进一步包含至少一个(如至少约2、3、4、5个或更多个中的任一个)其它scFv。
在一些实施例中，提供一种串联scFv多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体，其包含a)第一scFv，其特异性结合于CD22的胞外区域，及b)第二scFv。在一些实施例中，第一scFv包含轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头(例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233))彼此接合。在一些实施例中，第一scFv包含经由接头(例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233))彼此接合的SEQ ID NO:212的轻链可变区序列及SEQ ID NO:213的重链可变区序列。第一scFv可结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)。
在一些实施例中，提供一种串联scFv多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体，其包含a)第一scFv，其特异性结合于CD22的胞外区域，及b)第二scFv。在一些实施例中，第一scFv包含轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头(例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233))彼此接合。在一些实施例中，第一scFv包含经由接头(例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:233))彼此接合的SEQ ID NO:218的轻链可变区序列及SEQ ID NO:219的重链可变区序列。第一scFv可结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)。
在一些实施例中，第二scFv特异性结合于另一抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于癌细胞(如CD22呈现细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于不表达CD22的细胞表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于细胞毒性细胞表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于淋巴细胞(如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核球、巨噬细胞或树突状细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于效应T细胞(如细胞毒性T细胞)表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于效应细胞(包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM)表面上的抗原。
在一些实施例中，第一scFv为人类、人类化或半合成的。在一些实施例中，第二scFv为人类、人类化或半合成的。在一些实施例中，第一scFv及第二scFv皆为人类、人类化或半合成的。在一些实施例中，串联scFv多特异性抗CD22抗体进一步包含至少一个(如至少约2、3、4、5个或更多个中的任一个)其它scFv。
在一些实施例中，提供一种串联scFv多特异性(例如双特异性)抗CD22抗体，其包含a)第一scFv，其特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)，及b)第二scFv，其中串联scFv多特异性抗CD22抗体为串联二-scFv或串联三-scFv。在一些实施例中，串联scFv多特异性抗CD22抗体为串联二-scFv。在一些实施例中，串联scFv多特异性抗CD22抗体为双特异性T细胞接合子。
在一些实施例中，串联二-scFv双特异性抗CD22抗体以约0.1pM至约500nM之间的Kd(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)。在一些实施例中，串联二-scFv双特异性抗CD22抗体以约1nM至约500nM之间的Kd(如约1、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500nM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)。
所属领域中已知多种用于设计、构建和/或制备多特异性抗体的技术。可利用完全免疫球蛋白框架(例如IgG)、单链可变片段(scFv)或其组合构建多特异性抗体。如上文所描述，双特异性抗体可由两个串联scFv单元构成。在抗肿瘤免疫疗法的情况下，包含两个串联单链可变片段(scFv)的双特异性抗体可经设计使得结合肿瘤抗原的scFv与接合T细胞的scFv连接，即通过结合T细胞上的CD3。因此，使T细胞募集于肿瘤位点以介导肿瘤细胞的杀灭。双特异性抗体可例如通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链而制得。在一些实施例中，通过分子功能，双特异性结合剂在其两个结合臂中的一个(一对VH/VL)上结合一个抗原(或表位)，并且在其第二臂(一对不同的VH/VL)上结合不同抗原(或表位)。根据此定义，双特异性结合剂具有两个相异的抗原结合臂(在特异性及CDR序列两者中)并且对其所结合的各抗原呈单价。在某些实施例中，本发明的双特异性结合剂包含第一及第二scFv。在某些实施例中，第一scFv连接于第二scFv的C端。在某些实施例中，第二scFv连接于第一scFv的C端。在某些实施例中，scFvs经由接头(例如SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ IDNO:233))彼此连接。在某些实施例中，scFv在无接头的情况下彼此连接。
嵌合抗原受体(CAR)构建体
在一些实施例中，抗CD22构建体可为抗CD22 CAR。在一些实施例中，抗CD22 CAR包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，及b)胞内信号传导结构域。跨膜结构域可存在于胞外结构域与胞内结构域之间。
在抗CD22 CAR的胞外结构域与跨膜结构域之间或在抗CD22 CAR的胞内结构域与跨膜结构域之间，可存在间隔结构域。间隔结构域可为用于将多肽链中的跨膜结构域连接于胞外结构域或胞内结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包含至多约300个氨基酸，包括例如约10至约100个，或约25至约50个氨基酸。
跨膜结构域可来源于天然或合成来源。在来源为天然时，结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有特定用途的跨膜区可来源于T细胞受体、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的α、β、δ、γ或ζ链(即至少包含其跨膜区)。在一些实施例中，跨膜结构域可为合成的，在此情况下，其可主要包含疏水性残基，如亮氨酸及缬氨酸。在一些实施例中，在合成跨膜结构域的各端可发现苯丙氨酸、色氨酸及缬氨酸的三联体。在一些实施例中，具有例如长度在约2与约10个(如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个中的任一个)氨基酸之间的长度的短寡肽或多肽接头可在抗CD22 CAR的跨膜结构域与胞内信号传导结构域之间形成键。在一些实施例中，接头为甘氨酸-丝氨酸二联体。
在一些实施例中，使用天然地与抗CD22 CAR的胞内结构域中的序列中之一相关的跨膜结构域(例如如果抗CD22 CAR胞内结构域包含CD28共刺激序列，那么抗CD22CAR的跨膜结构域来源于CD28跨膜结构域)。在一些实施例中，可选择跨膜结构域或通过氨基酸取代来修饰跨膜结构域，以避免此类结构域结合于相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，从而使得与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
抗CD22 CAR的胞内信号传导结构域引起免疫细胞(其中已置入抗CD22 CAR)的正常效应功能中的至少一种的激活。T细胞的效应功能例如可为细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞介素。因此，术语“胞内信号传导结构域”指代转导效应功能信号并且引导细胞执行特定功能的蛋白质部分。尽管通常可使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，无需使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，此类截短部分可用于替代完整链，只要其转导效应功能信号即可。因此，术语“胞内信号传导序列”意指包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的截短部分。
用于本发明的抗CD22 CAR中的胞内信号传导结构域的实例包括共同起在抗原受体接合之后起始信号转导作用的T细胞受体(TCR)及共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变异体及具有相同功能能力的任何合成序列。
已知经由单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可称为由两种不同类别的胞内信号传导序列介导：经由TCR起始抗原依赖性初始活化的序列(初始信号传导序列)，及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(共刺激信号传导序列)。
初始信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初始活化。以刺激方式起作用的初始信号传导序列可含有信号传导基元，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元或ITAM。在一些实施例中，抗CD22 CAR构建体包含一个或多个ITAM。
在本发明中具有特定用途的含有ITAM的初始信号传导序列的实例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的序列。
在一些实施例中，抗CD22 CAR包含来源于CD3ζ的初始信号传导序列。举例来说，CAR的胞内信号传导结构域可包含CD3ζ胞内信号传导序列本身或与在本发明的抗CD22 CAR的情形下适用的任何其它所需胞内信号传导序列的组合。举例来说，抗CD22 CAR的胞内结构域可包含CD3ζ胞内信号传导序列及共刺激信号传导序列。共刺激信号传导序列可为共刺激分子(包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等)的胞内结构域的一部分。
在一些实施例中，抗CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导序列及CD28的胞内信号传导序列。在一些实施例中，抗CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导序列及4-1BB的胞内信号传导序列。在一些实施例中，抗CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导序列以及CD28及4-1BB的胞内信号传导序列。
因此，举例来说，在一些实施例中，提供一种抗CD22 CAR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，b)跨膜结构域，及c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域能够活化免疫细胞。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初始信号传导序列及共刺激信号传导序列。在一些实施例中，初始信号传导序列包含CD3ζ胞内信号传导序列。在一些实施例中，共刺激信号传导序列包含CD28和/或4-1BB胞内信号传导序列。在一些实施例中，胞内结构域包含CD3ζ胞内信号传导序列以及CD28和/或4-1BB胞内信号传导序列。
在一些实施例中，抗CD22 CAR包含抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，抗CD22 CAR包含抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。
在一些实施例中，抗CD22 CAR包含抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，抗CD22 CAR包含抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。
嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)构建体
在一些实施例中，抗CD22构建体为嵌合抗体-T细胞受体构建体(本文中称为“caTCR”)，并且抗CD22嵌合抗体-T细胞受体为抗CD22 caTCR。在一些实施例中，抗CD22caTCR包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ IDNO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。
在一些实施例中，抗CD22 caTCR包含第一多肽链及第二多肽链。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，抗CD22 caTCR为杂二聚体，其包含第一多肽链及第二多肽链。在一些实施例中，第一多肽链及第二多肽链通过至少一个二硫键连接。抗CD22 caTCR的特异性来源于赋予CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)结合特异性的抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为Fv样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为scFv。抗CD22 caTCR募集TCR相关信号传导模块的能力来源于T细胞受体模块(TCRM)。在一些实施例中，TCRM包含TCR的跨膜模块(如αβTCR或γδTCR)。在一些实施例中，TCRM进一步包含TCR的连接肽或其片段中的一个或两个。在一些实施例中，抗CD22 caTCR进一步包含至少一个胞内结构域。在一些实施例中，抗CD22 caTCR的至少一个胞内结构域中的一个或多个包含来自TCR的胞内结构域的序列。在一些实施例中，抗体部分包含于抗CD22 caTCR的胞外结构域中。在一些实施例中，抗CD22 caTCR进一步包含在抗体部分与TCRM之间的一个或多个肽接头以优化胞外结构域的长度。
在一些实施例中，抗体部分为特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQID NO:205或其一部分)的Fab样抗原结合模块，其包含a)第一多肽链，其包含有包含VH抗体结构域及CH1抗体结构域的第一抗原结合区，及b)第二多肽链，其包含有包含VL抗体结构域及CL抗体结构域的第二抗原结合区。在一些实施例中，第一抗原结合区包含在CH1抗体结构域的氨基端的VH抗体结构域和/或第二抗原结合区包含在CL抗体结构域的氨基端的VL抗体结构域。在一些实施例中，在VL与CL抗体结构域之间存在肽接头和/或在VH与CH1抗体结构域之间存在肽接头。在一些实施例中，所有VL抗体结构域及VH抗体结构域CDR皆来源于同一抗体部分。在一些实施例中，VL抗体结构域及VH抗体结构域包含来源于超过一个抗体部分的抗体CDR。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过CH1结构域中的残基与CL结构域中的残基之间的二硫键连接。在一些实施例中，CH1结构域来源于IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)重链，任选地为人类的。在一些实施例中，CH1结构域为与衍生其的序列相比包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)的变异体。在一些实施例中，CL结构域来源于κ或λ同型的轻链。在一些实施例中，CL结构域为与衍生其的序列相比包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)的变异体。在一些实施例中，CH1和/或CL结构域包含一个或多个不显著改变其彼此之间的结合亲和力的修饰。在一些实施例中，CH1和/或CL结构域包含一个或多个增加其彼此之间的结合亲和力和/或引入非天然存在的二硫键的修饰。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成的。
在一些实施例中，抗体部分为特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQID NO:205或其一部分)的Fab样抗原结合模块，其包含a)第一多肽链，其包含有包含VL抗体结构域及CH1抗体结构域的第一抗原结合区，及b)第二多肽链，其包含有包含VH抗体结构域及CL抗体结构域的第二抗原结合区。在一些实施例中，第一抗原结合区包含在CH1抗体结构域的氨基端的VL抗体结构域和/或第二抗原结合区包含在CL抗体结构域的氨基端的VH抗体结构域。在一些实施例中，在VH与CL抗体结构域之间存在肽接头和/或在VL与CH1抗体结构域之间存在肽接头。在一些实施例中，所有VL抗体结构域及VH抗体结构域CDR皆来源于同一抗体部分。在一些实施例中，VL抗体结构域及VH抗体结构域包含来源于超过一个抗体部分的抗体CDR。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过CH1结构域中的残基与CL结构域中的残基之间的二硫键连接。在一些实施例中，CH1结构域来源于IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)重链，任选地为人类的。在一些实施例中，CH1结构域为与衍生其的序列相比包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)的变异体。在一些实施例中，CL结构域来源于κ或λ同型的轻链。在一些实施例中，CL结构域为与衍生其的序列相比包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)的变异体。在一些实施例中，CH1和/或CL结构域包含一个或多个不显著改变其彼此之间的结合亲和力的修饰。在一些实施例中，CH1和/或CL结构域包含一个或多个增加其彼此之间的结合亲和力和/或引入非天然存在的二硫键的修饰。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成的。
在一些实施例中，抗体部分为特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQID NO:205或其一部分)的Fv样抗原结合模块，其包含a)第一多肽链，其包含有包含VH抗体结构域及任选的来自T细胞受体子单元的第一TCR恒定结构域的第一抗原结合区；及b)第二多肽链，其包含有包含VL抗体结构域及任选的来自T细胞受体子单元的第二TCR恒定结构域的第二抗原结合区。在一些实施例中，第一抗原结合区包含在第一TCR恒定结构域的氨基端的VH抗体结构域和/或第二抗原结合区包含在第二TCR恒定结构域的氨基端的VL抗体结构域。在一些实施例中，在VL抗体结构域与第一TCR恒定结构域之间存在肽接头和/或在VH抗体结构域与第二TCR恒定结构域之间存在肽接头。在一些实施例中，所有VL抗体结构域及VH抗体结构域CDR皆来源于同一抗体部分。在一些实施例中，VL抗体结构域及VH抗体结构域包含来源于超过一个抗体部分的抗体CDR。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二抗原结合区通过第一TCR恒定结构域中的残基与第二TCR恒定结构域中的残基之间的二硫键连接。在一些实施例中，第一TCR恒定结构域来源于TCRα子单元，任选地为人类的，和/或第二TCR恒定结构域来源于TCRβ子单元，任选地为人类的。在一些实施例中，第一TCR恒定结构域来源于TCRδ子单元，任选地为人类的，和/或第二TCR恒定结构域来源于TCRγ子单元，任选地为人类的。在一些实施例中，第一和/或第二TCR恒定结构域为与衍生其的序列相比包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)的变异体。在一些实施例中，第一和/或第二TCR恒定结构域包含一个或多个不显著改变其彼此之间的结合亲和力的修饰。在一些实施例中，第一和/或第二TCR恒定结构域包含一个或多个增加其彼此之间的结合亲和力和/或引入非天然存在的二硫键的修饰。在一些实施例中，Fv样抗原结合模块为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成的。
在一些实施例中，抗体部分为特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQID NO:205或其一部分)的scFv，其包含a)多肽链，其包含VH抗体结构域及VL抗体结构域。在一些实施例中，scFv包含在VL抗体结构域的氨基端的VH抗体结构域。在一些实施例中，scFv包含在VH抗体结构域的氨基端的VL抗体结构域。在一些实施例中，在VL抗体结构域与VH抗体结构域之间存在肽接头。在一些实施例中，所有VL抗体结构域及VH抗体结构域CDR皆来源于同一抗体部分。在一些实施例中，VL抗体结构域及VH抗体结构域包含来源于超过一个抗体部分的抗体CDR。在一些实施例中，scFv为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成的。
在一些实施例中，TCRM包含a)第一多肽链，其包含有包含第一跨膜结构域的第一T细胞受体结构域(TCRD)，及b)第二多肽链，其包含有包含第二跨膜结构域的第二TCRD。在一些实施例中，第一跨膜结构域为第一TCR子单元的跨膜结构域和/或第二跨膜结构域为第二TCR子单元的跨膜结构域。在一些实施例中，第一TCR子单元为TCRα链(例如，GenBank寄存编号：CCI73895)，并且第二TCR子单元为TCRβ链(例如，GenBank寄存编号：CCI73893)。在一些实施例中，第一TCR子单元为TCRβ链，并且第二TCR子单元为TCRα链。在一些实施例中，第一TCR子单元为TCRγ链(例如，GenBank寄存编号：AGE91788)，并且第二TCR子单元为TCRδ链(例如，GenBank寄存编号：AAQ57272)。在一些实施例中，第一TCR子单元为TCRδ链，并且第二TCR子单元为TCRγ链。在一些实施例中，第一TCRD进一步包含在跨膜结构域的氨基端的第一连接肽和/或第二TCRD进一步包含在跨膜结构域的氨基端的第二连接肽。在一些实施例中，第一连接肽包含第一TCR子单元的所有或一部分连接肽和/或第二连接肽包含第二TCR子单元的所有或一部分连接肽。在一些实施例中，第一TCRD进一步包含在第一跨膜结构域的羧基端的第一TCR胞内结构域和/或第二TCRD进一步包含在第二跨膜结构域的羧基端的第二TCR胞内结构域。在一些实施例中，第一TCR胞内结构域包含第一TCR子单元的所有或一部分胞内结构域和/或第二TCR胞内结构域包含第二TCR子单元的所有或一部分胞内结构域。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR子单元的片段和/或第二TCRD为第二TCR链的片段。在一些实施例中，第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，第一及第二TCRD通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二TCRD通过第一连接肽中的残基与第二连接肽中的残基之间的二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一个选自由CD3δε、CD3γε及CD3ζ组成的群的TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，TCRM能够募集CD3δε、CD3γε及CD3ζ中的每一种以形成八聚抗CD22caTCR-CD3复合物(即，促进抗CD22 caTCR-CD3复合物形成)。
在一些实施例中，抗CD22 caTCR为包含抗体部分(其特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分))与TCRM的融合物的分子。在一些实施例中，抗CD22 caTCR包含在TCRM的第一多肽链的氨基端的Fab样或Fv样抗原结合模块的第一多肽链的融合物，借此形成抗CD22 caTCR的第一多肽链；及在TCRM的第二多肽链的氨基端的Fab样或Fv样抗原结合模块的第二多肽链的融合物，借此形成抗CD22 caTCR的第二多肽链。在一些实施例中，抗CD22 caTCR包含在TCRM的第一或第二多肽链的氨基端的scFv的融合物。在一些实施例中，抗CD22 caTCR进一步包含Fab样或Fv样抗原结合模块的第一多肽链与TCRM的第一多肽链之间的肽接头和/或Fab样或Fv样抗原结合模块的第二多肽链与TCRM的第二多肽链之间的肽接头。在一些实施例中，抗CD22 caTCR进一步包含在scFv与TCRM的第一或第二多肽链之间的肽接头。在一些实施例中，肽接头的长度在约5至约70个(如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个中的任一个，包括这些数值之间的任何范围)氨基酸之间。在一些实施例中，抗CD22 caTCR的第一多肽链进一步包含氨基端第一信号肽和/或抗CD22 caTCR的第二多肽链进一步包含氨基端第二信号肽。在一些实施例中，抗CD22 caTCR的第一多肽链进一步包含在第一跨膜结构域的羧基端的第一辅助胞内结构域和/或抗CD22 caTCR的第二多肽链进一步包含在第二跨膜结构域的羧基端的第二辅助胞内结构域。在一些实施例中，第一和/或第二辅助胞内结构域包含TCR共刺激结构域。在一些实施例中，抗CD22 caTCR的第一及第二多肽链如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，抗CD22 caTCR为杂二聚体。
