CN112888435A

CN112888435A - 联合疗法治疗神经母细胞瘤的方法

Info

Publication number: CN112888435A
Application number: CN201980067449.0A
Authority: CN
Inventors: S·莫达克
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-06-01
Also published as: WO2020041565A1; US20210198379A1

Abstract

本公开提供使用抗GD2抗体、至少一种化疗剂和至少一种造血生长因子治疗神经母细胞瘤的方法。本公开还提供用于治疗神经母细胞瘤的组合物。

Description

联合疗法治疗神经母细胞瘤的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月22日提交的美国临时申请第62/721,433号的优先权，在此将其全部内容并入作为参考。

序列表

本申请包含经由EFS-Web提交的序列表，在此将其全部内容并入作为参考。所述ASCII拷贝于2019年8月22日生成，命名为072734.093l_ST25，大小为35,310字节。

引言

本公开提供通过施用抗神经节苷脂D2(抗GD2)抗体联合至少一种化疗剂和至少一种造血生长因子来治疗神经母细胞瘤(例如，难治性和复发性神经母细胞瘤)的方法。本公开还提供用于治疗神经母细胞瘤的药物组合物。

背景技术

神经母细胞瘤是常见的儿童颅外实体肿瘤。强化诱导化疗和积极的手术提高了年轻患者的缓解率；然而，在其中神经母细胞瘤特别耐药的青少年和成人中，结果并不太瞩目。实现根除微小残留病(MRD)的有效策略仍然是一项挑战。在最近的全国研究中，长期无复发生存率仅为～30％。此外，难治性和复发性神经母细胞瘤患者预后较差。因此，对于原发的难治性和复发性神经母细胞瘤，需要改进治疗方法。

伊立替康联合替莫唑胺(IT)已成为难治性或复发性神经母细胞瘤患者的二线化疗方案。虽然在一些患者中，多个IT治疗的疗程可长期控制疾病，但复发性或难治性神经母细胞瘤患者的客观反应率较低(Kushner等,J Clin Oncol(2006)；24:527l-6；Bagatell等,Clin Cancer Res(200l)；7:32-7)。已经有人尝试通过使IT与其他化疗剂例如替西罗莫司(temsirolimus)、吉非替尼或阿立塞替(alisertib)联合使用，或使用¹³¹I-MIBG进行靶向放疗来提高IT的抗神经母细胞瘤活性。然而，这些联合疗法并不能显著提高反应率。

发明内容

本公开提供通过施用抗GD2抗体联合至少一种化疗剂和至少一种造血生长因子来治疗神经母细胞瘤的方法。

一方面，本公开提供治疗受试者中神经母细胞瘤的方法，该方法包括向受试者施用抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种化疗剂。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQID NO:4的氨基酸残基31-35的重链可变区CDR1或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:11或SEQID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64的重链可变区CDR2或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108的重链可变区CDR3或其保守修饰物、包括SEQ IDNO:5的氨基酸残基24-34的轻链可变区CDR1或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56的轻链可变区CDR2或其保守修饰物、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95的轻链可变区CDR3或其保守修饰物。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQID NO:4的氨基酸残基31-35的重链可变区CDR1或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:11或SEQID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64的重链可变区CDR2或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108的重链可变区CDR3或其保守修饰物、包括SEQ IDNO:5的氨基酸残基24-34的轻链可变区CDR1或其保守修饰物、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56的轻链可变区CDR2或其保守修饰物、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94的轻链可变区CDR3或其保守修饰物。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合部分包括：包括与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合部分包括：包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，抗GD2抗体是人源化3F8(hu3F8)抗体。

在某些实施方式中，至少一种造血生长因子选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在某些实施方式中，GM-CSF是重组GM-CSF。在某些实施方式中，重组GM-CSF是沙格司亭。

在某些实施方式中，至少一种化疗剂选自拓扑异构酶I抑制剂、烷化剂及其组合。

在某些实施方式中，所述方法包括两种化疗剂。在某些实施方式中，两种化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。

在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段以约2.25mg/kg/天的量给药。在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段静脉内给药。

在某些实施方式中，将造血生长因子以约250mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将造血生长因子皮下给药。

在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以约50mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂静脉内给药。

在某些实施方式中，将烷化剂以约150mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将烷化剂口服或静脉内给药。

在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种化疗剂循环给药。在某些实施方式中，循环数是1至24个循环。在某些实施方式中，一个循环包括在该循环中在4天施用抗GD2抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段在该循环中第2天、第4天、第8天和第10天给药。在某些实施方式中，一个循环包括在该循环中施用至少一种造血生长因子5天。在某些实施方式中，将至少一种造血生长因子在在该循环中第6-10天给药。在某些实施方式中，一个循环包括在该循环中在5天施用至少一种化疗剂。在某些实施方式中，将至少一种化疗剂在在该循环中第1-5天给药。在某些实施方式中，一个循环包括在该循环中在5天施用至少一种化疗剂。在某些实施方式中，每个循环的持续时间是10天。

在某些实施方式中，每个循环之后是休息期。在某些实施方式中，休息期是约3周至约5周。在某些实施方式中，休息期是约4周至约6周。

在某些实施方式中，神经母细胞瘤是难治性神经母细胞瘤、复发性神经母细胞瘤或者难治性和复发性神经母细胞瘤。

另一方面，本公开提供一种组合物，其包括本文公开的抗GD2抗体或其抗原结合片段、本文公开的至少一种造血生长因子和本文公开的至少一种化疗剂。

在某些实施方式中，组合物包括两种化疗剂。在某些实施方式中，两种化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。