因此，举例来说，在一些实施例中，提供一种抗CD22 caTCR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，抗体部分为Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为Fv样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为scFv。
在一些实施例中，提供一种抗CD22 caTCR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，提供一种抗CD22 caTCR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ IDNO:212的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:213的序列至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合；及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，抗体部分为Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为Fv样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为scFv。
在一些实施例中，提供一种抗CD22 caTCR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，提供一种抗CD22 caTCR，其包含a)胞外结构域，其包含特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)的抗CD22抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:219的序列至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合；及b)T细胞受体模块(TCRM)，其能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。在一些实施例中，抗体部分为Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为Fv样抗原结合模块。在一些实施例中，抗体部分为scFv。
在一些实施例中，抗CD22构建体为嵌合信号传导受体(CSR)。举例来说，CSR可包含：(a)本文中所描述的抗CD22抗体部分(例如包含具有SEQ ID NO:218的序列的轻链可变区及具有SEQ ID NO:219的序列的重链可变区的抗CD22抗体部分；或包含具有SEQ ID NO:212的序列的轻链可变区及具有SEQ ID NO:213的序列的重链可变区的抗CD22抗体部分)；(b)跨膜模块；及(c)共刺激免疫细胞信号传导模块，其能够向免疫细胞提供共刺激信号，其中CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导结构域。在一些实施例中，CSR与caTCR或CAR(例如特异性标靶CD22的caTCR或CAR)组合使用。
嵌合共刺激受体(CSR)构建体
本文中所描述的配体特异性嵌合共刺激受体(CSR)特异性结合于靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)，并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。CSR包含提供配体结合特异性的配体结合模块、跨膜模块及允许刺激免疫细胞的共刺激免疫细胞信号传导模块。CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，CSR不具有任何原代免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，CSR包含单一多肽链，其包含配体结合模块、跨膜模块及共刺激信号传导模块。在一些实施例中，CSR包含第一多肽链及第二多肽链，其中第一及第二多肽链共同形成配体结合模块、跨膜模块及共刺激信号传导模块。在一些实施例中，第一及第二多肽链为单独的多肽链，并且CSR为多聚体，如二聚体。在一些实施例中，第一与第二多肽链共价连接，如通过肽键或通过另一种化学键(如二硫键)连接。在一些实施例中，第一多肽链及第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施例中，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为诱导性的。在一些实施例中，经由caTCR进行信号传导后，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为诱导性的。CSR的其它说明可见于2017年4月26日提交的美国申请第62/490,578号中，其以全文引用的方式并入本文中。
用于本发明的CSR的共刺激免疫细胞信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变异体及具有相同功能性能力的任何合成序列，所述T细胞受体可与caTCR共同起作用以在caTCR接合后起始信号转导。
已知经由单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级或共刺激信号。因此，可认为T细胞活化由两种不同类别的胞内信号传导序列介导：经由TCR起始抗原依赖性初始活化的序列(本文中称为“初始T细胞信号传导序列”)及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(本文中称为“共刺激T细胞信号传导序列”)。
以刺激方式起作用的原代免疫细胞信号传导序列可含有信号传导基元，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元或ITAM。含有ITAM的原代免疫细胞信号传导序列的实例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的序列。“功能性”原代免疫细胞信号传导序列为在与适合的受体可操作地偶联时能够转导免疫细胞活化信号的序列。可包含原代免疫细胞信号传导序列的片段或变异体的“非功能性”原代免疫细胞信号传导序列不能转导免疫细胞活化信号。本文中所描述的CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导序列，如包含ITAM的功能性信号传导序列。在一些实施例中，CSR不具有任何原代免疫细胞信号传导序列。
共刺激免疫细胞信号传导序列可为共刺激分子(包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等)的胞内结构域的一部分。
在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合物。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为在呈现靶抗原的细胞表面上呈现的分子。举例来说，在一些实施例中，caTCR的靶抗原为癌细胞上呈现的癌症相关抗原，并且靶配体为表达于癌细胞表面上的遍在分子，如整合素。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合物，其包含来源于包括WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包括FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。
在一些实施例中，配体结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分特异性结合细胞表面抗原，例如CD22。在一些实施例中，抗体部分包含对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如VH结构域，其包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；和/或VL结构域，其包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包含对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如VH结构域，其包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；和/或VL域，其包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。
在一些实施例中，跨膜模块包含一个或多个跨膜结构域，其来源于例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在一些实施例中，共刺激信号传导模块包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。
在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合模块、跨膜模块及共刺激信号传导模块中的任一种之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包含连接两个CSR模块的一个或多个肽接头。在一些实施例中，间隔模块包含长度在约5至约70个(如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氨基酸之间的一个或多个肽接头。
在一些实施例中，配体结合模块(如抗体部分)在以下条件下特异性结合于靶抗原：a)亲和力为其对其它分子的结合亲和力的至少约10(包括例如至少约10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000中的任一个或更高)倍；或b)Kd不超过其结合于其它分子的Kd的约1/10(如不超过约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000中的任一个或更低)倍。结合亲和力可通过所属领域中已知的方法测定，如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析法(RIA)。Kd可通过所属领域中已知的方法测定，如利用例如Biacore仪器的表面等离激元共振(SPR)分析法，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排除分析法(KinExA)。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于靶配体(例如CD22)，其包含a)靶配体结合域(LBD)；b)跨膜结构域；及c)共刺激信号传导结构域，其中CSR能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合物。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合物，其包含来源于包括WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包括FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，配体结合域为(或来源于)靶配体的受体的胞外结构域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包括例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜结构域包含来源于跨膜蛋白(包括例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154)的跨膜结构域。在一些实施例中，CSR包含跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包含CSR跨膜结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR包含免疫细胞共刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包含CSR跨膜结构域及CSR共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合域、跨膜结构域及共刺激信号传导结构域中的任一个之间的间隔结构域。在一些实施例中，间隔结构域包含连接两个CSR结构域的肽接头。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于靶配体(例如CD22)，其包含a)靶配体结合域；b)跨膜结构域；及c)共刺激信号传导结构域，其中靶配体为细胞表面抗原，并且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包括FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，配体结合域为(或来源于)靶配体的受体的胞外结构域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包括例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜结构域包含来源于跨膜蛋白(包括例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154)的跨膜结构域。在一些实施例中，CSR包含跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包含CSR跨膜结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR包含免疫细胞共刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包含CSR跨膜结构域及CSR共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合域、跨膜结构域及共刺激信号传导结构域中的任一个之间的间隔结构域。在一些实施例中，间隔结构域包含连接两个CSR结构域的肽接头。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于靶配体(例如CD22)，其包含a)靶配体结合域；b)跨膜结构域；及c)共刺激信号传导结构域，其中靶配体为肽/MHC复合物，并且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合物，其包含来源于包括WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，跨膜结构域包含来源于跨膜蛋白(包括例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154)的跨膜结构域。在一些实施例中，CSR包含跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包含CSR跨膜结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR包含免疫细胞共刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包含CSR跨膜结构域及CSR共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合域、跨膜结构域及共刺激信号传导结构域中的任一个之间的间隔结构域。在一些实施例中，间隔结构域包含连接两个CSR结构域的肽接头。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于靶配体(例如CD22)，其包含a)靶配体结合域；b)跨膜结构域；及c)共刺激信号传导结构域，其中配体结合域为抗体部分，并且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合物。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合物，其包含来源于包括WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包括FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，跨膜结构域包含来源于跨膜蛋白(包括例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154)的跨膜结构域。在一些实施例中，CSR包含跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包含CSR跨膜结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR包含免疫细胞共刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包含CSR跨膜结构域及CSR共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合域、跨膜结构域及共刺激信号传导结构域中的任一个之间的间隔结构域。在一些实施例中，间隔结构域包含连接两个CSR结构域的肽接头。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于靶配体(例如CD22)，其包含a)靶配体结合域；b)跨膜结构域；及c)共刺激信号传导结构域，其中配体结合域为(或来源于)靶配体的受体的胞外结构域的全部或一部分，并且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包括FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，靶配体受体包括例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜结构域包含来源于例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含免疫细胞共刺激分子的胞内结构域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR进一步包含在配体结合域、跨膜结构域及共刺激信号传导结构域中的任一个之间的间隔结构域。在一些实施例中，间隔结构域包含连接两个CSR结构域的肽接头。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于CD22，其包含scFv，所述scFv包含具有SEQ ID NO:219的氨基酸序列的VH结构域及具有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施例中，scFv从氨基端至羧基端包含VL结构域、包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的肽接头及VH结构域。
在一些实施例中，本文中所描述的CSR特异性结合于CD22，其包含scFv，所述scFv包含具有SEQ ID NO:213的氨基酸序列的VH结构域及具有SEQ ID NO:212的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施例中，scFv从氨基端至羧基端包含VL结构域、包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的肽接头及VH结构域。
在一些实施例中，CSR可为抗CD22 CSR、抗CD19 CSR或抗CD20 CSR。CSR可包含胞内片段(即，共刺激免疫细胞信号传导序列)，其可为共刺激分子的胞内结构域的一部分。共刺激分子的实例包括(但不限于)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83特异性结合的配体等。在一些实施例中，CSR可包含跨膜片段，其可为共刺激分子的跨膜部分的片段。在一些实施例中，CSR中的胞内片段及跨膜片段可来自相同的共刺激分子(例如CD28或CD30)。在一些实施例中，CSR中的胞内片段及跨膜片段可来自不同的共刺激分子。在一些实施例中，可由第一共刺激分子获得胞内片段并与来自第二共刺激分子的跨膜片段融合。举例来说，跨膜片段可来自CD8的跨膜部分且胞内片段可来自CD30的胞内结构域。在一些实施例中，当CSR中的胞内片段及跨膜片段来自相同的共刺激分子时，可由单一共刺激分子(例如单一CD28或单一CD30)获得胞内片段及跨膜片段。在其它实施例中，当CSR中的胞内片段及跨膜片段来自相同的共刺激分子时，可由第一共刺激分子(例如第一CD28)获得胞内片段并与由第二共刺激分子(例如第二CD28)获得的跨膜片段融合。
在一些实施例中，抗CD19包含与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，抗CD22CSR包含与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，抗CD20 CSR包含与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，CSR包含与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为诱导性的。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞包含编码CSR的核酸序列，其可操作地连接于诱导性启动子，包括本文中所描述的诱导性启动子中的任一种。在一些实施例中，经由caTCR进行信号传导后，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为诱导性的。在一些此类实施例中，caTCR加CSR免疫细胞包含编码CSR的核酸序列，其响应于经由caTCR进行的信号传导而可操作地连接于启动子或调节组件。在一些实施例中，编码CSR的核酸序列可操作地连接于经活化的T细胞(NFAT)衍生的启动子的核因子。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子为NFAT衍生的最小启动子(参见例如杜兰德D.(Durand,D.)等人,分子和细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)8,1715-1724(1988)；克里斯通NA(Clipstone,NA),克拉布特里GR.(Crabtree,GR.)自然.1992 357(6380):695-7；赫梅莱夫斯基M.(Chmielewski,M.)等人,癌症研究(Cancer research)71.17(2011):5697-5706；及张L.(Zhang,L.)等人,分子疗法(Molecular therapy)19.4(2011):751-759)。
本文中还提供表达抗CD22构建体(如抗CD22 CAR、抗CD22 caTCR或抗CD22 CSR)的效应细胞(如淋巴细胞，例如T细胞)。
还提供用于制备表达抗CD22 CAR、抗CD22 caTCR或抗CD22 CSR的效应细胞的方法，所述方法包含将包含编码抗CD22 CAR、抗CD22 caTCR或抗CD22 CSR的核酸的载体引入效应细胞中。在一些实施例中，将载体引入效应细胞中包含通过载体转导效应细胞。在一些实施例中，将载体引入效应细胞中包含通过载体转染效应细胞。载体转导或转染于效应细胞中可使用所属领域中已知的任何方法进行。
单特异性构建体
本发明提供单特异性构建体，其特异性结合于靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并且能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述构建体的免疫细胞。在一些实施例中，单特异性构建体特异性标靶CD22。在一些实施例中，单特异性构建体可为caTCR、CSR、CAR、全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体、串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再标靶(DART)抗体、双重可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、锁钥结构(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。
在一些实施例中，单特异性构建体为包含抗CD22抗体部分的抗CD22构建体。在某些实施例中，抗CD22抗体部分包含：(a)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；及(b)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在某些实施例中，抗CD22抗体部分包含：(a)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；及(b)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在其它实施例中，抗CD22抗体部分包含抗CD22 scFv，其包含与SEQ ID NO:186的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，单特异性抗CD22构建体为caTCR、CSR、CAR或抗体，其各自可为单价或多价(例如二价、三价、四价)。举例来说，构建体4(SEQ ID NO:4)包含抗CD22 scFv及抗CD22 Fab并且也称为“二价单特异性”构建体。在一些实施例中，单特异性抗CD22构建体为多价caTCR，其可含有多个Fab或Fab与scFv的组合。