在某些实施方式中，组合物用于治疗神经母细胞瘤。在某些实施方式中，神经母细胞瘤是难治性神经母细胞瘤、复发性神经母细胞瘤或者难治性和复发性神经母细胞瘤。

在某些实施方式中，组合物是药物组合物，其还包括药学可接受的载体。在某些实施方式中，组合物用于治疗神经母细胞瘤。

另一方面，本公开提供本文公开的组合物在制造用于治疗神经母细胞瘤的药物中的用途。

具体实施方式

本公开提供通过施用抗GD2抗体联合至少一种造血生长因子和至少一种化疗剂联合来治疗神经母细胞瘤的方法。具体地，本公开涉及难治性和复发性神经母细胞瘤的治疗。本公开还提供治疗神经母细胞瘤的药物组合物和剂量方案。

通过本说明书和实施例提供本公开的非限定性实施方式。

出于清楚公开的目的而非限制起见，详细说明分成以下小节：

1.定义；

2.联合疗法；

3.治疗方法；和

4.药物组合物和剂型

1.定义

在本说明书中使用的术语，在本公开的上下文和每个术语使用的特定上下文中，通常具有其在本领域中的普通含义。某些术语将在以下讨论，或在说明书的其他地方讨论，以便为实施者提供额外的指导，以描述本公开的组合物和方法，以及如何制作和使用它们。

如本文所使用，在权利要求和/或说明书中，当措辞“一”或“一种”与术语“包括”一起使用时，可以意味着“一种”，但也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或一种以上”的含义一致。此外，术语“具有”、“包含”、“含有”、和“包括”是可互换的，本领域技术人员认识到这些术语都是开放式的术语。

术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差之内。另外可选地，“约”可以表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、再更优选至多1％的范围。另外可选地，特别是关于生物系统或方法，该术语可以意指在数值的一个数量级、优选5-倍、更也有选2-倍之内。

如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段在本领域中也是公知的，并且在体外和体内均经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的免疫球蛋白分子，而且也指公知的活性片段F(ab')₂和Fab。缺少完整抗体Fc片段的F(ab')₂和Fab片段，从循环中清除得更快，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。本公开的抗体包括完整的天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是糖蛋白，其包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为V_H)和重链恒定(C_H)区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为V_L)和轻链恒定C_L区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H区和V_L区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

如本文中可互换地使用，术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合片段”或“抗原结合区”是指抗体的与抗原结合并赋予抗体抗原特异性的区域或部分；抗原结合蛋白质例如抗体的片段包括抗体的保持特异性结合抗原(例如，肽/HLA复合物)的能力的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗体片段”涵盖的抗原结合部分的实例包括Fab片段——由V_L、V_H、C_L和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段——包括两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,1989Nature341:544-546)，其由V_H结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。

“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国第4版，Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987)。如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的区域中的每一个，其序列变异度高(“互补决定区”或“CDR”)且/或形成结构上明确的回环(“高变回环”)且/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体在可变区中包括三个重链和三个轻链CDR或CDR区。CDR提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方式中，CDR(CDR1、CDR2和CDR3)通过Kabat法确定。

而且，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，使用重组方法，可以将它们通过合成的接头(linker)连接，上述合成的接头能够使它们成为单独的蛋白质链，其中V_L和V_H区配对并形成单价分子。这些片段称作单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等,1988Science242:423-426；和Huston等,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。这些抗体片段使用本领域普通技术人员已知的常规技术获得，并通过与完整抗体相同的方式对片段进行效用筛选。

如本文所用，术语“同种型”是指通过重链恒定区基因编码的抗体类别。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。额外的结构变化表征了不同小类的IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)和IgA(例如，IgAl和IgA2)。在某些实施方式中，抗GD2抗体是IgG抗体。在某些实施方式中，抗GD2抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，抗GD2抗体是IgG4抗体。

如本文所用，“特异性结合GD2”的抗体是指以5×10^-7M或更低、1×10^-7M或更低、5×10^-8M或更低、1×10^-8M或更低、5×10^-9M或更低、1×10^-9M或更低、5×10^-10M或更低、1×10^-10M或更低、5×10^-11M或更低或者1×10^-11M或更低的K_d结合GD2(例如，人GD2)的抗体。

序列同源性或序列同一性通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，1710University Avenue,Madison,Wis.53705，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)进行测量。这些软件通过将同源性程度分配给各种置换、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e^-3和e^-100之间的概率评分指示密切相关的序列。

如本文所用，术语“表位”是指抗原或多个抗原的与抗体相互作用的区域。肽或蛋白质或糖抗原的表位可以是线性的或者是构象的，或者可以由抗原的连续或非连续的氨基酸和/或糖序列形成。GD2分子，像许多碳水化合物一样，含有许多表位。

药剂的“有效量”是指在多个剂量下并以所必需的时间实现期望的治疗或预防结果例如治疗神经母细胞瘤的量。

如本文所用，术语“联合”是指使用一种以上的治疗剂。术语“联合”的使用并不限制将多种治疗剂施用给受试者的顺序。施用第一治疗剂可以是在施用给受试者第二治疗剂之前(例如，约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周之前)，同时，或者之后(例如，约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周之后)。

如本文所用，术语“化疗剂”是指化疗(例如，用于治疗癌症)中使用的分子(例如，化学药剂)。化疗剂的非限定性实例包括拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。

如本文所用，术语“拓扑异构酶I抑制剂”是指干扰拓扑异构酶I酶作用的药剂。

如本文所用，术语“烷化剂”是指能够形成将烷基转移至DNA的高反应性中间体化合物从而抑制癌细胞生长的药剂。

如本文所用，术语“受试者”可以是人或非人受试者，例如，但不限于，非人灵长类动物、狗、猫、马、啮齿动物、兔子等。成年的人受试者是年龄达到至少18岁或至少20岁的受试者。成年的非人受体是达到性成熟的受试者。并非成年的人受试者是儿科受试者。