在一些实施例中，单特异性构建体可为caTCR，例如抗CD22 caTCR、抗CD19 caTCR或抗CD20 caTCR。在一些实施例中，单特异性caTCR包含与SEQ ID NO:2、4、22、28及76-80中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，单特异性构建体可为CSR，例如抗CD22 CSR、抗CD19 CSR或抗CD20 CSR。在一些实施例中，抗CD19包含与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，抗CD22CSR包含与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，抗CD20 CSR包含与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
多特异性构建体
在一些实施例中，抗CD22构建体可为多特异性(例如双特异性)。多特异性抗CD22构建体具有针对超过一个目标的抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体具有一个针对CD22的抗体部分及一个或多个针对一种或多种非CD22抗原(例如CD19、CD20，一种表达于B细胞恶性病中的非CD22抗原)的其它抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体可为双特异性、三特异性、四特异性或五特异性。在一些实施例中，多特异性抗CD22构建体可为caTCR、CSR、CAR、全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体、串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再标靶(DART)抗体、双重可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、锁钥结构(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。
多特异性构建体-双特异性构建体
本发明提供双特异性构建体，其特异性结合于两个靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述构建体的免疫细胞。在一些实施例中，双特异性构建体特异性标靶CD22及CD19。在其它实施例中，双特异性构建体特异性标靶CD22及CD20。
在一些实施例中，双特异性构建体可为caTCR，例如抗CD22-抗CD19 caTCR。在一些实施例中，双特异性caTCR包含与SEQ ID NO:15-21中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，双特异性构建体可为CSR。在一些实施例中，双特异性CSR包含与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
多特异性构建体-三特异性构建体
本发明提供三特异性构建体，其特异性结合于三个靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述构建体的免疫细胞。在一些实施例中，三特异性构建体特异性标靶CD22、CD19及CD20。
在一些实施例中，三特异性构建体包含与SEQ ID NO:24-27中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。在一些实施例中，从SEQ ID NO:24-27中的任一个的序列去除FLGA标签(SEQ ID NO:195)。
构建体组合
本发明提供构建体组合，其包含至少两个不同的本发明的构建体。在一些实施例中，所述至少两个不同的构建体为相同类型的构建体，例如两个不同的抗体(例如两个不同的全长IgG或两个不同的双特异性抗体)、两个不同的CAR、两个不同的caTCR或两个不同的CSR。在一些实施例中，所述至少两个不同的构建体为不同类型的构建体，例如抗体加CAR、抗体加caTCR、CAR加CSR、caTCR加CSR等。在一些实施例中，构建体组合包含至少一个单特异性构建体。在一些实施例中，构建体组合包含至少一个多特异性构建体。在一些实施例中，构建体组合包含至少一个单特异性构建体及至少一个多特异性构建体。在一些实施例中，构建体组合中的所述至少两个不同的构建体具有针对至少一种共同目标的抗体部分。在一些实施例中，构建体组合中的所述至少两个不同的构建体不具有针对任何共同目标的抗体部分。
在一些实施例中，构建体组合包含至少一个本发明的抗CD22构建体。在一些实施例中，所述至少一个抗CD22构建体为抗体、CAR、caTCR或CSR。在一些实施例中，所述至少一个抗CD22构建体为单特异性构建体。在一些实施例中，所述至少一个抗CD22构建体为多特异性构建体。在一些实施例中，所述至少一个抗CD22构建体为抗CD22 caTCR，并且构建体组合包含CSR。在一些实施例中，抗CD22 caTCR与CSR组合表达。在一些实施例中，所述至少一个抗CD22构建体为抗CD22 CSR，并且构建体组合包含caTCR。在一些实施例中，抗CD22 CSR与caTCR组合表达。
包含单特异性构建体的构建体组合
在一些实施例中，构建体组合包含至少一个单特异性构建体，其特异性结合于靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述至少一个单特异性构建体的免疫细胞。在一些实施例中，单特异性构建体特异性标靶CD22。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性构建体，并且构建体组合包含与SEQID NO:1、3及5-14中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有包含CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30或OX40的跨膜片段的序列。在一些实施例中，跨膜片段具有SEQ ID NO:145-150中的任一个的序列。在一些实施例中，CSR包含抗CD22部分。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有包含选自由以下组成的群组的分子的胞内片段的序列：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30及CD27。在一些实施例中，胞内片段包含SEQ ID NO:151-155中的任一个的序列。在一些实施例中，CSR包含抗CD22部分。
在一些实施例中，构建体组合包含单特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:77中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有包含SEQ ID NO:156-171中的任一个的序列的序列。在一些实施例中，CSR包含抗CD22部分。
在本文中所公开的构建体组合中的任一种中，在一些实施例中，各caTCR及CSR最初可由单一核酸编码、表达及以单一多肽形式翻译，并接着裂解成单独的多肽。caTCR及CSR可经由可裂解的P2A肽(例如SEQ ID NO:190)连接。在其它实施例中，caTCR及CSR可由两种不同的核酸编码、表达并且分别翻译成单独的多肽。
包含双特异性构建体的构建体组合
在一些实施例中，构建体组合包含至少一个双特异性构建体，其特异性结合于两个靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述至少一个双特异性构建体的免疫细胞。在一些实施例中，双特异性构建体特异性标靶CD22及CD19。在其它实施例中，双特异性构建体特异性标靶CD22及CD20。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性构建体，并且构建体组合包含与SEQID NO:23及29-75中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:15的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:16的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:17的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:18的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:19的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:20的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:21的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:15的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:16的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:17的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:18的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:19的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:20的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:21的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:15的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:16的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:17的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:18的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:19的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:20的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:21的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:15的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:16的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:17的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:18的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:19的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:20的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含双特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:21的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:129-144中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在包含本文中所公开的双特异性caTCR及CSR的构建体组合中的任一种中，在一些实施例中，各caTCR及CSR最初可由单一核酸编码、表达及以单一多肽形式翻译，并接着裂解成单独的多肽。caTCR及CSR可经由可裂解的P2A肽(例如SEQ ID NO:190)连接。在其它实施例中，caTCR及CSR可由两种不同的核酸编码、表达并且分别翻译成单独的多肽。
包含三特异性构建体的构建体组合
在一些实施例中，构建体组合包含至少一个三特异性构建体，其特异性结合于三个靶配体(如细胞表面抗原或肽/MHC复合物)并能够在靶配体结合之后刺激在表面上功能性表达所述至少一个三特异性构建体的免疫细胞。在一些实施例中，三特异性构建体特异性标靶CD22、CD19及CD20。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:24的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:26的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:27的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:24的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:26的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:27的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:24的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:26的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，构建体组合包含三特异性caTCR及CSR，其中caTCR具有与SEQ IDNO:27的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列并且CSR具有与SEQ ID NO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在包含本文中所公开的三特异性caTCR及CSR的构建体组合中的任一种中，在一些实施例中，各caTCR及CSR最初可由单一核酸编码、表达及以单一多肽形式翻译，并接着裂解成单独的多肽。caTCR及CSR可经由可裂解的P2A肽(例如SEQ ID NO:190)连接。在其它实施例中，caTCR及CSR可由两种不同的核酸编码、表达并且分别翻译成单独的多肽。
在一些实施例中，当在结合靶抗原之后与CD3ζ结合时，caTCR可活化T细胞。CSR通常在结合靶抗原之后不与CD3ζ结合并且不活化T细胞。caTCR及CSR的其它说明及实例可见于国际专利公开第WO2018/200582号及第WO2018/200583号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
抗体-药物结合物
在一些实施例中，提供包含抗CD22抗体部分及治疗剂的抗CD22免疫结合物(在本文中也称为“抗体-药物结合物”或“ADC”)。在一些实施例中，治疗剂为毒素，其为细胞毒性、细胞生长抑制性或以其它方式阻止或降低靶细胞分裂的能力。使用ADC局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，即在癌症治疗中杀灭或抑制肿瘤细胞的药物(希里格斯(Syrigos)及艾潘多斯(Epenetos),抗癌研究(Anticancer Research)19:605-614(1999)；尼库雷斯库-杜瓦斯(Niculescu-Duvaz)及施普林格(Springer),先进药物递送评论(Adv.Drg.Del.Rev.)26:151-172(1997)；美国专利第4,975,278号)实现药物部分对靶细胞的标靶递送及靶细胞中的胞内聚集，其中全身性投与这些非结合治疗剂可对于正常细胞以及设法消除的靶细胞产生不可接受的毒性含量(鲍德温(Baldwin)等人,柳叶刀(Lancet)(1986年3月15日):603-605(1986)；索普(Thorpe),(1985)“癌症疗法中的细胞毒性剂的抗体载剂：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview)”,单克隆抗体'84：生物学和临床应用(Monoclonal Antibodies'84:BiologicalAnd Clinical Applications),A.皮钦查(A.Pinchera)等人(编),第475-506页)。借此寻求在最小毒性下的最大功效。
用于抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)中的治疗剂包括例如柔红霉素(daunomycin)、小红莓(doxorubicin)、氨甲喋呤(methotrexate)及长春地辛(vindesine)(罗兰德(Rowland)等人,癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)21:183-187(1986))。用于抗CD22免疫结合物中的毒素包括细菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如蓖麻毒素；小分子毒素，如格尔德霉素(geldanamycin)(曼德勒(Mandler)等人,美国国家癌症研究所杂志(J.Nat.Cancer Inst.)92(19):1573-1581(2000)；曼德勒等人,生物有机化学与医药化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)10:1025-1028(2000)；曼德勒等人,生物结合化学(Bioconjugate Chem.)13:786-791(2002))、类美登素(maytansinoids)(EP1391213；刘(Liu)等人,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93:8618-8623(1996))及卡奇霉素(calicheamicin)(洛德(Lode)等人,癌症研究58:2928(1998)；黑曼(Hinman)等人,癌症研究53:3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓朴异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性及细胞抑制作用。一些细胞毒性药物在与大型抗体或蛋白质受体配体结合时，倾向于为非活性的或弱活性的。
可使用的酶活性毒素及其片段包括例如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)及霉菌毒素(tricothecene)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本文中还涵盖抗CD22抗体部分及一种或多种小分子毒素(如卡奇霉素、类美登素、海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(aurostatin)、新月毒素(trichothecene)及CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)。
在一些实施例中，提供一种抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)，其包含具有胞内活性的治疗剂。在一些实施例中，抗CD22免疫结合物经内化并且治疗剂为阻断细胞的蛋白质合成，在其中引起细胞死亡的细胞毒素。在一些实施例中，治疗剂为包含具有核糖体不活化活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树素、波甘宁(bouganin)、沙泊宁(saporin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、榄香胶素(bryodin)、白喉毒素、局限曲菌素(restrictocin)、绿脓杆菌外毒素A及其变异体。在一些实施例中，当治疗剂为包含具有核糖体不活化活性的多肽的细胞毒素时，抗CD22免疫结合物必须在结合于靶细胞时经内化以使蛋白质对细胞具有细胞毒性。
在一些实施例中，提供一种抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)，其包含用于破坏DNA的治疗剂。在一些实施例中，用于破坏DNA的治疗剂例如选自由以下组成的群组：烯二炔(例如卡奇霉素及埃斯培拉霉素(esperamicin))及非烯二炔小分子试剂(例如博莱霉素(bleomycin)、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。
本发明还涵盖形成于抗CD22抗体部分与具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间的抗CD22免疫结合物(例如抗CD22ADC)。
在一些实施例中，抗CD22免疫结合物包含用于破坏微管蛋白的试剂。此类试剂可包括例如根瘤菌素/美登素(rhizoxin/maytansine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)及长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、奥瑞他汀海兔毒素10MMAE(auristatin dolastatin 10MMAE)及派罗苷A(peloruside A)。
在一些实施例中，抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)包含烷基化剂，包括例如Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂NSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC3088、氯脲菌素NSC 178248、顺铂NSC 119875、氯乙矾NSC 338947、氰基(N-吗啉基)小红莓NSC 357704、塞迪逊(cyclodisone)NSC 348948、卫康醇NSC 132313、氟多潘NSC 73754、海普法姆(hepsulfam)NSC 329680、羟胺硫蒽酮NSC 142982、美法仑(melphalan)NSC 8806、甲基CCNU NSC 95441、丝裂霉素C NSC 26980、米托唑酰胺NSC 353451、氮芥NSC 762、PCNUNSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪二酮NSC 135758、哌泊溴烷NSC 25154、泊非罗霉素NSC56410、螺乙内酰脲芥NSC 172112、替罗昔隆(teroxirone)NSC 296934、四铂NSC 363812、噻替派(thio-tepa)NSC 6396、三亚乙基三聚氰胺NSC 9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462及Yoshi-864 NSC 102627。
在一些实施例中，抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)包含高放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性结合抗体。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb及Lu的放射性同位素。
在一些实施例中，抗CD22抗体部分可与“受体”(如抗生蛋白链菌素)结合以用于肿瘤预先标靶，其中向患者投与抗体-受体结合物，随后使用清除剂将未结合的结合物从循环中去除，并随后投与结合于细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生素蛋白)。
在一些实施例中，抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)可包含与前药活化酶结合的抗CD22抗体部分。在一些此类实施例中，前药活化酶将前药转化为活性药物，如抗病毒药物。在一些实施例中，此类抗CD22免疫结合物适用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)。可与抗体结合的酶包括(但不限于)碱性磷酸酶，其适用于将含有磷酸酯的前药转化为自由药物；芳基硫酸酯酶，其适用于将含有硫酸酯的前药转化为自由药物；蛋白酶，如沙雷氏菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶及组织蛋白酶(如组织蛋白酶B及L)，其适用于将含有肽的前药转化为自由药物；D-丙氨酰羧肽酶，其适用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，如β-半乳糖苷酶及神经胺糖酸苷酶，其适用于将糖基化前药转化为自由药物；β-内酰胺酶，其适用于将通过β-内酰胺衍生的药物转化为自由药物；及青霉素(penicillin)酰胺酶，如青霉素V酰胺酶及青霉素G酰胺酶，其适用于将分别通过苯氧基乙酰基或苯乙基在胺氮处衍生的药物转化为自由药物。在一些实施例中，酶可通过所属领域中熟知的重组型DNA技术共价结合于抗体部分。参见例如纽伯格(Neuberger)等人,自然312:604-608(1984)。
在一些实施例中，抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)的治疗性部分可为核酸。可使用的核酸包括(但不限于)反义RNA、基因或其它聚核苷酸，包括核酸类似物，如硫鸟嘌呤及硫代嘌呤。
本申请还提供包含连接于效应分子的抗CD22抗体部分的抗CD22免疫结合物(例如抗CD22 ADC)，其中效应分子为标记，其可间接或直接产生可检测信号。这些抗CD22免疫结合物可用于研究或诊断应用，如用于癌症的体内检测。标记优选能够直接或间接地产生可检测信号。举例来说，标记可为射线不透的或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖或辣根过氧化酶；显影剂；或金属离子。在一些实施例中，标记为用于闪烁照相研究的放射性原子，例如99Tc或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂络合并与抗体结合，例如用于PET成像(WO2011/056983)。
在一些实施例中，可间接检测抗CD22免疫结合物。举例来说，对抗CD22免疫结合物具有特异性并含有可检测标记的二级抗体可用于检测抗CD22免疫结合物。
III.caTCR加CSR免疫细胞
本发明提供一种免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上呈现根据本文中所描述的caTCR及CSR中的任一种的caTCR及CSR(此类免疫细胞在本文中也称为“caTCR加CSR免疫细胞”)。在一些实施例中，免疫细胞包含编码caTCR及CSR的核酸，其中caTCR及CSR由核酸表达并定位于免疫细胞表面。在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或T细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的内源性TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。用于破坏基因表达的细胞修饰包括所属领域中已知的任何此类技术，包括例如RNA干扰(例如siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如基于CRISPR或TALEN的基因剔除)等。
举例来说，在一些实施例中，提供一种免疫细胞(如T细胞)，其包含编码根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR的核酸，其中caTCR及CSR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施例中，核酸包含编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列、编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列及编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自包含于不同载体中。在一些实施例中，一些或全部核酸序列包含于同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体及病毒载体(如来源于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒的载体)组成的群。在一些实施例中，将一种或多种载体整合于免疫细胞的宿主基因组中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列以及CSR核酸序列各自处于不同启动子的控制下。在一些实施例中，一些或全部启动子具有相同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子具有不同序列。在一些实施例中，一些或全部核酸序列处于单一启动子的控制下。在一些实施例中，一些或全部启动子为诱导性的。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。
因此，在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上表达根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包含a)编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；b)编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及c)编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，其中CSR多肽链由CSR核酸表达以形成CSR，并且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，第一caTCR核酸序列包含于第一载体(如慢病毒载体)中，第二caTCR核酸序列包含于第二载体(如慢病毒载体)中，并且CSR核酸序列包含于第三载体(如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列中的一些或全部包含于同一载体(如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列中的每一个个别地可操作地连接于启动子。在一些实施例中，一些或全部核酸序列处于单一启动子的控制下。在一些实施例中，一些或全部启动子具有相同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子具有不同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子为诱导性的。在一些实施例中，一些或全部载体为病毒载体(如慢病毒载体)。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，一些或全部载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(如慢病毒载体)。
在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上表达根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包含a)第一载体，其包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接于编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；b)第二载体，其包含第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及c)第三载体，其包含第三启动子，所述第三启动子可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，并且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，并且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，一些或全部启动子具有相同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子具有不同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子为诱导性的。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，第一及第二载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(如慢病毒载体)。
在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上表达根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包含a)第一载体，其包含i)第一启动子，其可操作地连接于编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列，及ii)第二启动子，其可操作地连接于编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及b)第二载体，其包含第三启动子，其可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，并且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，并且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，一些或全部启动子具有相同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子具有不同序列。在一些实施例中，一些或全部启动子为诱导性的。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，第一及第二载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(如慢病毒载体)。应了解，还涵盖其中交换核酸序列中的任一个，如其中第一或第二caTCR核酸序列与CSR核酸序列交换的实施例。
在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上表达根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包含a)第一载体，其包含i)第一caTCR核酸序列，其编码caTCR的第一caTCR多肽链，及ii)第二caTCR核酸序列，其编码caTCR的第二caTCR多肽链，其中第一及第二caTCR核酸序列处于第一启动子的控制下；及b)第二载体，其包含第二启动子，其可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，并且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，并且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第一caTCR核酸序列的5'端，并且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群的核酸接头以将第一caTCR核酸序列的3'端连接于第二caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第二caTCR核酸序列的5'端，并且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群的核酸接头以将第二caTCR核酸序列的3'端连接于第一caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一和/或第二启动子具有相同序列。在一些实施例中，第一和/或第二启动子具有不同序列。在一些实施例中，第一和/或第二启动子为诱导性的。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(如慢病毒载体)。应了解，还涵盖其中交换核酸序列中的任一种，如其中第一或第二caTCR核酸序列与CSR核酸序列交换的实施例。
在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(如T细胞)，其在其表面上表达根据本文中所描述的caTCR中的任一种的caTCR及根据本文中所描述的CSR中的任一种的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包含载体，其包含a)第一caTCR核酸序列，其编码caTCR的第一caTCR多肽链；b)第二caTCR核酸序列，其编码caTCR的第二caTCR多肽链；及c)CSR核酸序列，编码CSR的CSR多肽链，其中第一及第二caTCR核酸序列以及CSR核酸序列处于单一启动子的控制下；其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，并且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，并且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，启动子可操作地连接于一个核酸序列，所述核酸序列通过个别地选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群的核酸接头连接于其它核酸序列，使得第一及第二caTCR核酸序列以及CSR核酸序列在启动子的控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，启动子为诱导性的。在一些实施例中，免疫细胞不表达衍生caTCR的TCR-TM的TCR子单元。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞并且所引入的caTCR的TCR-TM包含来源于TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源TCR子单元中的一个或两个的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(如慢病毒载体)。
IV.Fc变异体
在一些实施例中，本文中所描述的抗CD22构建体可包含变异型Fc区，其中变异型Fc区与参考Fc区(或亲本Fc区或野生型Fc区)相比可包含至少一个氨基酸修饰。可在Fc区中进行氨基酸修饰以改变效应功能和/或提高构建体的血清稳定性。包含变异型Fc区的构建体可显示改变的对Fc受体(例如FcγR)的亲和力，限制条件为基于Fc-Fc受体相互作用的结晶及结构分析，如由桑德曼(Sondermann)等人,2000,自然,406:267-273所公开的分析，变异型Fc区在与Fc受体直接接触的位置处不具有取代。Fc区内与Fc受体进行直接接触的位置的实例如FcγR为氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)及氨基酸327-332(F/G)环。在一些实施例中，基于结构及结晶分析，包含变异型Fc区的构建体可包含至少一个与FcγR进行直接接触的残基的修饰。
引起改进的效应功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC))、增加对C1q的结合亲和力、减少或消除FcR结合、延长半衰期的用于产生变异型Fc区的Fc区中的氨基酸修饰(例如改变对活化和/或抑制受体的亲和力)为所属领域中已知的(参见例如美国专利第9,051,373号、第9,040,041号、第8,937,158号、第8,883,973号、第8,883,147号、第8,858,937号、第8,852,586号、第8,809,503号、第8,802,823号、第8,802,820号、第8,795,661号、第8,753,629号、第8,753,628号、第8,735,547号、第8,735,545号、第8,734,791号、第8,697,396号、第8,546,543号、第8,475,792号、第8,399,618号、第8,394,925号、第8,388,955号、第8,383,109号、第8,367,805号、第8,362,210号、第8,338,574号、第8,324,351号、第8,318,907号、第8,188,231号、第8,124,731号、第8,101,720号、第8,093,359号、第8,093,357号、第8,088,376号、第8,084,582号、第8,039,592号、第8,012,476号、第7,799,900号、第7,790,858号、第7,785,791号、第7,741,072号、第7,704,497号、第7,662,925号、第7,416,727号、第7,371,826号、第7,364,731号、第7,335,742号、第7,332,581号、第7,317,091号、第7,297,775号、第7,122,637号、第7,083,784号、第6,737,056号、第6,538,124号、第6,528,624号及第6,194,551号)。
在一些实施例中，变异型Fc区与亲本Fc区相比可具有不同的糖基化模式(例如去糖基化)。在一些实施例中，不同糖基化模式可由不同细胞系(例如经工程改造的细胞系)中的表达产生。
本文中所描述的构建体可包含以较大亲和力结合于一个或多个FcγR的变异型Fc区。此类构建体优选更有效地介导效应功能，如下文所论述。在一些实施例中，本文中所描述的构建体可包含以较弱亲和力结合于一个或多个FcγR的变异型Fc区。在某些情况下，可能需要降低或消除效应功能，举例来说，在作用机制涉及阻断或拮抗而非杀灭具有靶抗原的细胞的构建体的情况下。在一些实施例中，增加的效应功能可针对肿瘤细胞及表达外来抗原的细胞。
V.构建体产生
所提供的构建体或其部分或编码其的核酸可通过任何可用手段产生。用于构建体产生的方法为所属领域中熟知的。所属领域中可使用用于产生抗体(例如scFv抗体、单克隆抗体和/或多克隆抗体)的技术。应了解，广泛范围的动物物种可用于产生抗血清，例如小鼠、大鼠、兔、猪、母牛、鹿、绵羊、山羊、猫、犬、猴及鸡。动物的选择可根据操作的简易性、成本或所需血清量决定，如所属领域的技术人员将已知。应了解，抗体还可以转基因方式经由产生对相关免疫球蛋白重链及轻链序列来说为转基因的哺乳动物或植物(例如对人类免疫球蛋白重链及轻链基因来说为转基因的转基因啮齿动物)来产生。结合哺乳动物中的转基因产生，抗体可在山羊、母牛或其它哺乳动物的乳汁中产生并且从其回收(参见例如美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号及第5,741,957号；其以全文引用的方式并入本文中)。或者，抗体可在鸡中制得，产生IgY分子(沙德(Schade)等人,1996,ALTEX 13(5):80-85)。
在一些实施例中，适用于本发明的抗体为类人灵长类动物抗体。举例来说，用于在狒狒中产生治疗学上适用的抗体的通用技术可见于例如国际专利申请公开第1991/11465号及洛斯曼(Losman)等人,1990,国际癌症期刊(Int.J.Cancer)46:310中。在一些实施例中，可使用融合瘤方法(米尔斯坦(Milstein)及奎略(Cuello),1983,自然305(5934):537-40)制备抗体(例如单克隆抗体)。在一些实施例中，也可通过重组型方法(参见例如美国专利第4,166,452号)制得抗体(例如单克隆抗体)。
与通过B细胞永生化产生抗体相关的许多困难可通过使用噬菌体呈现在大肠杆菌或酵母中工程改造及表达构建体组分来解决。为了确保回收高亲和力抗体，组合型免疫球蛋白文库必须通常含有较大谱系尺寸。典型策略利用由经免疫的小鼠的淋巴细胞或脾细胞获得的mRNA，以使用逆转录酶合成cDNA。重链及轻链基因单独地通过PCR扩增并且连接到噬菌体克隆载体中。可产生两个不同的文库，一个含有重链基因并且一个含有轻链基因。文库可为初始的或其可为半合成的，即其中所有氨基酸(除半胱氨酸以外)皆同样可能存在于CDR中的任何既定位置处。从各文库分离噬菌体DNA，并将重链及轻链序列连接在一起并封装以形成组合型文库。各噬菌体含有一对随机重链及轻链cDNA，并在感染大肠杆菌后引导受感染的细胞中抗体CD22构建体中的多肽的表达。为了鉴别识别相关抗原(例如CD22)的构建体，涂铺噬菌体文库，并将斑块中的构建体分子转移到过滤器中。将过滤器与经放射性标记的抗原一起培育并接着洗涤以去除过量的未结合的配体。自动放射摄影上的放射性斑点鉴别含有结合抗原的构建体的斑块。或者，鉴别识别相关抗原(例如CD22)的构建体可通过使噬菌体反复结合于与固体载体(例如珠粒或哺乳动物细胞)结合的抗原，接着去除未结合的噬菌体并通过洗脱特异性结合的噬菌体来实现。在此类实施例中，首先使抗原生物素化以固定到例如抗生蛋白链菌素结合的Dynabeads M-280。将噬菌体文库与细胞、珠粒或其它固体载体一起培育并通过洗涤来去除未结合的噬菌体。选择结合相关抗原的构建体噬菌体克隆且测试以用于进一步表征。
在选择之后，通过间接流式细胞测量术测试阳性克隆与表达于活细胞表面上的相关抗原的结合。简单地说，将噬菌体克隆与表达或不表达抗原的细胞(例如经工程改造以表达相关抗原，或天然表达抗原的细胞)一起培育。可洗涤细胞并接着用小鼠抗M13鞘蛋白单克隆抗体标记。在流式细胞测量术之前，可再洗涤细胞并用荧光结合的二级抗体(例如FITC-山羊(Fab)2抗小鼠IgG)标记。可例如由斯特拉特基因克隆系统(Stratagene CloningSystems)(加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla,CA))获得适用于产生人类免疫球蛋白噬菌体文库的克隆及表达载体。
类似策略可用于获得高亲和力scFv克隆。可通过使用对应于所有已知VH、Vκ及Vλ基因家族的PCR引子从未经免疫的人类供体分离V基因来构建具有大型谱系的文库。在扩增之后，可组合Vκ及Vλ池以形成一个池。这些片段可连接到噬菌粒载体中。可使scFv接头(例如(G4S)n)连接到VL片段上游(或如果需要，VH片段上游)的噬菌粒中。将VH及接头-VL片段(或VL及接头-VH片段)扩增及组装在JH区上。可将所得VH-接头-VL(或VL-接头-VH)片段连接到噬菌粒载体中。如上文所描述，噬菌粒文库可使用过滤器或使用免疫管(Nunc；Maxisorp)淘选。可通过由经免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合型免疫球蛋白文库及通过在巴斯德毕赤酵母中表达scFv构建体来获得类似结果(参见例如里德尔(Ridder)等人,1995,生物技术,13:255-260)。此外，在分离适合的scFv抗体之后，可经由亲和力成熟方法，如突变诱发及链改组获得较高结合亲和力及较慢解离速率(参见例如杰克逊等人,1998,英国癌症杂志(Br.J.Cancer),78:181-188)；奥斯本(Osbourn)等人,1996,免疫技术(Immunotechnology),2:181-196)获得。
可使用各种技术产生人类抗体，即将人类Ig基因引入其中内源性Ig基因已部分或完全不活化的转基因动物中可用于合成人类抗体。在一些实施例中，抗CD22人类抗体可通过对经工程改造以制备对人类CD22的抗原攻击有响应的人类抗体的非人类动物进行免疫接种而制得。
所提供的构建体还可例如通过利用经工程改造以表达构建体编码核酸的宿主细胞系统来产生。或者或另外，所提供的构建体可部分或完全通过化学合成(例如使用自动肽合成器或构建体编码核酸的基因合成)来制备。本文中所描述的构建体可使用任何适合的载体或表达盒表达。所属领域中已知多种载体(例如病毒载体)及表达盒并且可引入此类载体或表达盒的细胞可以所属领域中已知的方式培养(例如使用连续或分批补料培养系统)。在一些实施例中，细胞可经基因工程改造；用于基因工程改造细胞以表达经工程改造的多肽的技术为所属领域中熟知的(参见例如奥苏伯尔(Ausabel)等人编,1990,分子生物学现行规范(Current Protocols in Molecular Biology)(威利,纽约))。
本文中所描述的构建体可经纯化，即使用过滤、离心和/或多种色谱技术，如HPLC或亲和色谱。在一些实施例中，所提供的构建体的片段通过包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过借助于化学还原进行的二硫键的裂解而获得。
应了解，所提供的构建体可以此方式经工程改造、产生和/或纯化，以改进构建体的特征和/或活性。举例来说，经改进的特征尤其包括(但不限于)稳定性增加、结合亲和力和/或亲合力改进、结合特异性增加、产量增加、聚集减少、非特异性结合减少。在一些实施例中，所提供的构建体可包含一个或多个氨基酸取代(例如在免疫球蛋白或其片段(例如scFv抗体)的情形下，在框架区中)，其改进蛋白质稳定性、抗原结合、表达量，或提供用于治疗剂、诊断剂或检测剂的结合的位点或位置。
VI.治疗剂及检测剂
治疗剂或检测剂可连接于本文中所描述的抗CD22构建体。治疗剂可为任何类型的化学实体，包括例如(但不限于)蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、有机小分子、非生物聚合物、金属、离子、放射性同位素等。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂可具有与治疗癌症的一种或多种症状或病因相关的生物活性。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂可以具有与调节免疫系统和/或增强T细胞介导的细胞毒性相关的生物活性。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂具有一种或多种其它活性。
检测剂可包含任何例如由于其特定功能特性和/或化学特征而可使用分析法检测的部分。此类试剂的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和性分子、着色粒子或配体，如生物素。
所属领域中已知多种检测剂及用于其与构建体的连接的系统(参见例如美国专利第5,021,236号；第4,938,948号；及第4,472,509号)。此类检测剂的实例尤其包括顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质、X射线显影剂。举例来说，在一些实施例中，顺磁离子为以下中的一种或多种：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)和/或铋(III)。
放射性同位素可为以下中的一种或多种：锕-225、砹-211、铋-212、碳-14、铬-51、氯-36、钴-57、钴-58、铜-67、铕-152、镓-67、氢-3、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铟-111、铁-59、铅-212、镏-177、磷-32、镭-223、镭-224、铼-186、铼-188、硒-75、硫-35、鎝-99m、钍-227、钇-90及锆-89。经放射性标记的构建体可根据所属领域中熟知的技术产生。