如本文所用，“治疗”(及其语法变形例如“treat”或“treating”)是指试图改变所治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的期望作用包括，但不限于，延长存活、预防疾病的复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在某些实施方式中，使用本文所公开主题的抗体来延迟疾病的发展，或者减缓疾病例如神经母细胞瘤的进展。

2.联合疗法

本公开的主题提供治疗神经母细胞瘤(例如，复发性神经母细胞瘤和难治性神经母细胞瘤)的联合疗法。在某些实施方式中，联合疗法包括抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种(例如两种)化疗剂。

2.1抗GD2抗体

GD2是神经母细胞瘤中高度表达的肿瘤相关抗原，而在正常组织中高度限制表达。该表达谱使得抗GD2单克隆抗体适合于免疫疗法。两种抗GD2抗体家族3F8(Cheung等,Cancer Res(1985)；45,2642-9)和14.18(Mujoo等,Cancer Res(1989)；49,2857-61)已进入临床试验用于治疗神经母细胞瘤。

在某些实施方式中，抗GD2抗体是人源化抗体、嵌合抗体、鼠抗体或人抗体。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段不是14.18抗体。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段是3F8抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗GD2抗体是美国专利第9,315,585、9,688,772和10,287,365号和国际专利公开第WO2011/160119号中公开的嵌合3F8(ch3F8)或其抗原结合片段、人源化3F8(hu3F8)抗体或其抗原结合片段，在此将其全部内容并入作为参考。嵌合和人源化3F8抗体的非限定性实例包括ch3F8-IgGl、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1Ll-IgGl、hu3F8-H2L2-IgGl、hu3F8-H1L2-IgGl、hu3F8-H2Ll-IgGl、hu3F8-IgG4、hu3F8IgGln、hu3F8-IgGl-DEL、hu3F8HlLlS(hu3F8-IgGl轻链界面增强)、hu3F8H3L3(hu3F8-IgGl重链和轻链稳定性增强)、hu3F8H3L3S(界面和稳定性增强)、hu3F8Hl-I-γ-l(hu3F8-IgGl亲和性增强)、hu3F8H3-I-γ-l(hu3F8-IgGl稳定性和亲和性增强)及其片段和区域。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段是嵌合3F8抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域的重链可变区。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基31-35或其保守修饰物、SEQ IDNO:1的氨基酸残基50-64或其保守修饰物、和SEQ ID NO:1的氨基酸残基98-108或其保守修饰物。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-34或其保守修饰物、SEQ ID NO:2的氨基酸残基50-56或其保守修饰物、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基89-95或其保守修饰物。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列，轻链可变区包括与SEQID NO:2所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的ch3F8-IgGl。

在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的ch3F8-IgG4。

在某些实施方式中，嵌合3F8抗体的重链可变区包括构架区(FR)1(FR1)、2(FR2)、3(FR3)和4(FR4)，其中重链FR1、FR2、FR3和FR4分别包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-30或其保守修饰物、SEQ ID NO:1的氨基酸残基36-49或其保守修饰物、SEQ ID NO:1的氨基酸残基65-97或其保守修饰物、和SEQ ID NO:1的氨基酸残基109-120或其保守修饰物。在某些实施方式中，嵌合3F8抗体的轻链可变区包括FR1、FR2、FR3和FR4，其中轻链FR1、FR2、FR3和FR4分别包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-23或其保守修饰物、SEQ ID NO:2的氨基酸残基35-49或其保守修饰物、SEQ ID NO:2的氨基酸残基57-88或其保守修饰物、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基96-108或其保守修饰物。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段是人源化3F8抗体(“hu3F8抗体”)或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域的重链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-35或其保守修饰物、SEQ ID NO:4的氨基酸残基50-64或50-65或其保守修饰物、和SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108或其保守修饰物。在某些实施方式中，hu3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，hu3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:6的氨基酸残基31-35或其保守修饰物、SEQ ID NO:6的氨基酸残基50-64或其保守修饰物、和SEQ ID NO:6的氨基酸残基98-108或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:8的氨基酸残基31-35或其保守修饰物、SEQ ID NO:8的氨基酸残基50-64或其保守修饰物、和SEQ ID NO:8的氨基酸残基98-108或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基31-35或其保守修饰物、SEQ ID NO:11的氨基酸残基50-65或其保守修饰物、和SEQ ID NO:11的氨基酸残基98-108或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物、SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物、和SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物、SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物、和SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:7的氨基酸残基24-34或其保守修饰物、SEQ ID NO:7的氨基酸残基50-56或其保守修饰物、和SEQ ID NO:7的氨基酸残基89-95或其保守修饰物。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括：包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8-H1L1-IgGl。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括：包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括：包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8-H2L2-IgGl。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8-H1L1-IgG4。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体是效应子功能增强的用修饰的碳水化合物组成工程化的hu3F8。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8-IgG1n。在某些实施方式中，人源化3F8抗体在重链可变区中包括三重突变DEL。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8-IgG1-DEL或hu3F8-IgG1n。在某些实施方式中，在重链可变区，三重突变DEL由SEQ ID NO:4、6或8的置换S239D、A330L和1332E组成。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体通过计算分析晶体结构并且通过反突变和正向突变调整氨基酸序列以增强抗体的稳定性而得到的。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包括与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区，和/或包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体包括：包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，人源化3F8抗体是美国专利第9,315,585号中公开的hu3F8H3L3。