荧光标记尤其可为或可包含以下中的一种或多种：Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(OregonGreen)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或得克萨斯红(Texas Red)。
VII.治疗方法
可向个体(例如哺乳动物，如人类)投与本发明的抗CD22构建体和/或组合物以治疗B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)，如B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。B细胞恶性病还包括各种类型的癌症，如本文中进一步描述。B细胞恶性病的实例包括(但不限于)急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病及零位急性成淋巴细胞性白血病。本发明提供治疗个体中的B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法，其包含向个体投与有效量的包含本文中所描述的抗CD22构建体(例如抗CD22 scFv)的医药组合物，其中抗CD22构建体结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)。
癌症
在一些实施例中，抗CD22构建体及表达抗CD22构建体(包括抗CD22 CAR及抗CD22caTCR)的细胞可适用于治疗B细胞相关癌症。可使用本文中所描述的方法中的任一种治疗的癌症包括未血管化或尚未大体上血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可包含非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病及淋巴瘤)或可包含实体肿瘤。通过本发明的抗CD22构建体及抗CD22 CAR细胞治疗的癌症的类型包括(但不限于)癌瘤、胚细胞瘤、肉瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤及神经胶质瘤，及某些白血病或淋巴恶性病、良性及恶性肿瘤，及恶性病，例如肉瘤、癌瘤、黑素瘤及神经胶质瘤。还包括成年人肿瘤/癌症及儿科肿瘤/癌症。
预期通过本文中所描述的方法中的任一种治疗的实体肿瘤包括CNS肿瘤，如神经胶质瘤(例如脑干神经胶质瘤及混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤(如高级星形细胞瘤)、小儿神经胶质瘤或成胶质细胞瘤(如小儿高级神经胶质瘤(HGG)及扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG))、CNS淋巴瘤、胚细胞瘤、神经管胚细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤及脑转移瘤。
在一些实施例中，B细胞相关癌症为小儿神经胶质瘤。在一些实施例中，小儿神经胶质瘤为低级神经胶质瘤。在一些实施例中，小儿神经胶质瘤为高级神经胶质瘤(HGG)。在一些实施例中，小儿神经胶质瘤为多形性成胶质细胞瘤。在一些实施例中，小儿神经胶质瘤为扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。在一些实施例中，DIPG为II级。在一些实施例中，DIPG为III级。在一些实施例中，DIPG为IV级。
预期治疗的其它实体肿瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤(如透明细胞软骨肉瘤)、成软骨细胞瘤、骨肉瘤及其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰脏癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威耳姆氏肿瘤(Wilms'tumor)、子宫颈癌(例如子宫颈癌瘤及子宫颈前子宫颈发育不良)、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌(例如鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌及纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌、头部癌症(例如鳞状细胞癌)、颈部癌症(例如鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎上皮癌、绒毛膜癌、肉瘤、雷迪格细胞肿瘤(Leydig cell tumor)、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤及脂肪瘤)、膀胱癌、黑素瘤、子宫癌(例如子宫内膜癌)及尿道上皮癌(例如鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、尿管癌及膀胱癌)。
预期通过本文中所描述的方法中的任一种治疗的血液癌包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病及成髓细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性及红白血病)、慢性白血病(如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(顽固性及高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓发育不良综合征、毛细胞白血病及骨髓发育不良。
癌症治疗可例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、进展时间、存活持续时间、无进展存活期、总响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。可使用测定疗法功效的方法，包括例如经由放射成像来测量响应。
在一些实施例中，治疗B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法中使用的抗CD22构建体包含抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3中的一个或多个，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3中的一个或多个。在一些实施例中，抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:206-211的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，治疗B细胞恶性病的方法中使用的抗CD22构建体包含抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。在一些实施例中，抗CD22构建体为全长抗体。在一些实施例中，抗CD22构建体为多特异性抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施例中，抗CD22构建体为CAR或caTCR。在一些实施例中，抗CD22构建体为免疫结合物，其包含上文所描述的抗体部分及效应分子。效应分子可为治疗剂(例如药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽或核酸)或标记。在一些实施例中，治疗剂为药物或毒素。在一些实施例中，组合物进一步包含与抗CD22构建体相关的细胞(如效应细胞)。
在一些实施例中，治疗B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法中使用的抗CD22构建体包含抗体部分，其包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3中的一个或多个，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3中的一个或多个。在一些实施例中，抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:214-216、209、210及217的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，治疗B细胞恶性病的方法中使用的抗CD22构建体包含抗体部分，其包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ IDNO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。在一些实施例中，抗CD22构建体为全长抗体。在一些实施例中，抗CD22构建体为多特异性抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施例中，抗CD22构建体为CAR或caTCR。在一些实施例中，抗CD22构建体为免疫结合物，其包含上文所描述的抗体部分及效应分子。效应分子可为治疗剂(例如药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽或核酸)或标记。在一些实施例中，治疗剂为药物或毒素。在一些实施例中，组合物进一步包含与抗CD22构建体相关的细胞(如效应细胞)。
在用于治疗B细胞恶性病(例如上文所描述的CD22+B细胞恶性病)的方法中的任一种的一些实施例中，抗CD22构建体在投与个体之前与细胞(如免疫细胞，例如T细胞)结合。因此，举例来说，提供一种用于治疗个体中的B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法，其包含a)使本文中所描述的抗CD22构建体或其抗体部分与细胞(如免疫细胞，例如T细胞)结合以形成抗CD22构建体/细胞结合物，及b)向个体投与有效量的包含抗CD22构建体/细胞结合物的组合物。在一些实施例中，细胞来源于个体。在一些实施例中，细胞不来源于个体。在一些实施例中，抗CD22构建体通过共价连接于细胞表面上的分子而与细胞结合。在一些实施例中，抗CD22构建体通过非共价连接于细胞表面上的分子而与细胞结合。在一些实施例中，抗CD22构建体通过将抗CD22构建体的一部分插入细胞的外膜中而与细胞结合。
治疗可例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、进展时间、存活持续时间、无进展存活期、总响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。可使用测定疗法功效的方法，包括例如经由放射成像来测量响应。
在一些实施例中，可以肿瘤生长抑制百分比(％TGI)形式测量治疗功效，其可使用方程式100-(T/C×100)计算，其中T为经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且C为未经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在一些实施例中，％TGI为约2％、约4％、约6％、约8％、10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或超过95％。
VIII.抗CD22构建体效应细胞疗法
本申请还提供在B细胞恶性病中使用抗CD22构建体(如抗CD22 CAR、抗CD22caTCR或抗CD22 CSR)再引导效应细胞(如原代T细胞)针对CD22+细胞的特异性的方法。因此，本发明还提供一种在哺乳动物中刺激效应细胞介导的针对包含CD22+细胞的靶细胞群或组织的响应(如T细胞介导的免疫响应)的方法，其包含向哺乳动物投与表达抗CD22 CAR或抗CD22caTCR的效应细胞(如T细胞)的步骤。在一些实施例中，“刺激”免疫细胞指代引发效应细胞介导的响应(如T细胞介导的免疫响应)，其与活化免疫细胞不同。在一些实施例中，抗CD22CSR可刺激免疫细胞(例如T细胞)，但不活化免疫细胞。
可将表达抗CD22构建体的抗CD22构建体效应细胞(如抗CD22 CAR T细胞或抗CD22caTCR T细胞)输注到有需要的受体中。所输注的细胞能够杀灭受体中的CD22+细胞。在一些实施例中，与抗体疗法不同，抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)能够体内复制，产生可引起持续肿瘤控制的长期持久性。
在一些实施例中，抗CD22构建体效应细胞为抗CD22 CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞，其可经历稳定的体内T细胞扩增并且可保持延长的时间量。在一些实施例中，本发明的抗CD22 CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞发展为特异性记忆T细胞，其可经再活化以抑制任何其它肿瘤形成或生长。
本发明的抗CD22构建体T细胞(如抗CD22 CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞)还可充当一种用于离体免疫接种和/或哺乳动物中的体内疗法的疫苗。在一些实施例中，哺乳动物为人类。
关于离体免疫接种，在向哺乳动物投与细胞之前体外进行以下中的至少一种：i)扩增细胞，ii)将编码抗CD22 CAR或抗CD22 caTCR的核酸引入细胞，和/或iii)低温保存细胞。离体程序为所属领域中熟知的。简单地说，从哺乳动物(优选人类)分离细胞并用本文中所公开的表达抗CD22 CAR或抗CD22 caTCR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。可向哺乳动物受体投与抗CD22 CAR细胞或抗CD22 caTCR细胞以提供治疗效益。哺乳动物受体可为人类并且抗CD22 CAR或抗CD22 caTCR细胞对于受体可为自体的。或者，细胞对于受体可为同种异体、同基因型或异种的。用于离体扩增造血干细胞及祖细胞的程序描述于以引用的方式并入本文中的美国专利第5,199,942号中，并且可应用于本发明的细胞。其它适合的方法为所属领域中已知的，因此本发明不限于任何特定离体扩增细胞的方法。简单地说，离体培养及扩增T细胞包含：(1)从外周血液单核细胞(PBMC)收集T细胞；及(2)离体扩增此类细胞。除美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子以外，如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配体的其它因子可用于培养及扩增细胞。
除在离体免疫接种方面使用基于细胞的疫苗以外，本发明还提供用于体内免疫接种以在患者中引发针对抗原的免疫响应的组合物及方法。本发明的抗CD22构建体效应细胞(如抗CD22 CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞)可单独投与，或以医药组合物形式与稀释剂和/或其它组分(如IL-2或其它细胞介素或细胞群体)组合投与。简单地说，本发明的医药组合物可包含抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)与一种或多种医药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲生理食盐水、磷酸盐缓冲生理食盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；及防腐剂。在一些实施例中，抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物经调配以通过静脉内、鞘内、颅内、脑内或脑室内途径投药。
所投与的本发明的抗CD22构建体效应细胞(如抗CD22 CAR T细胞或抗CD22caTCRT细胞)组合物的精确量可由医师考虑患者(个体)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移程度及病状的个别差异而决定。在一些实施例中，包含抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)的医药组合物以约104至约109个细胞/千克体重的剂量投与，如约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108或约108至约109个细胞/千克体重中的任一个，包括所述范围内的所有整数值。抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物也可以这些剂量投与多次。细胞可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术投与(参见例如罗森伯格(Rosenberg)等人,新英格兰医学杂志319:1676,1988)。特定患者的最佳剂量及治疗方案可由熟习医药技术者通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗而容易地确定。
在一些实施例中，可能需要向个体投与经活化的抗CD22构建体T细胞(如抗CD22CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞)并随后再抽取血液(或进行单采血液成分术)、根据本发明由其活化T细胞并通过这些经活化及扩增的T细胞向患者再输注。此过程可每几周进行多次。在一些实施例中，T细胞可由10cc至400cc的抽血活化。在一些实施例中，T细胞由20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血活化。
抗CD22构建体效应细胞(如抗CD22 CAR T细胞或抗CD22 caTCR T细胞)的投药可以任何便利的方式进行，包括通过注射、摄入、输注、植入或移植来进行。本文中所描述的组合物可皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、鞘内、颅内、脑内、脑室内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过皮内或皮下注射向患者投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过静脉内注射投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过鞘内注射投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过颅内注射投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过脑内注射投与。在一些实施例中，本发明的抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)组合物通过脑室内注射投与。抗CD22构建体效应细胞(如T细胞)的组合物可直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点中。
因此，举例来说，在一些实施例中，提供一种治疗个体中的B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法，其包含向个体投与有效量的组合物，其包含表达抗CD22 CAR的效应细胞(如T细胞)，所述抗CD22 CAR包含a)胞外结构域，其包含本文中所描述的抗CD22构建体或其抗体部分，其特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)，b)跨膜结构域，及c)胞内信号传导结构域，其包含CD3ζ胞内信号传导序列及CD28和/或4-1BB胞内信号传导序列。在一些实施例中，抗CD22抗体部分包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3中的一个或多个，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3中的一个或多个。在一些实施例中，抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:206-211的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，抗CD22抗体部分包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。
因此，举例来说，在一些实施例中，提供一种治疗个体中的B细胞恶性病(例如CD22+B细胞恶性病)的方法，其包含向个体投与有效量的组合物，其包含表达抗CD22 CAR的效应细胞(如T细胞)，所述抗CD22 CAR包含a)胞外结构域，其包含抗CD22抗体部分，其特异性结合于CD22的胞外区域或其一部分(例如SEQ ID NO:205或其一部分)，b)跨膜结构域，及c)胞内信号传导结构域，其包含CD3ζ胞内信号传导序列及CD28和/或4-1BB胞内信号传导序列。在一些实施例中，抗CD22抗体部分包含i)轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3中的一个或多个，及ii)重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3中的一个或多个。在一些实施例中，抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:214-216、209、210及217的序列的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。在其它实施例中，抗CD22体部分包含i)轻链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及与SEQID NO:218的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，及ii)重链可变区，其具有分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％(例如至少92％、94％、96％、98％或99％)一致性的序列，其中轻链可变区及重链可变区经由接头彼此接合。
IX.使用抗CD22构建体诊断及成像的方法
经标记的抗CD22抗体部分以及其衍生物及类似物，其特异性结合于细胞表面上的CD22，可用于诊断目的，以检测、诊断或监测B细胞恶性病(例如B细胞相关癌症或CD22+B细胞恶性病)。举例来说，本发明的抗CD22抗体部分可用于原位、体内、离体及体外诊断分析或成像分析中。
本发明的其它实施例包括诊断个体(例如哺乳动物，如人类)中的B细胞恶性病(例如B细胞相关癌症或CD22+B细胞恶性病)的方法。所述方法包含检测个体中的CD22呈现细胞。在一些实施例中，B细胞恶性病为B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一些实施例中，提供一种诊断个体(例如哺乳动物，如人类)中的B细胞恶性病(例如B细胞相关癌症或CD22+B细胞恶性病)的方法，其包含(a)向个体投与有效量的根据上文所描述的实施例中的任一个的经标记的抗CD22抗体部分；及(b)测定个体中的标记含量，使得高于阈值量的标记含量指示个体患有B细胞恶性病。阈值量可通过各种方法测定，包括例如通过根据上文所述的诊断方法在患有B细胞恶性病的第一组个体及不患有B细胞恶性病的第二组个体中检测标记，及将阈值设定成可区分第一组与第二组的含量。在一些实施例中，阈值量为零，并且所述方法包含测定个体中存在或不存在标记。在一些实施例中，所述方法进一步包含在步骤(a)的投药之后等待一段时间，以允许经标记的抗CD22抗体部分优先在个体中表达CD22的位点处聚集(及用于清除未结合的经标记的抗CD22抗体部分)。在一些实施例中，所述方法进一步包含减去标记的背景含量。背景含量可通过各种方法测定，包括例如通过检测在投与经标记的抗CD22抗体部分之前个体中的标记，或通过在未患有B细胞恶性病的个体中根据上文所描述的诊断方法检测标记。
本发明的抗CD22抗体部分可用于使用所属领域的普通技术人员已知的方法分析生物样品中的CD22呈现细胞的含量。适合的抗体标记为所属领域中已知并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、鎝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、钐(153Sm)、镏(177Lu)、钆(159Gd)、钷(149Pm)、镧(140La)、镱(175Yb)、钬(166Ho)、钇(90Y)、钪(47Sc)、铼(186Re、188Re)、镨(142Pr)、铑(105Rh)及钌(97Ru)；鲁米诺(luminol)；荧光标记，如荧光素及罗丹明；及生物素。
所属领域中已知的技术可应用于本发明的经标记的抗CD22抗体部分。此类技术包括(但不限于)使用双功能结合剂(参见例如美国专利第5,756,065号；第5,714,631号；第5,696,239号；第5,652,361号；第5,505,931号；第5,489,425号；第5,435,990号；第5,428,139号；第5,342,604号；第5,274,119号；第4,994,560号；及第5,808,003号)。除上述分析法以外，熟练的从业者可使用各种体内及离体分析法。举例来说，可使个体体内的细胞暴露于任选地经可检测标记，例如放射性同位素标记的抗CD22抗体部分，并且可例如通过外部放射性扫描或通过分析来源于先前暴露于抗CD22抗体部分的个体的样品(例如活检或其它生物样品)来评估抗CD22抗体部分与细胞的结合。
X.医药组合物
本文中还提供包含本文中所描述的抗CD22构建体的组合物(如医药组合物，在本文中也称为调配物)、编码本文中所描述的抗CD22构建体中所含的一种或多种多肽的核酸、包含所述核酸的表达盒或表达抗CD22构建体的宿主细胞。在一些实施例中，组合物进一步包含与抗CD22构建体相关的细胞(如效应细胞，例如T细胞)。在一些实施例中，提供一种包含抗CD22构建体及药学上可接受的载剂的医药组合物。在一些实施例中，医药组合物进一步包含与抗CD22构建体相关的细胞(如效应细胞，例如T细胞)。