在某些实施方式中，人源化3F8抗体的轻链可变区包括额外的突变，以提高重链可变区和轻链可变区界面处的稳定性。在某些实施方式中，额外的突变是SEQ ID NO:10的置换Ala43Ser。在某些实施方式中，额外的突变是SEQ ID NO:5的置换Ala43Ser。在某些实施方式中，额外的突变是SEQ ID NO:7的置换Ala43Ser。

计算机模拟进一步表明，重链CDR3结构域中将位置54处的Gly置换成Ile可以改变结合口袋的形状，并增加与GD2配体的接触。在某些实施方式中，重链可变区包括SEQ IDNO:4中的Gly54Ile置换。

在某些实施方式中，重链可变区包括SEQ ID NO:6中的Gly54Ile置换。在某些实施方式中，重链可变区包括SEQ ID NO:8中的Gly54Ile置换。在某些实施方式中，重链可变区包括SEQ ID NO:9中的Gly54Ile置换。

在某些实施方式中，3F8抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，3F8抗体是IgG4抗体。SEQ ID No:1-11提供如下：

2.2造血生长因子

当与抗GD2抗体或其抗原结合片段(在其之前、之后或同时)一起给药时，造血生长因子可以提供协同作用。人源化3F8(“hu3F8”)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的联合疗法正在II期临床试验中进行测试。临床试验的前期结果显示，在继发的难治性神经母细胞瘤和在耐药性软组织疾病中，hu3F8和GM-CSF的联合疗法反应罕见(Kushner等,Advances in Neuroblastoma Research(20l6):Abs 57,2016)。

造血生长因子是生物分子，例如，天然的或人工制造的蛋白质。造血生长因子可以刺激造血前体细胞和免疫活性生成细胞(poietic cells)的存活和/或增殖，并且可以增加抗体依赖性细胞毒性。造血生长因子的非限定性实例包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。造血生长因子可以是天然的、自然的、重组的或者突变形式的造血生长因子。重组的和突变形式的GM-CSF或G-CSF可以如美国专利第5,391,485；5,393,870；5,229,496；4,810,643；4,999,291；5,528,823；和5,580,755号中所述制备，在此将其全部内容均并入作为参考。

本公开提供天然的、自然的和重组的造血生长因子的用途。本公开进一步提供自然的造血生长因子的突变体和衍生物(例如，修饰形式)，其在体内表现出至少一些的它们所基于的造血生长因子的药理活性。突变体的非限定性的实例包括具有一个或多个与自然形式的造血生长因子中的对应残基不同的氨基酸残基的造血生长因子，和缺少其自然形式(例如，非糖基化形式)中正常存在的碳水化合物部分的造血生长因子。衍生物的实例包括，但不限于，聚乙二醇化衍生物和融合蛋白。

可以将造血生长因子以抗癌疫苗的形式给药。例如，在本公开的方法、药学组合物和试剂盒中可以使用分泌细胞因子例如G-CSF和GM-CSF或者导致其分泌的疫苗。参见，例如，Emens,L.A.等,Curr.Opinion Mol.Ther.3(l):77-84(2001)。

在某些实施方式中，造血生长因子是GM-CSF。在某些实施方式中，造血生长因子是重组GM-CSF。在某些实施方式中，重组GM-CSF是沙格司亭

2.3化疗剂

当与抗GD2抗体或其抗原结合片段(例如，在其之前、之后或同时)一起给药时，化疗剂可以提供协同作用。

在某些实施方式中，化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂的非限定性实例包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱和片螺素D(lamellarin D)。

在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。伊立替康是具有以下化学名称的化合物：(S)-4,11-二乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基[1,4'-联吡啶]-1'-甲酸，其Chemical Abstracts登记号为100286-90-6，分子结构如下：

伊立替康是水溶性喜树碱衍生物，其通过结合负责切割和再连接DNA单链的拓扑异构酶I来中断DNA复制。伊立替康在细胞复制的DNA合成阶段针对特定的肿瘤细胞最有效，使其成为阶段敏感的药物。通过羧酸酯酶-2的伊立替康水解负责其活化成SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)——一种比伊立替康效价高得多的拓扑异构酶I抑制剂。伊立替康的主要失活途径是活性SN-38生物转化成无活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(SN-38G)。伊立替康治疗与显著毒性相关，包括严重腹泻、骨髓抑制和中性粒细胞减少。这些毒性可能是SN-38的代谢不足和排泄所致，上述SN-38在通过肾脏排泄之前主要在肝脏中通过UGT1A进行葡萄糖醛酸化。

在某些实施方式中，化疗剂是烷化剂。烷化剂的非限定性实例包括氮芥，例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑；亚硝基脲，例如链脲佐菌素、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀；烷基磺酸盐，例如白消安；三嗪，例如达卡巴嗪(DTIC)和替莫唑胺；和乙烯亚胺，例如噻替派和六甲密胺(六甲基三聚氰胺)。

在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。替莫唑胺是具有以下化学名称的化合物：3,4-二氢-3-甲基-4-氧代咪唑并[5,1-d]-as-四嗪-8-甲酰胺，其Chemical Abstracts登记号为85622-93-1，分子结构如下：

据悉替莫唑胺或其代谢物MTIC的细胞毒性主要是由于DNA的烷基化。烷基化(甲基化)主要在鸟嘌呤的O6和N7位上发生。替莫唑胺的剂量限制副作用包括血液学毒性、骨髓抑制、贫血和白细胞减少。

在某些实施方式中，本公开主题的联合疗法包括两种化疗剂。在某些实施方式中，两种化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。在某些实施方式中，两种化疗剂是伊立替康和替莫唑胺(称作“IT”)。

3.治疗方法

本公开提供治疗神经母细胞瘤，例如患有神经母细胞瘤的受试者的方法。在某些实施方式中，受试者之前治疗过神经母细胞瘤(例如，经过手术)，但是对标准疗法无反应。在某些实施方式中，神经母细胞瘤是难治性神经母细胞瘤。在某些实施方式中，受试者之前没有经过治疗。在某些实施方式中，神经母细胞瘤是复发性神经母细胞瘤。

本公开提供使用本文公开的联合疗法治疗神经母细胞瘤的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种本文公开的造血生长因子(例如沙格司亭)和至少一种(例如，两种)本文公开的化疗剂(例如，伊立替康和替莫唑胺)。在某些实施方式中，至少一种化疗剂选自拓扑异构酶I抑制剂、烷化剂及其组合。在某些实施方式中，该方法包括将抗GD2抗体或其抗原结合片段与造血生长因子、扑异构酶I抑制剂和烷化剂联合给药。在某些实施方式中，至少一种造血生长因子选自G-CSF、GM-CSF及其组合。在某些实施方式中，至少一种造血生长因子是GM-CSF。某些实施方式中，GM-CSF是沙格司亭。在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段是hu3F8抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗GD2抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基50-65或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基50-65或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQ IDNO:11的氨基酸残基50-65或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，所述方法包括施用抗GD2抗体或其抗原结合片段、沙格司亭、伊立替康和替莫唑胺，其中抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段可以单一的或分开的日剂量以约0.10-50mg/kg受试者/天的量施用。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段可以单一的或分开的日剂量以如下的量给药：约0.1、约0.5、约1.0、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50mg/kg受试者/天。在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段以单一的日剂量以约2-2.5mg/kg受试者/天的量施用给患者。在某些实施方式中，在某些实施方式中，抗GD2抗体或其抗原结合片段以单一的日剂量以约2.25mg/kg受试者/天的量施用给患者。另外可选地，给药剂量可以取决于多种已知因素而变化，例如，特定药剂的药效学特征以及其给药的方式和途径；接受者的年龄、健康和重量；症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗频率和所期望的效果。

可以使用单一灌注或重复剂量在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另外可选地或额外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中的至少一周，将抗GD2抗体或其抗原结合片段以本文公开的剂量施用给受试者。在某些实施方式中，可以将抗GD2抗体或其抗原结合片段隔天给药。在某些实施方式中，可以将抗GD2抗体或其抗原结合片段以4天的治疗周期给药。在某些实施方式中，可以将抗GD2抗体或其抗原结合片段在治疗周期的第2天、第4天、第8天和第10天给药。在某些实施方式中，治疗周期的时间是10天。

抗GD2抗体或其抗原结合片段可以通过胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、奥马耶囊内(intra-Ommaya)、眼内、玻璃体内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内(intraosteal)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或经皮方式给药。在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段静脉内(IV)给药。

在某些实施方式中，受试者患有难治性神经母细胞瘤。在某些实施方式中，受试者患有复发性神经母细胞瘤。

在某些实施方式中，将造血生长因子以约1至约750mg/m²/天、约25至约500mg/m²/天、约100至约400mg/m²/天或约150至约300mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将造血生长因子以约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、240、250、260、270、280、290或约300mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将造血生长因子以约250mg/m²/天的量给药。

在某些实施方式中，将造血生长因子皮下给药。在某些实施方式中，将造血生长因子以3、4、5、6、7、8、9、10天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将造血生长因子以5天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将造血生长因子在治疗周期的第1-5天给药。在某些实施方式中，治疗周期的时间是10天。

在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以约1至约100mg/m²/天、约10至约90mg/m²/天、约20至约80mg/m²/天、约30至约70mg/m²/天或约40至约60mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以约40、约45、约50、约55或约60mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以约50mg/m²/天的量给药。

在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂静脉内给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以3、4、5、6、7、8、9、10天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂以5天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂在治疗周期的第1-5天给药。在某些实施方式中，治疗周期的时间是10天。在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。

在某些实施方式中，将烷化剂以约1至约450mg/m²/天、约20至约400mg/m²/天、约60至约350mg/m²/天、约80至约300mg/m²/天、约100至约250mg/m²/天或者约120至约200mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将烷化剂以约130、约140、约150、约160、约170或约180mg/m²/天的量给药。在某些实施方式中，将烷化剂以约150mg/m²/天的量给药。

在某些实施方式中，将烷化剂静脉内或口服给药。在某些实施方式中，将烷化剂以3、4、5、6、7、8、9、10天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将烷化剂以5天的治疗周期给药。在某些实施方式中，将烷化剂在治疗周期的第1-5天给药。在某些实施方式中，治疗周期的时间是10天。在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。

在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂同时给药。在某些实施方式中，将拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂在10天的治疗周期中的第1-5天同时给药，其中将拓扑异构酶I抑制剂以约50mg/m²/天的量静脉内给药，将烷化剂以约150mg/m²/天的量口服或静脉内给药。

在某些实施方式中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。在某些实施方式中，烷化剂是替莫唑胺。

在某些实施方式中，将抗GD2抗体或其抗原结合片段、造血生长因子和化疗剂在临床上施用给患者。循环疗法包括施用活性药剂一段时间，之后休息一段时间，并重复该序贯给药。循环疗法可以减少对一种或多种疗法的耐受性的发展，避免或减小疗法中的一种的副作用，和/或提高治疗功效。在某些实施方式中，一个循环之后停止治疗，因为受试者无法忍受治疗药剂相关的副作用和毒性。