抗CD22构建体的适合的调配物通过将具有所需纯度的抗CD22构建体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)第16版,奥索A.(Osol,A.)编(1980))以冻干调配物或水性溶液形式混合而获得。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对受体无毒性并且包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；丁基苯酚或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子性表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性调配物描述于WO98/56418中，其以引用的方式明确并入本文中。适用于皮下投药的冻干调配物描述于WO97/04801中。此类冻干调配物可通过适合的稀释剂复原到高蛋白质浓度并且经复原的调配物可皮下投与本文中的所治疗的个体。脂质体(Lipofectin/liposome)可用于将本发明的抗CD22抗体递送到细胞中。
本文中的调配物还可含有除抗CD22构建体以外的一种或多种活性化合物(视所治疗的特定适应症的需要)，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的活性化合物。举例来说，除抗CD22构建体以外，可能需要进一步提供抗赘生剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。此类分子宜以有效实现既定目的的量的组合存在。此类其它药剂的有效量视存在于调配物中的抗CD22构建体的量、疾病或病症或治疗的类型及如上文所论述的其它因素而定。这些药剂通常以如本文中所描述的相同剂量及投药途径或迄今使用的剂量的约1至99％使用。
在胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)或巨乳液中，抗CD22构建体还可例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合包埋于所制备的微胶囊中，例如的羟基甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于雷明顿氏药物科学第16版,奥索A.编(1980)中。可制备持续释放型制剂。
可制备抗CD22构建体的持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合的实例包括含有构建体(或其片段)的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如膜或微胶囊。持续释放型基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸的聚合物允许持续释放分子超过100天，但某些水凝胶持续释放蛋白质的时间段较短。当所囊封的构建体长时间留存于体内时，其可由于在37℃下暴露于水分而变性或聚集，引起生物活性损失及可能的免疫原性变化。取决于所涉及的机制，可设计使抗CD22构建体稳定的合理策略。举例来说，如果发现聚集机制经由硫基-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么稳定化可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适合的添加剂及开发特定聚合物基质组合物来实现。
在一些实施例中，在包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、丁二酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween 80)或前述的任何组合的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含约10mM至约50mM丁二酸盐的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在具有约5.1与5.6之间的pH值的缓冲液中调配抗CD22构建体。在一些实施例中，在包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中调配抗CD22构建体，其中调配物的pH值为5.5。
用于体内投药的调配物必须为无菌的。此可通过例如无菌过滤膜过滤来容易地实现。
XI.剂量及投药
向个体(如人类)投与的抗CD22构建体组合物的剂量可视特定组合物、投药模式及治疗的疾病的类型而变化。在一些实施例中，抗CD22构建体组合物的量足以引起个体中的完全响应。在一些实施例中，抗CD22构建体组合物的量足以引起个体中的部分响应。在一些实施例中，所投与的抗CD22构建体组合物的量(例如在单独投与时)足以在用抗CD22构建体组合物治疗的个体群体中产生大于约2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中的任一个的总响应率。可例如基于肿瘤生长抑制百分比(％TGI)测定个体对本文中所描述的方法的治疗的响应。
在一些实施例中，组合物的量足以延长个体的总存活期。在一些实施例中，组合物的量(例如，当单独投与时)足以在用抗CD22构建体组合物治疗的个体群体中产生超过约2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或77％中的任一个的临床效益。
在一些实施例中，组合物的量为足以满足以下条件的量：与同一名个体在治疗之前的对应肿瘤尺寸、癌细胞数目或肿瘤生长率比较或与未接受治疗的其它个体中的对应活性相比，使肿瘤尺寸减小、癌细胞(例如CD22+细胞)数目减少或肿瘤生长率降低达到少约2％、4％、6％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个。标准方法可用于测量此作用的量级，如使用纯化酶的体外分析法、基于细胞的分析法、动物模型或人类测试。
一些实施例中，组合物中的抗CD22构建体的量为在向个体投与医药组合物时低于诱发毒理学作用(即，超过临床上可接受的毒性水平的作用)的量或其中可控制或耐受潜在副作用的量。在一些实施例中，组合物的量近似于遵循相同给药方案的组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施例中，组合物的量大于MTD的约80％、90％、95％或98％中的任一个。在一些实施例中，组合物中包括约0.001μg至约1000μg范围内的量的抗CD22构建体。在以上方面中的任一个的一些实施例中，组合物中的抗CD22构建体的有效量在每千克总体重约0.1μg至约100mg范围内。
抗CD22构建体组合物可经由各种途径，包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、经口、经鼻、吸入、囊泡内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、颅内、脑内、脑室内、经粘膜及经皮向个体(如人类)投与。在一些实施例中，可使用组合物的持续连续释放型调配物。在一些实施例中，静脉内投与组合物。在一些实施例中，动脉内投与组合物。在一些实施例中，腹膜内投与组合物。在一些实施例中，鞘内投与组合物。在一些实施例中，颅内投与组合物。在一些实施例中，脑内投与组合物。在一些实施例中，脑室内投与组合物。在一些实施例中，经鼻投与组合物。
实例
实例1-产生及选择人类抗CD22构建体
此实例说明对人类CD22具有特异性的人类构建体的产生。确切地说，此实例说明特异性结合原生形式的人类CD22的人类单链可变片段(scFv)的产生。本文中所描述的人类构建体使用由正常供体和/或患病供体产生的初始或半合成人类噬菌体文库产生，并经由对呈原生构形的细胞表面表达的人类CD22进行淘选，基于对CD22的高特异性而选择。因此，此类人类构建体可尤其充当全长IgG、多特异性抗体及嵌合抗原受体(其可以其它方式从在自然界中发现的谱系删除)的有价值的构建源。
简单地说用于产生抗人类CD22构建体的示例性概述阐述于表2中。所述方法以从
Figure BDA0002777825040000962
噬菌体文库鉴别人类CD22特异性及生物活性构建体开始。在优瑞科生物技术公司(Eureka Therapeutics)构建的名为
Figure BDA0002777825040000963
噬菌体文库的人类scFv抗体噬菌体呈现文库的集合(分集＝10×1010)用于选择对人类CD22具有特异性的人类构建体。
Figure BDA0002777825040000964
噬菌体文库包括由完全初始人类重链及轻链谱系组成的初始文库，及含有完全初始人类轻链谱系及具有完全随机分布的重链CDR3区的半合成重链的半合成文库。由健康供体的PBMC及脾或由患病供体的PBMC克隆初始抗体谱系。scFv文库用于针对人类CD22阳性细胞(包括拉吉(天然表达CD22的淋巴瘤细胞系)、表达全长CD22的杰卡特细胞及表达CD22的结构域5-7的杰卡特细胞)的淘选。使用APC小鼠抗人类CD22抗体(Biolegend，目录号363505)，其仅结合于全长CD22，通过抗CD22染色来确认杰卡特细胞中全长CD22的表达，如图1A-1E中。CD22的结构域5-7与绿色荧光蛋白(GFP)结合并通过FITC信号确认其在杰卡特细胞中的表达。使用无CD22表达的杰卡特细胞作为阴性对照。关于细胞淘选，首先使表达全长CD22或CD22的结构域5-7的杰卡特细胞或拉吉细胞与人类scFv噬菌体文库混合。在用PBS延长洗涤之后，快速离心具有结合的scFv抗体噬菌体的细胞。结合的克隆接着经洗脱并且用于感染大肠杆菌XL1-Blue细胞。噬菌体克隆在细菌中表达及纯化。进行三至四轮淘选以富集特异性结合人类CD22的胞外区域的scFv噬菌体克隆。
表2
Figure BDA0002777825040000961
Figure BDA0002777825040000971
直接测试通过细胞淘选所选择的噬菌体克隆的细胞表面人类CD22结合。在通过噬菌体呈现筛检的1080个克隆中，2个克隆鉴别为细胞表面CD22结合克隆，如通过流式细胞测量术确认。如图2A及2B中所示，克隆1及2显示与表达全长CD22或CD22的结构域5-7的CD22+拉吉细胞及杰卡特细胞的特异性结合。此外，克隆1及2还显示与NALM-6细胞(天然表达CD22的白血病细胞系)的特异性结合，如图3A及3B中所示。
实例2-表达抗人类CD22嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)的表征
此实例描述使用抗人类CD22抗体构建嵌合抗原受体(CAR)。确切地说，此实例特定描述CAR的构建，所述CAR包括抗CD22抗体的抗原结合位点并且表达于T细胞表面上。此外，由T细胞表达的CAR用于针对人类淋巴瘤细胞系的细胞毒性分析法中。因此，本实例说明，在一些实施例中，使用包括来自本文中所描述的人类抗CD22抗体的抗原结合位点的CAR适用于杀灭表达人类CD22的靶细胞(例如淋巴瘤)。
经人类CD22转导的T细胞的体外细胞毒性。通过用CAR载体转染293T细胞来产生含有人类CD22特异性嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒。在一些实施例中，人类T细胞用于在用CD3/CD28珠粒(
Figure BDA0002777825040000972
英杰(Invitrogen))刺激一天之后，在100U/mL的IL-2存在下进行转导。将浓缩慢病毒施用于含T细胞的经Retronectin(宝生物技术(Takara))涂布的6孔板保持72小时。使用LDH细胞毒性分析法进行经转导的T细胞(CD22/CAR-T细胞)的功能评估。
此外，在类似实验中，使用大型CD22阳性及阴性癌细胞系板测试人类CD22 CAR-T(上文所描述)。简单地说，用所选择的编码抗CD22抗体的CAR模拟转导(模拟物)或转导原代T细胞。使用抗体通过FACS分析经转导的T细胞以检测CAR构建体的胞外结构域中的标签(例如myc标签)。
在另一实验中，测定经活化的人类CD22 CAR-T细胞的细胞介素释放概况及靶细胞溶解。经模拟转导的T细胞(模拟物)或所选择的抗CD22 CAR-T与靶细胞(图4A：K562、K562+CD22及K562+M18+CD22；图4B：ASPC1、杰卡特、IM9、MCF7、HepG2、海拉、SK-Hep1及SKOV3；图4C：K562、K562+CD22、LnCap、Colo205及NALM6；图5A：K562及K562+CD22；图5B：ASPC1、杰卡特、IM9、MCF7、HepG2、海拉、SK-Hep1及SKOV3)以2:1比率一起共同培育16小时。使用BioPlex200系统(Bio-Rad)及Bio-plex Pro Human Cytokine 8-plex分析法(伯乐(BioRad))测量在体外杀灭之后释放于培养基中的IFN-γ。在减去从培养基、单独的靶细胞及单独的经克隆转导的T细胞的释放之后，使用已知标准曲线测定细胞介素浓度。IFN-γ释放分析法的结果展示于图4A、4B及4C中，其说明抗CD22 CAR(克隆2)显示针对CD22+靶细胞的特异性及强效IFN-γ释放。图5A及5B进一步证实抗CD22 CAR(克隆2)显示针对K562+CD22靶细胞的特异性杀灭，并且不杀灭K562细胞。图5A还证实与m971 CAR细胞(m971为标靶CD22的近膜区域的抗体)相比，抗CD22 CAR(克隆2)显示优良的杀灭活性。
实例3-竞争分析法
进行流式细胞测量术竞争分析法以测定m971是否与抗CD22 CAR(克隆2)竞争。m971为标靶CD22的近膜区域的抗体。靶细胞K562+CD22与阻断抗体(m971或抗CD22CAR(克隆1))一起在10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL及0.001μg/mL下预培育30分钟。在预培育之后，1μg/mL的检测抗体(与生物素结合的抗CD22 CAR(克隆2))在不洗涤的情况下直接添加到样品中并再培育30分钟。在阻断之后，使用FACS进行检测及分析。由MFI(平均荧光强度)测定结合百分比并且样品针对同型对照物归一化。图6展示m971不与抗CD22 CAR(克隆2)竞争，其结合于不同的表位。图6还展示抗CD22 CAR(克隆2)及抗CD22 CAR(克隆1)彼此竞争，表明其可能结合相同的表位或重迭表位。抗CD22 CAR(克隆1)的亲和力似乎高于抗CD22 CAR(克隆2)，其亲和力似乎高于m971。
实例4-使用人类抗CD22抗体产生双特异性构建体
此实例描述使用对人类CD22具有特异性的人类scFv构建多特异性抗体。确切地说，此实例特定描述双特异性抗体的构建，所述双特异性抗体具有结合呈原生格式(细胞表面表达)的人类CD22的第一抗原结合位点及第二抗原结合位点。在一些实施例中，第二抗原结合位点为表达于T细胞上的蛋白质(例如T细胞上的CD3)。因此，本实例说明，在一些实施例中，使用含有如本文中所描述的抗CD22抗体部分的多特异性抗体，可引导T细胞杀灭表达人类CD22的靶细胞。
使用人类CD22特异性噬菌体克隆(例如克隆1及2)的scFv序列产生双特异性抗体。使用单链格式构建双特异性抗体，所述单链格式包含N端处的人类CD22特异性噬菌体克隆的VL-VH scFv序列及C端处的抗人类CD3ε单克隆scFv(例如参见布瑞斯文(Brischwein)等人,分子免疫学43:1129,2006)。使用标准重组型DNA技术合成编码人类CD22 scFv及抗人类CD3εscFv的DNA片段并亚克隆到哺乳动物表达载体(例如pQD-T(优瑞科生物技术公司))中。在C端插入六组胺标签以用于纯化及检测。哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)用双特异性抗体表达载体转染并培养以用于双特异性抗体产生。可接着使用例如HisTrap HP管柱从细胞上清液纯化双特异性抗体。使细胞培养物澄清并在低咪唑浓度(例如20mM)下装载于管柱上，并接着使用等度高咪唑浓度洗脱缓冲液(例如500mM)洗脱结合的双特异性抗体。通过凝胶电泳在非还原条件下测量经纯化的人类CD22双特异性抗体的分子量。
实例5-人类CD22双特异性抗体的表征
此实例描述双特异性抗体的结合概况的表征。
与重组型人类CD22 ECD-Fc融合蛋白质的结合。测试鉴别为细胞表面人类CD22的特异性结合子的噬菌体克隆(例如克隆1及2)与溶液中重组型人类CD22 ECD-Fc融合蛋白质的结合。在一些实施例中，将生物素化人类CD22 ECD-Fc融合蛋白质装载于抗生蛋白链菌素生物传感器上。在洗去过量的抗原之后，在PBS缓冲液中测试双特异性抗体的结合及解离。
与原代人类B细胞的结合。通过例如用PerCP结合的抗人类CD20抗体、标靶第二抗原结合位点的抗体(例如APC标记的抗人类CD3抗体)及抗CD22双特异性抗体对人类PBMC进行共同染色来测试人类B细胞的抗CD22抗体结合。在用PBS缓冲液进行一轮简单洗涤之后，向混合物中添加FITC标记的抗His标签抗体作为二级抗体以检测双特异性抗体。关于流式细胞测量术分析法，通过阳性CD20染色及阴性CD3染色门控人类B细胞。评估抗CD22双特异性抗体识别表达于这些CD20+CD3-细胞上的人类CD22的能力。
T细胞杀灭分析法。使用例如LDH细胞毒性分析法(普洛麦格(Promega))分析肿瘤细胞毒性。用例如CD3/CD28 Dynabeads(英杰)活化及扩增人类T细胞(澳赛尔斯(AllCells))或来自全血的菲科尔纯化细胞(Ficoll-purified cells)(太平洋血液中心(Blood Centers of the Pacific))。在例如具有10％FBS加100U/mL IL-2的RPMI1640培养基中培养及维持经活化的T细胞。在活化后的数天(例如7-14天)之后使用经活化的T细胞。使用FACS分析确认T细胞活化。经活化的T细胞及靶细胞以5:1比率与双特异性抗体一起共同培养。通过测量培养物上清液中的LDH活性来测定细胞毒性。
实例6-抗人类CD22抗体的亲和力成熟
此实例描述抗人类CD22抗体的亲和力成熟。确切地说，通过将随机突变并入所选择的抗人类CD22抗体(克隆1及2)中，接着筛检及表征抗体变异体来进行一系列抗体变异体的产生。
产生变异型噬菌体文库。使用例如GeneMorph II随机突变诱发试剂盒(安捷伦科技(Agilent Technologies))，使编码抗人类CD22 scFv的DNA经历随机突变诱发。在突变诱发之后，将DNA序列克隆到表达scFv的噬菌粒载体中以构建变异型抗体噬菌体文库。分别构建各抗人类CD22特异性克隆的突变文库。针对与各别亲本克隆相比增强的与细胞表面人类CD22的结合测试来自经富集的噬菌体淘选池的个别噬菌体(例如变异体克隆)。此外，进行竞争细胞结合分析法以比较变异体克隆的结合亲和力与亲本克隆的结合亲和力。
实例7-产生及表征基于抗人类CD22变异体克隆的双特异性抗体
此实例描述使用对人类CD22具有特异性的变异型人类scFv构建多特异性抗体。确切地说，此实例特定描述双特异性抗体的构建，所述双特异性抗体具有结合呈初始格式(细胞表面表达)的人类CD22的第一抗原结合位点及第二抗原结合位点。在一些实施例中，第二抗原结合位点可结合T细胞上的CD3。因此，本实例说明，在一些实施例中，使用含有如本文中所描述的抗体部分的多特异性抗体，可引导T细胞杀灭表达人类CD22的靶细胞。
产生变异体克隆双特异性抗体。如实例2中所描述产生来源于亲和力改进的变异型抗体克隆的双特异性抗体。
变异型双特异性抗体的结合亲和力测定。使用例如人类CD22+癌细胞，经由抗体滴定流式细胞测量术测定变异体克隆相比于亲本抗体的相对结合亲和力。在连续稀释浓度下，将双特异性抗体克隆与拉吉细胞混合。基于流式细胞测量术结合信号计算抗体EC50及表观KD。
T细胞杀灭分析法。使用例如LDH细胞毒性分析法(普洛麦格)测定肿瘤细胞毒性。用例如CD3/CD28 Dynabeads(英杰)活化及扩增人类T细胞。在例如具有10％FBS加100U/mLIL-2的RPMI1640培养基中培养及维持经活化的T细胞。在活化后的数天(例如7-14天)使用经活化的T细胞。使用FACS分析确认T细胞活化。经活化的T细胞及靶细胞以5:1比率与双特异性抗体一起共同培养。通过测量培养物上清液中的LDH活性来测定细胞毒性。
实例8-表达抗人类CD22嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)的表征
在另一类似实验中，使用一组如上文所描述的CD22阳性及阴性癌细胞系，测试由所选择的本文中所描述的人类抗体及非人类(例如鼠类)抗体产生的CAR-T。简单地说，用所选择的本文中所描述的编码抗人类CD22 scFv的CAR(例如克隆1或克隆2)或编码具有来自抗人类CD22鼠类抗体的可变区序列的抗人类CD22 scFv的CAR模拟转导(模拟物)或转导原代T细胞。如上文所描述，通过FAC分析经转导的T细胞。
CD22 CAR-T细胞在人类淋巴瘤异种移植物中的体内功效。在NOD SCIDγ(NSG)小鼠中测试示例性CAR-T细胞在CD22+人类淋巴瘤异种移植模型中的体内抗肿瘤活性。在用编码萤火虫荧光素酶(luc)及绿色荧光蛋白的双重报告基因稳定转染(其产生能够体内使用生物发光成像跟踪的细胞)之后，由CD22+伯基特淋巴瘤细胞系(拉吉)获得细胞系拉吉-luc-GFP。NSG小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(美国缅因州巴尔港，04609(Bar Harbor,ME USA 04609))。使拉吉-luc-GFP细胞再悬浮于PBS中并经由尾部静脉以1×106个细胞/100微升/小鼠静脉内(i.v.)植入NSG小鼠中。在植入后五天，使用Xenogen IVIS成像系统将动物成像以评估肿瘤负荷。将小鼠随机分成三个组：(i)未处理，(ii)模拟物(来自相同的CAR-T细胞的供体的未经转导的经活化的人类T细胞)，及(iii)克隆CAR-T。在随机分组之后，立即用模拟物或克隆CAR-T细胞以例如107个T细胞/小鼠(对于第(iii)组，每剂量包含6-8×106个CAR+T细胞)的剂量静脉内处理动物，每两周一次持续3次给药。在给药之后密切监测动物。每周采集一次使用Xenogen IVIS系统的生物发光成像。处死满足以下条件的动物并记录为“条件性死亡”：(i)体重损失超过25％初始体重及(ii)影响小鼠运动的四肢麻痹。
在肿瘤植入之后，通过静脉内植入拉吉淋巴瘤细胞来再攻击来自经抗CD22 CAR克隆转导的T细胞处理组的小鼠，以测定经抗CD22-CAR转导的T细胞是否将保持及维持对抗原(CD22)起反应的能力。在注射经模拟转导的T细胞之后一天，将拉吉淋巴瘤细胞植入未处理NSG小鼠(即，未植入拉吉淋巴瘤细胞或未预先用T细胞处理的小鼠)作为对照。此类经模拟转导的T细胞将模拟在植入拉吉淋巴瘤细胞之前，小鼠中的低循环T细胞含量的条件。通过荧光素酶活性测量各组中的肿瘤负荷。
在另一类似实验中，在NSG小鼠(NALM)中测试示例性CAR-T细胞在CD22+人类白血病异种移植模型中的体内抗肿瘤活性。在用编码萤火虫荧光素酶(luc)及绿色荧光蛋白(GFP)的双重报告基因稳定转染(产生可体内使用生物发光成像跟踪的细胞)之后，由CD22+急性成淋巴细胞性白血病细胞系NALM-6获得NALM-6-luc-GFP细胞。
简单地说，在RPMI培养基+10％FBS中，在37℃下，在潮湿气氛及5％CO2中培养NALM-6-luc-GFP。NSG小鼠购自杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港，04609)并使其在实验之前适应。使NALM-6-luc-GFP细胞再悬浮于磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中，并经由尾部静脉注射以例如5×105个细胞/100微升/小鼠静脉内(i.v.)植入雌性NSG小鼠中。在植入之后，使用Xenogen IVIS成像系统将动物成像以用于肿瘤负荷评估。将NSG小鼠随机分成三个组：(i)媒剂(PBS)；(ii)经模拟转导的人类T细胞；及(iii)克隆经抗CD22CAR转导的T细胞。在如上文所描述植入及投与T细胞或媒剂之后密切监测动物。
实例9-产生及表征表达单特异性抗人类CD22嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)的T细胞
此实例描述表达各种单特异性caTCR构建体的T细胞的产生及表征，所述构建体包含本文中所描述的抗人类CD22 Fab。一些caTCR构建体包含本文中所描述的抗CD22Fab及抗CD22 scFv。一些caTCR-T细胞也表达嵌合信号传导受体(CSR)。
产生表达抗人类CD22-caTCR的T细胞。简单地说，用所选择的编码caTCR的核酸仿真转导(模拟物)或转导原代T细胞。确切地说，产生编码以下caTCR构建体或caTCR+CSR构建体组合的核酸并用于转导中：
构建体组合1(SEQ ID NO:1)：抗CD19-caTCR+抗CD19-CSR
构建体2(SEQ ID NO:2)：抗CD22-caTCR
构建体组合3(SEQ ID NO:3)：抗CD22-caTCR+抗CD19-CSR
构建体4(SEQ ID NO:4)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR(也称为二价单特异性抗CD22-caTCR)
构建体组合5(SEQ ID NO:5)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD19-CSR
构建体组合6(SEQ ID NO:6)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR。
在构建体组合1、3、5及6中，CSR包含经截短的CD28(SEQ ID NO:157)，其包含CD28跨膜区序列及胞内信号传导序列。
此外，产生编码以下构建体组合的核酸并转导于原代T细胞中：
构建体组合7(SEQ ID NO:7)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有CD8TM序列及4-1BB IC信号传导序列(SEQ ID NO:173)
构建体组合8(SEQ ID NO:8)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有经截短的4-1BB(SEQ ID NO:159)
构建体组合9(SEQ ID NO:9)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有CD8TM序列及CD27 IC信号传导序列(SEQ ID NO:167)