在某些实施方式中，循环数是1至24个循环。在某些实施方式中，循环数是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在某些实施方式中，循环的持续时间是约6天至约15天。在某些实施方式中，循环的持续时间是约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。

在某些实施方式中，每个循环之后是休息期，其中不向受试者施用抗GD2抗体或其抗原结合片段、造血生长因子和化疗剂。在某些实施方式中，休息期是约2周至约6周、约3周至约5周、约4周至约6周。在某些实施方式中，休息期是约3周、约4周、约5周或约6周。本公开还允许调节给药循环和休息期的频率、数量和长度。

4.药物组合物

本发明提供用于治疗神经母细胞瘤的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物包括抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种(例如，两种)化疗剂。药物组合物可以用于单独的单一单位剂型的制备。药物组合物可以进一步包括一种或多种药学可接受的赋形剂。

本文公开的药物组合物可以进一步包括至少一种合适的辅助剂，例如，但不限于，稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。药学可接受的载体可以常规选择成适合于抗GD2抗体、化疗剂和造血生长因子的给药方式、溶解度和/或稳定性。

可用于本公开组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，单独地或组合地占重量或体积的1-99.99％。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力中发挥作用的代表性氨基酸/抗体成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺等。适合用于本公开的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉籽糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；和糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。

本文公开的药物组合物还可以包括缓冲剂或pH调节剂；典型地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、盐酸三羟甲基氨基甲烷(tromethaminehydrochloride)、或磷酸缓冲液。

此外，本文公开的药物组合物可以包括聚合物赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯尔(ficolls)(一种聚合的糖)、葡萄糖结合剂(dextrates，例如，环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。

这些和其他的适合于本文公开的药物组合物的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域公知的，例如，如下文献中所列的：“Remington:The Science&Practice ofPharmacy”,19.sup.th ed.,Williams&Williams,(1995)；“Physician's DeskReference”,52.sup.nd ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)，在此将其全部内容并入作为参考。

实施例

本公开的主题参考以下实施例可以更好地理解，这些实施例仅仅是作为本公开的主题的示例，绝非是进行限定。

实施例1：使用Hu3F8、伊立替康/替莫唑胺和沙格司亭联合疗法的用于高风险神经母细胞瘤的化学免疫疗法

本研究考察称作“HITS”的Hu3F8抗体与伊立替康和替莫唑胺(IT)和沙格司亭(GM-CSF)的联合在具有耐药性神经母细胞瘤的患者中的安全性和有效性，上述Hu3F8抗体包括：包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。本研究还评价了具有神经母细胞瘤的患者中对HITS的肿瘤反应，评价了hu3F8的药代动力学。患者根据以下对于每个周期所概括的方案接受治疗。

表1：治疗方案

每周对患者进行监测毒性，前两个周期之后监测反应性，然后每三个后继周期检测反应性。如果入选，患者可以每4-6周接受周期多达两年。

本研究还评价了用HITS治疗的患者中的NK细胞激活，并评价了接受HITS的患者中的血清细胞因子。已知NK细胞对于引发用3F8(Yenstrom等,Clin Cancer Res 15:7330-4,2009)和免疫细胞因子hu14.18-IL2(Delgado等,Cancer Res 70:9554-61,2010)二者均观察到的抗神经母细胞瘤活性而言至关重要。为了考察IT和抗GD2抗体的机制，本研究评价了IT之前、hu3F8之前和hu3F8之后的NK细胞激活。对经由CD107a表达和细胞内干扰素-γ(IFN-γ)释放的NK细胞激活进行了评估。此外，测量了血液中涉及抗肿瘤细胞毒性的细胞因子，包括白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)。检验使用可获得的经临床验证的检验进行。

本研究进一步评价了血液中循环的无细胞的肿瘤RNA(cfRNA)vs.骨髓(BM)中的结合肿瘤细胞的RNA中的MRD变化。之前经阐明，使用qRT-PCR的结合细胞的RNA的BM MRD在所有疾病阶段中(即，首次CR/VGPR中的患者，具有原发难治性疾病的患者和二次缓解中的患者)对于3F8+GMCSF免疫疗法的临床结果具有高度预测性(Cheung IY等,J Clin Oncol 21:3853-8,2003)。之前的研究中已使用4个基因的MRD标志物组：细胞周期因子Dl(CCND1)、ISLLIM同源盒1(ISL1)、成对样同源盒2b(PHOX2B)和GD2合成酶(B4GALNT1)。但是，BM检验是要求镇静的侵入性方法，具有其伴随风险以及并发症(例如疼痛和挫伤)。提取自血液的结合细胞的RNA的qRT-PCR不如来自BM的RNA有预测性。本研究在正在测量BM MRD时的时间点测量了血液中上述4个基因的循环cfRNA。可以使用血液cfRNA中的肿瘤相关转录物用于转移性神经母细胞瘤的非侵入性监测。

研究设计/干预

患者接受以上表1中所述的治疗。至少每周一次对他们进行毒性评价。如果患者接受至少一剂伊立替康、替莫唑胺和hu3F8中的每一种，患者是毒性可评价的。如果患者没有经历显著的毒性迫使治疗停止，则患者从伊立替康/替莫唑胺结束起约21-35天接受第二周期。两个周期之后进行疾病程度评价，如果没有进行性疾病，并且没有观察到显著毒性，患者可以接受HITS疗法多达2年。相关研究包括NK细胞激活、细胞因子释放、BM MRD和循环cfRNA的评估。

每个周期的方案如表2中所示。该研究中对14名患者进行了研究。如果患者遭受进行性疾病(PD)或主要毒性，则将患者从研究中移除。

简言之，每个周期由4剂hu3F8、5剂伊立替康和替莫唑胺中的每一种和5剂GM-CSF组成(表1)。第1-5天在口服替莫唑胺l50 mg/m²/天的同时经IV施用伊立替康50mg/m²/天。在第2、4、8和10天经IV施用Hu3F8 2.25mg/kg。在第6-10天经SC施用GM-CSF 250mg/m²/天。

表2：每个周期的方案

*替莫唑胺可以由PI酌情经IV给予。

**抽血用于NK细胞激活和细胞因子释放仅在第1周期期间进行

毒性监测：患者处于研究中时毒性的临床观察是在每周的门诊患者来访时进行。患者处于研究中时至少每周进行肝肾功能生化检验和全血细胞计数。

肿瘤反应：前两个周期之后以及每三个后续周期之后对疾病状态进行评价。如果可行，一个周期之后退出研究的患者仍进行疾病状态的评价。

NK细胞激活和细胞因子释放：在第1周期期间抽血时评估。在治疗之前、第一剂hu3F8之前(第2天)和最后一剂hu3F8之后(第10天)验血。

结合BM细胞的RNA和循环血cfRNA在第1周期之前以及在每个疾病程度评价时进行评估。

人抗人抗体反应(HAHA)滴度：在每个周期之后以及在治疗结束时使用已确立的ELISA检验来检验。

第2周期资格：如果患者满足所有以下要求，则患者可以接受第二周期：

·阴性HAHA滴度，定义为≤1300Elisa单位/ml。

·已经从骨髓抑制(如果有的话)恢复，其定义为不依赖输血，ANC＞500，血小板>35,000。

·从治疗开始起≤第40天，已经从骨髓抑制恢复。

·从研究起没有经历过任何显著的毒性迫使的移除。

如果患者发展出阳性HAHA滴度，他们可以继续接受使用利妥昔单抗和环磷酰胺的IT±HAHA逆转疗法，直至HAHA滴度变成阴性。在HAHA变成阴性之后，患者可以重新开始hu3F8。先前周期的最后一剂伊立替康/替莫唑胺之后的至少21天至最多35天，才可以开始后续的周期。

第2周期以外继续治疗的资格：如果患者满足所有接受第二周期的标准(如上文所定义)并且如果患者不具有PD，则患者可以继续治疗。如果患者发展出阳性HAHA滴度，他们可以继续接受使用利妥昔单抗和环磷酰胺的IT±HAHA逆转疗法，直至HAHA滴度变成阴性。

用于该研究的治疗/诊断剂

人源化单克隆抗体hu3F8-IgGl

Hu3F8-IgGl是IgG1亚类的人源化抗体。制造最终产品，将其配制，并检验其身份、纯度、效力、无菌性、内毒素和稳定性。将纯化的抗体hu3F8在25mM柠檬酸钠/氯化钠缓冲液中以2mg/ml或1.7mg/ml在玻璃小瓶中在-20℃下冷冻存储。对于IV使用，hu3F8应当在环境温度下解冻，并在5％人血清白蛋白中稀释。使用之前每一剂均进行Millipore(0.22pm)过滤。

沙格司亭(酵母来源的人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；GM-CSF)

沙格司亭可以如下形式获得：250mcg一次性小瓶的不含防腐剂的白色无菌冻干粉，或者500mcg/1mL的注射液。

250mcg小瓶要求用0.5mL注射用无菌水USP(无防腐剂)进行无菌重构。在重构过程中，注射用无菌水USP应导向小瓶的侧面，内容物轻轻旋流，以避免溶解过程中起泡。重构的沙格司亭溶液是澄清的、无色的、等渗的，pH为7.4±0.3，含有500mcg/mL沙格司亭。一次性的250mcg小瓶不含抗菌防腐剂，因此应当尽快给药，在重构后的6小时内。上述小瓶仅用于一次性使用，不应重新加入或重新使用。含有500mcg/l mL沙格司亭的小瓶已是溶液形式，是多剂量小瓶。用于皮下给药，不需要进一步稀释。一经进入小瓶，液体沙格司亭在2-8℃下可以存储多达20天。

所有沙格司亭溶液的制备均应采用无菌技术。为了确保重构后的浓度正确，应小心消除用于配制稀释剂的注射器针头接口上的任何气泡。在给药前，只要溶液和容器允许，应目测检查注射用药物产品的颗粒物质和变色情况。

伊立替康(Camptosar，CPT-11)

三水盐酸伊立替康(CPT-11)是拓扑异构酶I抑制剂。该药物以两种形式供应：含有40mg药物的2mL小瓶和含有100mg药物的5mL小瓶。药物供应在棕色小瓶中，呈浅黄色至黄色晶体粉末，重构时呈浅黄色透明溶液。

将伊立替康用D5W稀释至总体积500ml，用60分钟IV灌注。

替莫唑胺(Temodar)

替莫唑胺是咪唑并四嗪酮类烷化剂。替莫唑胺是口服给药或静脉内给药的。替莫唑胺在口服给药后被迅速完全吸收；1小时内达到血浆浓度峰值。替莫唑胺以1.8小时的平均消除半衰期迅速消除，并在治疗剂量范围内表现出线性动力学。替莫唑胺的平均表观分布容积为0.4L/kg(％CV＝13％)。它与人血浆蛋白质弱结合；平均百分比结合的药物相关总放射性为15％。