构建体组合10(SEQ ID NO:10)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有经截短的CD27(SEQ ID NO:161)
构建体组合11(SEQ ID NO:11)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有CD8 TM序列及CD30 IC信号传导序列(SEQ ID NO:169)
构建体组合12(SEQ ID NO:12)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有经截短的CD30(SEQ ID NO:163)
构建体组合13(SEQ ID NO:13)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有CD8 TM序列及OX40 IC信号传导序列(SEQ ID NO:171)
构建体组合14(SEQ ID NO:14)：抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD22-CSR，具有经截短的OX40(SEQ ID NO:165)。
此外，还产生编码构建体组合5-14(SEQ ID NO:5-14)，但其中去除myc标签(SEQID NO:194)的核酸并转导于原代T细胞中。
在此实例中所公开的构建体及构建体组合中，各CSR及经共表达的caTCR最初翻译成单一多肽，并接着裂解成单独的多肽。在其它实施例中，可以在相同核酸上编码或甚至在不同核酸上编码的经单独翻译的多肽形式构建经共表达的CSR及caTCR。
表征表达抗人类CD22 caTCR的T细胞。原代T细胞用编码构建体组合1、3、5及6(分别为SEQ ID NO:1、3、5及6)、构建体2及4(分别为SEQ ID NO:2及4)的核酸转导，或模拟转导(不使用核酸)。通过细胞表面染色来测定转导效率，其中Fab作为caTCR表达的标记物并且myc标签作为CSR表达的标记物。结果表明在用编码caTCR-CSR的核酸转导的相同的T细胞样品中，caTCR+细胞百分比及CSR+细胞百分比大致相同。所有经caTCR转导的T细胞通过与模拟T细胞混合而在约46％caTCR受体阳性下匹配(归一化)，并使用caTCR+细胞作为效应细胞。
体外杀灭。在单独的T细胞刺激实验中，在1:1的效应子:靶细胞比率下，使用CD80/86阴性NALM6-luc-GFP细胞及CD80/CD86阳性拉吉-luc-GFP细胞(表达CD22及CD19的白血病及淋巴瘤细胞)作为靶细胞并与caTCR T细胞一起培育过夜(约16小时)。在过夜培育之后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析法(普洛麦格)测量特异性T细胞溶解。对活靶细胞进行计数，并且杀灭百分比计算为各组中剩余的活靶细胞的百分比与仅具有靶细胞(无T细胞)的组中剩余的活靶细胞的百分比相比的差异。结果展示于图7中。表达六种构建体及构建体组合(SEQ ID NO:1-6)中的任一种的caTCR T细胞在NALM6细胞中具有极高的杀灭功效。在所测试的1:1的效应子:靶细胞比率下，其在拉吉细胞中也具有显著杀灭功效，但不如在NALM6中高。
使用NALM6-luc-GFP细胞及拉吉-luc-GFP细胞作为靶细胞并使用经编码构建体组合7-14的核酸转导的原代T细胞作为效应细胞，进行类似的体外杀灭实验。
细胞介素分泌。除测量活靶细胞数目以外，使用来自Biolegend的人类IFN-γELISA MAXTM试剂盒测量释放于体外杀灭反应的上清液中的IFN-γ的浓度作为细胞杀灭的另一指标。结果展示于图8中。表达六种构建体及构建体组合中的任一种的caTCR T细胞具有来自拉吉细胞的高IFN-γ释放量，尤其构建体4(抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR(也称为二价单特异性抗CD22-caTCR))。大部分抗CD22-caTCR T细胞组也具有来自NALM6细胞的高IFN-γ释放量。
类似地，通过相同的方法测量在表达构建体组合7-14的T细胞下，来自NALM6细胞及拉吉细胞的释放于体外杀灭反应的上清液中的IFN-γ的浓度。
靶细胞再攻击。表达构建体组合3、5及6(分别为SEQ ID NO:1、3、5及6)以及构建体2及4(分别为SEQ ID NO:2及4)中的任一种的T细胞最初与50,000个NALM6-luc-GFP或拉吉-luc-GFP靶细胞以1:1的效应子:靶细胞比率共同培养。每隔7天向相同的共同培养物中添加100,000个新的靶细胞以再攻击(或“接合”)T细胞。每周两次使用流式分析对共同培养物中剩余的靶细胞及T细胞进行计数，以评估T细胞的杀灭活性。使用NALM6作为靶细胞的结果展示于图9A(靶细胞数目)及图9B(总T细胞数目)中，而使用拉吉作为靶细胞的结果展示于图10A(靶细胞数目)及图10B(总T细胞数目)中。表达五种构建体及构建体组合(SEQ ID NO:2-6)中的任一种的抗CD22-caTCR T细胞在长达至少三周内及在三轮或更多轮目标接合之后(例如在E3D7及E4D3)，在NALM6细胞中保持高杀灭功效。关于NALM6靶细胞，表达构建体组合5(抗CD22-scFv-抗CD22-caTCR+抗CD19-CSR)的T细胞在五种构建体及构建体组合中持续最长时间。表达五种构建体及构建体组合中的任一种的抗CD22-caTCR T细胞在拉吉细胞中，在长达约五周内及在总共五轮目标接合之后也具有显著杀灭功效。
使用NALM6-luc-GFP细胞及拉吉-luc-GFP细胞作为靶细胞并使用经编码构建体组合1及7-14中的每一种的核酸转导的原代T细胞作为效应细胞，进行类似的靶细胞再攻击实验。
此实例中描述的实验结果表明经转导以表达抗CD22-caTCR的T细胞成功地杀灭表达CD22的靶癌细胞。此类细胞也留存至少数周并保持其靶细胞杀灭能力。
实例10-产生及表征表达双特异性或三特异性抗人类CD22-caTCR的T细胞
此实例描述表达各种双特异性或三特异性caTCR构建体的T细胞的产生及表征，所述构建体包含抗人类CD22 Fab及一个或两个如本文中所描述的标靶非CD22抗原的其它抗体可变区片段。一些caTCR-T细胞也表达CSR。
产生表达各种caTCR(包括双特异性或三特异性抗人类CD22-caTCR)的T细胞。简单地说，用所选择的编码caTCR的核酸仿真转导(模拟物)或转导原代T细胞。确切地说，产生编码以下构建体15-21(分别为SEQ ID NO:15-21)的核酸并用于转导。
体外杀灭。根据如实例9中所描述的类似方案，在1:1的效应子:靶细胞比率下，使用CD80/86阴性NALM6-luc-GFP细胞、CD80/CD86阳性拉吉-luc-GFP细胞(表达CD22及CD19的白血病及淋巴瘤细胞)及K562细胞作为单独的T细胞刺激实验中的靶细胞并与caTCR T细胞一起培育过夜(约16小时)。在过夜培育之后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析法(普洛麦格)测量特异性T细胞溶解。对活靶细胞进行计数，并且杀灭百分比计算为各组中剩余的活靶细胞的百分比与仅具有靶细胞(无T细胞)的组中剩余的活靶细胞的百分比相比的差异。结果展示于图11及图12A-12F中。表达双特异性构建体(构建体15-21(分别为SEQ IDNO:15-21))或单特异性构建体(构建体2、22及28(分别为SEQ ID NO:2、22及28))中的任一种的caTCR T细胞在所述细胞中具有极高杀灭功效。
使用编码构建体组合23(SEQ ID NO:23)、构建体24-27(分别为SEQ ID NO:24-27)及构建体组合29-75(分别为SEQ ID NO:29-75)的核酸，根据相同的实验方案进行类似的体外杀灭实验。
靶细胞再攻击。根据如实例9中所描述的类似方案，表达构建体组合1及23的T细胞最初与50,000个NALM6-luc-GFP靶细胞一起以1:1的效应子:靶细胞比率共同培养。每7天向相同的共同培养物中添加100,000个新的靶细胞以再攻击(或“接合”)T细胞。每周两次使用流式分析对共同培养物中剩余的靶细胞及T细胞进行计数，以评估T细胞的杀灭活性。使用NALM6作为靶细胞的结果展示于图13A及图13B中。
使用编码构建体及构建体组合15-21、24-27及29-75(分别为SEQ ID NO:15-21、24-27及29-75)中的每一种的核酸，根据相同的实验方案进行类似的靶细胞再攻击实验。
实例11-产生及表征表达其它构建体组合的T细胞
此实例描述表达各种其它caTCR-CSR构建体组合的T细胞的产生及表征，所述构建体组合包含抗人类CD22 Fab及一个或两个如本文中所描述的标靶非CD22抗原的其它抗体可变区片段。一些caTCR-T细胞也表达CSR。
根据如上文所描述的类似方案，用编码以下构建体组合的核酸仿真转导(模拟物)或转导原代T细胞：
(1)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；
(2)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；
(3)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:77的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；
(4)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:81-96中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；
(5)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:97-112中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列；及
(6)包含caTCR及CSR的构建体组合，其中caTCR具有与SEQ ID NO:78的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列，并且CSR具有与SEQ IDNO:113-128中的任一个的序列具有至少90％(例如92％、94％、96％、98％、99％或100％)一致性的序列。
在一些实施例中，抗CD22构建体组合包含caTCR，其具有轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列并且所述重链可变区具有与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。
在一些实施例中，抗CD22构建体组合包含caTCR，其具有轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列并且所述重链可变区具有与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。
在一些实施例中，抗CD22构建体组合包含CSR，其具有轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:212的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列并且所述重链可变区具有与SEQ ID NO:213的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。
在一些实施例中，抗CD22构建体组合包含CSR，其具有轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:218的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列并且所述重链可变区具有与SEQ ID NO:219的序列具有至少90％一致性(例如至少92％、94％、96％、98％或99％一致性)的序列。
编码以上实施例中的任一个中描述的抗CD22构建体组合中的任一种的核酸也转导于原代T细胞中。
根据如上文所描述的类似方案，还在体外杀灭及靶细胞再攻击实验中测试以上实施例中的任一个中描述的抗CD22构建体组合中的任一种。
实例12-经抗CD22构建体或构建体组合转导的T细胞的体内功效研究
在人类CD19+NALM-6前B急性成淋巴细胞性白血病(ALL)模型中，测试表达本文中所描述的抗CD22构建体及构建体组合中的一种或多种的T细胞的体内抗肿瘤活性。将表达荧光素酶的NALM-6细胞静脉内(i.v.)植入NOD SCIDγ(NSG)免疫功能不全小鼠中，并通过测量肿瘤衍生的生物发光来评估肿瘤负荷。在肿瘤植入后六天，基于总生物发光通量将小鼠随机分配到各处理组中：(1)静脉内注射5×106个未经转导的供体匹配(模拟物)T细胞，(2)静脉内注射2×106个仅表达抗CD22 caTCR构建体的T细胞(“caTCR T细胞”)及(3)静脉内注射2×106个表达抗CD19 caTCR及抗CD19 CSR的T细胞(“caTCR CSR T细胞”；n＝6只小鼠/组)。通过监测小鼠的全身外观、体重及不良反应的其它临床征象(包括体温降低、呼吸困难及后肢麻痹/虚弱)来评估小鼠中由T细胞输注引起的健康作用。
为了测定体内细胞介素释放量，在向具有NALM-6肿瘤的小鼠投与抗CD22 CAR-T细胞或caTCR CSR T细胞之后24小时分析关键细胞介素，包括与临床细胞介素释放综合征相关的细胞介素。使用伯乐Bio-Plex试剂盒，通过Luminex Magpix技术定量细胞介素含量。
示例性实施例
根据本发明所公开的目标物提供的示例性实施例包括(但不限于)实施例及以下实施例：
1.一种抗CD22构建体，其包含特异性结合于CD22的抗体部分，其中所述抗体部分包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:218或212的轻链可变区的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2及LC-CDR3；及
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:219或213的重链可变区的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2及HC-CDR3。
2.如实施例1的抗CD22构建体，其中抗体部分包含SEQ ID NO:218的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
3.如实施例1的抗CD22构建体，其中抗体部分包含SEQ ID NO:212的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
4.如实施例1或2的抗CD22构建体，其中抗体部分包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:218的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；及
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:219的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
5.如实施例1或3的抗CD22构建体，其中抗体部分包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:212的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；及
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:213的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
6.如实施例1的抗CD22构建体，其中抗体部分包含以下中的一个或多个：
LC-CDR1，其具有序列HDIRNY(SEQ ID NO:214)，
LC-CDR2，其具有序列AAS(SEQ ID NO:215)，
LC-CDR3，其具有序列QQYDGLPLT(SEQ ID NO:216)，
HC-CDR1，其具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)，
HC-CDR2，其具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)，及
HC-CDR3，其具有序列ARYGSAAWMDS(SEQ ID NO:217)。
7.如实施例6的抗CD22构建体，其中抗体部分包含SEQ ID NO:209、210及214-217的序列。
8.如实施例6或7的抗CD22构建体，其中轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001081
9.如实施例6至8中任一项的抗CD22构建体，其中重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001091
10.一种抗CD22构建体，其包含轻链可变区及重链可变区，其中
轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001092
Figure BDA0002777825040001093
及
重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001094
11.如实施例10的抗CD22构建体，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:218的序列，并且重链可变区包含SEQ ID NO:219的序列。
12.如实施例1的抗CD22构建体，其中抗体部分包含以下中的一个或多个：
LC-CDR1，其具有序列SSNIGNNY(SEQ ID NO:206)，
LC-CDR2，其具有序列ENN(SEQ ID NO:207)，
LC-CDR3，其具有序列GTWDSSLSAGAV(SEQ ID NO:208)，
HC-CDR1，其具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)，
HC-CDR2，其具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)，及
HC-CDR3，其具有序列ARPYYDD(SEQ ID NO:211)。
13.如实施例12的抗CD22构建体，其中抗体部分包含SEQ ID NO:206-211的序列。
14.如实施例12或13的抗CD22构建体，其中轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001095
15.如实施例12或13中任一项的抗CD22构建体，其中重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001096
Figure BDA0002777825040001101
16.一种抗CD22构建体，其包含重链可变区及轻链可变区，其中
轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001102
Figure BDA0002777825040001103
及
重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure BDA0002777825040001104
17.如实施例16的抗CD22构建体，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:212的序列，并且重链可变区包含SEQ ID NO:213的序列。
18.一种抗CD22构建体，其包含与如实施例11或实施例17的抗CD22构建体竞争特异性结合于CD22的抗体部分。
19.如实施例1至18中任一项的抗CD22构建体，其中轻链可变区及重链可变区通过接头接合。
20.如实施例19的抗CD22构建体，其中接头具有序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQID NO:233)。
21.如实施例1至20中任一项的抗CD22构建体，其中抗体部分包含λ或κ同型的轻链。
22.如实施例1至21中任一项的抗CD22构建体，其中抗体部分结合于CD22的胞外区域。
23.如实施例22的抗CD22构建体，其中CD22的胞外区域包含至少7个以下序列的氨基酸：
Figure BDA0002777825040001105
24.如实施例22或23的抗CD22构建体，其中胞外区域具有SEQ ID NO:205的序列。
25.如实施例1至24中任一项的抗CD22构建体，其中构建体为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)抗体。
26.如实施例1至25中任一项的抗CD22构建体，其中构建体为单特异性。
27.如实施例1至25中任一项的抗CD22构建体，其中构建体为多特异性。
28.如实施例27的抗CD22构建体，其中构建体为双特异性。
29.如实施例27或28的抗CD22构建体，其中构建体为串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再标靶(DART)抗体、双重可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、锁钥结构(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。
30.如实施例25的抗CD22构建体，其中构建体为串联scFv，其包含两个通过肽接头连接的scFv。
31.如实施例30的抗CD22构建体，其中肽接头包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。
32.如实施例27至31中任一项的抗CD22构建体，其中构建体进一步包含第二抗体部分，其特异性结合于第二抗原。
33.如实施例32的抗CD22构建体，其中第二抗原为T细胞表面上的抗原。
34.如实施例33的抗CD22构建体，其中T细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞及自然杀伤T细胞。
35.如实施例32至34中任一项的抗CD22构建体，其中第二抗原选自由以下组成的群组：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。
36.如实施例35的抗CD22构建体，其中第二抗原为CD3ε，并且其中构建体为串联scFv，其包含对具有SEQ ID NO:205的序列的CD22或其一部分具有特异性的N端scFv及对CD3ε具有特异性的C端scFv。
37.如实施例32的抗CD22构建体，其中第二抗原为自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核球、巨噬细胞或树突状细胞表面上的抗原。
38.如实施例1至24中任一项的抗CD22构建体，其中抗CD22构建体为嵌合抗原受体(CAR)。
39.如实施例38的抗CD22构建体，其中CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域及免疫细胞信号传导结构域，其中抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
40.如实施例38的抗CD22构建体，其中CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域及免疫细胞信号传导结构域，其中抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
41.如实施例39或40的抗CD22构建体，其中免疫细胞信号传导结构域来自CD3ζ链。
42.如实施例39或40的抗CD22构建体，其中免疫细胞信号传导结构域来自CD28、4-1BB、ICOS或OX40。
43.如实施例39或40中任一项的抗CD22构建体，其中跨膜结构域为T细胞受体跨膜结构域。
44.如实施例1至24中任一项的抗CD22构建体，其中抗CD22构建体为嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)，其包含结合于CD22的胞外结构域及包含TCR跨膜结构域的T细胞受体(TCR)模块(TCRM)。
45.如实施例44的抗CD22构建体，其中caTCR包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
46.如实施例44的抗CD22构建体，其中caTCR包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
47.如实施例44至46中任一项的抗CD22构建体，其中TCRM能够募集至少一个TCR相关信号传导模块。
48.如实施例47的抗CD22构建体，其中TCR相关信号传导模块选自由以下组成的群组：CD3δε、CD3γε及CD3ζ。
49.如实施例44至48中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域包含：
(a)第一多肽，其包含第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)及CH1恒定结构域；及
(b)第二多肽链，其包含第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)及CL恒定结构域，
其中所述第一抗原结合区的VH及CH1恒定结构域以及所述第二抗原结合区的VL及CL恒定结构域形成特异性结合于CD22的Fab样抗原结合模块。
50.如实施例44至49中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域包含特异性结合于CD22的scFv。
51.如实施例44至50中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域进一步包含至少一个特异性结合于至少一个非CD22抗原的其它抗体部分。
52.如实施例51的抗CD22构建体，其中至少一个非CD22抗原表达于B细胞恶性病中。
53.如实施例44至50中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分。
54.如实施例44至50中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域进一步包含特异性结合于CD20的抗体部分。
55.如实施例44至50中任一项的抗CD22构建体，其中胞外结构域进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分及特异性结合于CD20的抗体部分。
56.如实施例44至55中任一项的抗CD22构建体，其中caTCR与嵌合信号传导受体(CSR)组合表达。
57.如实施例56的抗CD22构建体，其中CSR包含抗CD22抗体部分。
58.如实施例56的抗CD22构建体，其中CSR包含特异性结合非CD22抗原的抗体部分。
59.如实施例1至24中任一项的抗CD22构建体，其中抗CD22构建体为嵌合信号传导受体(CSR)。
60.如实施例59的抗CD22构建体，其中CSR包含
(a)抗CD22抗体部分；
(b)跨膜模块；及
(c)共刺激免疫细胞信号传导模块，其能够向所述免疫细胞提供共刺激信号，
其中所述CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导结构域。
61.如实施例60的抗CD22构建体，其中抗CD22抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:214-216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209、210及217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
62.如实施例60的抗CD22构建体，其中抗CD22抗体部分包含分别具有SEQ ID NO:206-208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209-211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
63.如实施例59至62中任一项的抗CD22构建体，其中CSR与caTCR或CAR组合表达。
64.如实施例63的抗CD22构建体，其中caTCR或CAR特异性标靶CD22。
65.如实施例63的抗CD22构建体，其中caTCR或CAR不特异性标靶CD22。
66.如实施例59至65中任一项的抗CD22构建体，其中CSR进一步包含至少一个特异性结合于至少一个非CD22抗原的其它抗体部分。
67.如实施例56至66中任一项的抗CD22构建体，其中CSR进一步包含特异性结合于CD19的抗体部分。
68.如实施例56至67中任一项的抗CD22构建体，其中CSR进一步包含特异性结合于CD20的抗体部分。
69.如实施例56至68中任一项的抗CD22构建体，其中CSR包含来自相同分子的跨膜片段及胞内片段。
70.如实施例69的抗CD22构建体，其中分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83特异性结合的配体。
71.如实施例70的抗CD22构建体，其中分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30及CD27。
72.如实施例56至68中任一项的抗CD22构建体，其中CSR包含来自不同分子的跨膜片段及胞内片段。
73.如实施例72的抗CD22构建体，其中CSR包含选自由以下组成的群组的分子的跨膜片段：T细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链；CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
74.如实施例74的抗CD22构建体，其中CSR包含CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30或OX40的跨膜片段。
75.如实施例72至75中任一项的抗CD22构建体，其中跨膜片段包含SEQ ID NO:145-150中的任一个的序列。
76.如实施例72至75中任一项的抗CD22构建体，其中CSR包含选自由以下组成的群组的分子的胞内片段：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83特异性结合的配体。
77.如实施例76的抗CD22构建体，其中CSR包含选自由以下组成的群组的分子的胞内片段：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30及CD27。
78.如实施例76的抗CD22构建体，其中胞内片段包含SEQ ID NO:151-155中的任一个的序列。
79.如实施例56至78中任一项的抗CD22构建体，其中CSR包含SEQ ID NO:156-171中的任一个的序列。
80.如实施例1至24中任一项的抗CD22构建体，其中抗CD22构建体为免疫结合物，其包含抗体部分及效应分子。
81.如实施例80的抗CD22构建体，其中效应分子为选自由以下组成的群组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽及核酸。
82.如实施例81的抗CD22构建体，其中治疗剂为药物或毒素。
83.如实施例80的抗CD22构建体，其中效应分子为标记。
84.一种核酸分子，其编码一个或多个如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体中所含的多肽。
85.如实施例84的核酸分子，其中核酸分子编码如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体中所含的所有多肽。
86.如实施例85的核酸分子，其中：
抗CD22构建体为caTCR并与CSR组合表达，并且其中核酸分子编码caTCR中所含的所有多肽及CSR的多肽；或
抗CD22构建体为CSR并与caTCR或CAR组合表达，并且其中核酸分子编码CSR的多肽及caTCR或CAR中所含的所有多肽。
87.一种核酸分子的集合，所述核酸分子分别编码如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体中所含的所有多肽。
88.如实施例87的核酸分子的集合，其中：
抗CD22构建体为caTCR并与CSR组合表达，并且其中核酸分子的集合编码caTCR中所含的所有多肽及CSR的多肽；或
抗CD22构建体为CSR并与caTCR或CAR组合表达，并且其中核酸分子的集合编码CSR的多肽及caTCR或CAR中所含的所有多肽。
89.一种表达盒，其包含如实施例84至86中任一项的核酸分子。
90.一种表达盒的集合，其包含分别编码如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体中所含的所有多肽的核酸分子。
91.如实施例90的表达盒的集合，其中表达盒的集合包含如实施例87或88的核酸分子的集合。
92.一种宿主细胞，其包含如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒或如实施例90或91的表达盒的集合。
93.一种宿主细胞，其表达如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体。
94.如实施例93的宿主细胞，其中宿主细胞包含如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒或如实施例90或91的表达盒的集合。
95.一种制备如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体的方法，其中所述方法包含：
(a)提供宿主细胞，其包含如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒或如实施例90或91的表达盒的集合，及
(b)在允许形成抗CD22构建体的条件下，在宿主细胞中表达核酸分子或表达盒。
96.一种医药组合物，其包含治疗有效量的如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体、如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒、如实施例90或91的表达盒的集合或如实施例92至94中任一项的宿主细胞，及一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。
97.一种治疗有需要的个体中的B细胞恶性病的方法，其包含向个体投与治疗有效量的如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体、如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒、如实施例90或91的表达盒的集合、如实施例92至94中任一项的宿主细胞或如实施例96的医药组合物。
98.一种治疗有需要的个体中的特征在于CD22过表达的疾病或病症的方法，其包含向个体投与治疗有效量的如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体、如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒、如实施例90或91的表达盒的集合、如实施例92至94中任一项的宿主细胞或如实施例96的医药组合物。在此方法的一些实施例中，方法为治疗疾病的方法。在一些实施例中，所述方法为治疗病症的方法。在一些实施例中，特征在于CD22过表达的疾病或病症为癌症(例如B细胞恶性病)。
99.一种治疗方法，其包含将如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒或如实施例90或91的表达盒的集合引入一个或多个从个体分离的原代细胞中，及向个体投与包含核酸分子、核酸分子的集合、表达盒或表达盒的集合的细胞。
100.如实施例99的方法，其进一步包含在向个体投与细胞的前扩增细胞。
101.如实施例99或100的方法，其中原代细胞为淋巴细胞。
102.如实施例101的方法，其中原代细胞为T细胞。
103.一种检测样品中的CD22的方法，其包含：(a)使样品与如实施例1至26中任一项的抗CD22构建体接触；及(b)直接地或间接地检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。
104.如实施例103的方法，其中抗CD22构建体与可检测标记结合。
105.如实施例104的方法，其中可检测标记为发色、酶促、放射性同位素、同位素、荧光、毒性、化学发光或核磁共振对比剂。
106.如实施例104或105的方法，其中通过检测可检测标记直接检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。
107.如实施例103的方法，其中使用二级抗体间接检测抗CD22构建体与样品中的任何CD22之间的结合。
108.一种诊断怀疑患有CD22相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)向个体投与有效量的如实施例1至26中任一项的抗CD22构建体；及
b)直接地或间接地测定所述抗CD22构建体与所述个体中的任何CD22之间的结合量，其中所述结合量高于阈值量表明所述个体患有所述CD22相关疾病或病症。
109.如实施例108的方法，其中CD22相关疾病或病症为癌症。
110.如实施例109的方法，其中癌症为B细胞恶性病。
111.一种诊断患有B细胞恶性病的个体的方法，其包含：
(a)使来源于个体的样品与如实施例1至26中任一项的抗CD22构建体接触；及
(b)测定所述样品中与所述抗CD22构建体结合的细胞的数目，
其中与所述抗CD22构建体结合的细胞数目的值高于阈值量表明所述个体患有所述B细胞恶性病。
112.如实施例111的方法，其中B细胞恶性病为CD22+B细胞恶性病。
113.如实施例98、108及111中任一项的方法，其中疾病、病症或B细胞恶性病为B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
114.如实施例97至113中任一项的方法，其中个体为人类。
115.一种如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体、如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒、如实施例90或91的表达盒的集合、如实施例92至94中任一项的宿主细胞或如实施例96的医药组合物的用途，其用于治疗与阳性CD22表达相关的疾病或病症。
116.一种如实施例1至83中任一项的抗CD22构建体、如实施例84至86中任一项的核酸分子、如实施例87或88的核酸分子的集合、如实施例89的表达盒、如实施例90或91的表达盒的集合、如实施例92至94中任一项的宿主细胞或如实施例96的医药组合物的用途，其用于制造用以治疗与阳性CD22表达相关的疾病或病症的药剂。
117.一种如实施例1至26中任一项的抗CD22构建体的用途，其用于诊断与阳性CD22表达相关的疾病或病症。
118.如实施例115至117中任一项的用途，其中与阳性CD22表达相关的疾病或病症为癌症。
非正式序列表
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来自本文中或图式中所描述的任何实施例的一个或多个特征可在不偏离本发明的范围的情况下与本文在图式中所描述的任何其它实施例的一个或多个特征组合。
本说明书中所引用的所有公开、专利及专利申请皆以引用的方式并入本文中，就如同各个别公开或专利申请特定地并且个别地指示以引用的方式并入一般。尽管已出于清楚理解的目的借助于说明及实例相当详细地描述前述内容，但鉴于本发明的教授内容，对所属领域的普通技术人员将容易地显而易见的是，可在不偏离随附权利要求书的精神或范围的情况下对其进行某些变化及修改。

Claims (35)

1.一种抗CD22构建体，其包含特异性结合于CD22的抗体部分，其中所述抗体部分包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:212的轻链可变区的轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；及
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:213的重链可变区的重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗CD22构建体，其中所述抗体部分包含以下中的一个或多个：
所述LC-CDR1，其具有序列HDIRNY(SEQ ID NO:214)，
所述LC-CDR2，其具有序列AAS(SEQ ID NO:215)，
所述LC-CDR3，其具有序列QQYDGLPLT(SEQ ID NO:216)，
所述HC-CDR1，其具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)，
所述HC-CDR2，其具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)，及
所述HC-CDR3，其具有序列ARYGSAAWMDS(SEQ ID NO:217)。
3.根据权利要求1或2所述的抗CD22构建体，其中所述轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure FDA0002777825030000011
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure FDA0002777825030000012
5.根据权利要求1所述的抗CD22构建体，其中所述抗体部分包含以下中的一个或多个：
所述LC-CDR1，其具有序列SSNIGNNY(SEQ ID NO:206)，
所述LC-CDR2，其具有序列ENN(SEQ ID NO:207)，
所述LC-CDR3，其具有序列GTWDSSLSAGAV(SEQ ID NO:208)，
所述HC-CDR1，其具有序列GFTFSNYA(SEQ ID NO:209)，
所述HC-CDR2，其具有序列ISGSGGST(SEQ ID NO:210)，及
所述HC-CDR3，其具有序列ARPYYDD(SEQ ID NO:211)。
6.根据权利要求1或5所述的抗CD22构建体，其中所述轻链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure FDA0002777825030000021
7.根据权利要求1、5或6中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述重链可变区具有与以下序列具有至少90％一致性的序列：
Figure FDA0002777825030000022
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述构建体为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)抗体。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述构建体为串联scFv、双功能抗体Db、单链双功能抗体scDb、双重亲和力再标靶DART抗体、双重可变结构域DVD抗体、杵臼结构KiH抗体、锁钥结构DNL抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合抗体。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述构建体进一步包含特异性结合于第二抗原的第二抗体部分，并且其中所述第二抗原为T细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核球、巨噬细胞或树突状细胞表面上的抗原。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述抗CD22构建体为嵌合抗原受体CAR。
12.根据权利要求11所述的抗CD22构建体，其中所述CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域及免疫细胞信号传导结构域，其中所述抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQID NO:214至SEQ ID NO:216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
13.根据权利要求11所述的抗CD22构建体，其中所述CAR包含抗CD22抗体部分、跨膜结构域及免疫细胞信号传导结构域，其中所述抗CD22抗体部分为scFv，其包含分别具有SEQID NO:206至SEQ ID NO:208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
14.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述抗CD22构建体为嵌合抗体-T细胞受体caTCR，其包含结合于CD22的胞外结构域及包含TCR跨膜结构域的T细胞受体TCR模块TCRM。
15.根据权利要求14所述的抗CD22构建体，其中所述caTCR包含分别具有SEQ ID NO:214至SEQ ID NO:216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
16.根据权利要求14所述的抗CD22构建体，其中所述caTCR包含分别具有SEQ ID NO:206至SEQ ID NO:208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
17.根据权利要求14至16中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述胞外结构域包含：
(a)第一多肽，其包含第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)及CH1恒定结构域；及
(b)第二多肽链，其包含第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)及CL恒定结构域，
其中所述第一抗原结合区的所述VH及所述CH1恒定结构域以及所述第二抗原结合区的所述VL及所述CL恒定结构域形成特异性结合于CD22的Fab样抗原结合模块。
18.根据权利要求14至17中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述胞外结构域进一步包含至少一个特异性结合于至少一个非CD22抗原的其它抗体部分。
19.根据权利要求14至18中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述caTCR与嵌合信号传导受体CSR组合表达。
20.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述抗CD22构建体为嵌合信号传导受体CSR，其包含：
(a)抗CD22抗体部分；
(b)跨膜模块；及
(c)共刺激免疫细胞信号传导模块，其能够向所述免疫细胞提供共刺激信号，
其中所述CSR不具有功能性原代免疫细胞信号传导结构域。
21.根据权利要求20所述的抗CD22构建体，其中所述抗CD22抗体部分包含分别具有SEQID NO:214至SEQ ID NO:216的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:217的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
22.根据权利要求20所述的抗CD22构建体，其中所述抗CD22抗体部分包含分别具有SEQID NO:206至SEQ ID NO:208的序列的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3、分别具有SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:211的序列的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3。
23.根据权利要求20至22中任一权利要求所述的抗CD22构建体，其中所述CSR与caTCR或CAR组合表达。
24.一种核酸分子，其编码一个或多个根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体中所含的多肽。
25.一种表达盒，其包含根据权利要求24所述的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的核酸分子或根据权利要求25所述的表达盒。
27.一种宿主细胞，其表达根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体。
28.一种制备根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体的方法，其中所述方法包含：
(a)提供宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的核酸分子或根据权利要求25所述的表达盒，及
(b)在所述宿主细胞中于允许形成所述抗CD22构建体的条件下，表达所述核酸分子或表达盒。
29.一种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体、根据权利要求24所述的核酸分子、根据权利要求25所述的表达盒或根据权利要求26或27所述的宿主细胞，及一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。
30.一种治疗有需要的个体中B细胞恶性病的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体、根据权利要求24所述的核酸分子、根据权利要求25所述的表达盒、根据权利要求26或27所述的宿主细胞或根据权利要求29所述的药物组合物。
31.一种治疗有需要的个体中特征在于CD22过表达的疾病或病症的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体、根据权利要求24所述的核酸分子、根据权利要求25所述的表达盒、根据权利要求26或27所述的宿主细胞或根据权利要求29所述的药物组合物。
32.一种治疗方法，其包含将根据权利要求24所述的核酸分子或根据权利要求25所述的表达盒引入到一个或多个从个体分离的原代细胞中，及向所述个体投与包含所述核酸分子或所述表达盒的细胞。
33.一种检测样品中CD22的方法，其包含：(a)使所述样品与根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体接触；及(b)直接地或间接地检测所述抗CD22构建体与所述样品中任何CD22之间的结合。
34.一种诊断疑似患有CD22相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)向所述个体投与有效量的根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体；及
b)直接地或间接地测定所述抗CD22构建体与所述个体中任何CD22之间的结合量，其中所述结合量高于阈值量表明所述个体患有所述CD22相关疾病或病症。
35.一种诊断患有B细胞恶性病的个体的方法，其包含：
(a)使源于所述个体的样品与根据权利要求1至23中任一权利要求所述的抗CD22构建体接触；及
(b)测定所述样品中与所述抗CD22构建体结合的细胞的数目，
其中与所述抗CD22构建体结合的细胞数目的值高于阈值量表明所述个体患有所述B细胞恶性病。
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