代谢和消除：替莫唑胺在生理pH下自发水解成活性种类：3-甲基-(三氮烯-l-基)咪唑-4-甲酰胺(MTIC)，和替莫唑胺酸性代谢物。MTIC进一步水解成已知作为嘌呤和核酸生物合成中间体的5-氨基-咪唑-4-甲酰胺(AIC)，和据信作为活性烷化种类的甲基肼。细胞色素P450酶在替莫唑胺和MTIC的代谢中仅发挥次要作用。相对于替莫唑胺的AUC，暴露于MTIC和ACI分别为2.4％和23％。施用的替莫唑胺总放射性剂量的大约38％在7天内回收；37.7％在尿液中，0.8％在粪便中。尿液中大多数回收的放射性是作为未变化的替莫唑胺(5.6％)、AIC(12％)、替莫唑胺酸性代谢物(2.3％)和未识别的极性代谢物(17％)。替莫唑胺的整体清除率为约5.5L/hr/m²。

受试者资格的标准

受试者入选标准

神经母细胞瘤的诊断如国际标准所定义，即，组织病理学或骨髓转移加高尿儿茶酚胺水平(Brodeur等,J Clin Oncol 11:1466-77,1993)。

高风险神经母细胞瘤如以下任意者所定义：

·具有MYCN扩增的4期(任何年龄)

·没有MYCN扩增的4期(年龄>1.5岁)

·具有MYCN扩增的3期(不可切除；任何年龄)

·具有MYCN扩增的4S期(任何年龄)

患者必须具有在标准的高剂量诱导化疗之后肿瘤进展或复发或不能取得完全反应的病史。患者必须具有在完成之前的全身治疗之后记录的可评估的(微观骨髓转移、升高的肿瘤标志物、阳性MIBG或PET扫描)或可测量(CT、MRI)的疾病。容许之前用鼠和hu3F8的治疗。允许之前用伊立替康或替莫唑胺的治疗。之前用m3F8、hu3F8、ch14.18或hu14.18治疗的患者，HAHA抗体滴度必须≤1300Elisa单位/ml。容许人抗鼠抗体阳性。签署知情同意书表示知晓本项目的研究性质。

受试者排除标准

具有CR/VGPR疾病的患者；存在严重的主要器官功能障碍，即肾、心、肝、神经、肺或胃肠道毒性>3级，TPN引起的听力丧失、脱发、厌食、恶心和低镁血症(其可以是3级)除外；ANC<500/μL；血小板计数<35K/μL；小鼠蛋白质过敏史；活跃的危及生命的感染；无法遵守协议要求；怀孕或哺乳期妇女。

治疗/干预计划

患者接受如上表1所述的治疗。至少每周一次对患者进行毒性评价。如果患者接受至少一剂伊立替康、替莫唑胺和hu3F8中的每一种，患者是毒性可评价的。如果患者没有经历显著的毒性，则患者在第一周期之后4-6周接受第二周期。两个周期之后进行疾病程度评价；如果没有进行性疾病，并且患者没有经历显著的毒性，患者可以接受联合疗法多达2年。每三个后继周期之后评估反应。相关研究包括NK细胞激活、细胞因子释放、BM MRD(结合细胞的RNA)和血液MRD(cfRNA)的评估。每个周期的方案在上文中如表2中所示。

将伊立替康用60±15分钟作为IV输注剂给药。必要时可以施用止吐剂。

将替莫唑胺口服给药。调整替莫唑胺的剂量，使得它可以使用现有的胶囊，即四舍五入到最近的5mg给药。患者可以接受相同剂量的IV替莫唑胺。输注速度按照护理标准。

将Hu3F8用～30-90分钟IV给药。不允许减少剂量。为了调节hu3F8引起的疼痛，患者先服用镇痛剂(例如，二氢吗啡酮)和抗组胺剂(例如，苯海拉明或羟嗪)。在与GM-CSF共同给药的天数，hu3F8在GM-CSF后～30-90分钟开始。

将GMCSF皮下给药。

在开始治疗之前以及在第2天(hu3F8之前)和第10天(hu3F8之后)抽血。使用之前所述的方法进行NK细胞激活和细胞因子释放(IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ)的检验。NK细胞激活和细胞因子释放仅在第1周期期间研究。

在开始治疗之前以及在每个疾病程度的评价时研究BM MRD和血液MRD。使用之前确立的技术在合并的肝素化BM样本上研究BM MRD。在从Streck管中收集的外周血样本中提取并分析的无细胞RNA上研究血液MRD。

如果患者满足所有以下要求，则患者有资格接受第二周期化疗：

·阴性HAHA滴度。

·已经从骨髓抑制(如果有的话)恢复，其定义为ANC＞500且血小板>35,000。

·从治疗开始≤40天，已从骨髓抑制中恢复。

·没有经历过任何迫使从研究中移除的显著毒性(如第9.12节所定义的)。

如果患者发展出阳性HAHA滴度，他们可以继续接受使用利妥昔单抗和环磷酰胺的IT±HAHA逆转疗法，直至HAHA滴度变成阴性。先前周期的最后一剂伊立替康/替莫唑胺之后的至少21天且最多35天，才可以开始第二和后续的周期。

在第二周期的最后一剂伊立替康/替莫唑胺之后的约21-35天评价为不具有疾病进展、并且继续满足上文定义的资格标准的患者，可以接受进一步的HITS周期。在前两个周期之后进行疾病程度的评价，然后每三个周期进行疾病程度的评价。先前周期的最后一剂伊立替康/替莫唑胺之后的至少21天且最多35天，才可以开始后续的周期。

当ANC<500μ/L时，可以使用G-CSF(5-l0μg/kg)。

对于特定的患者，以下毒性迫使治疗中止。

·4级毒性，骨髓抑制(及其后遗症，即血小板减少相关的出血、发热性中性粒细胞减少和感染)以外，明显可归因为HITS。

·先前周期的第一剂IT的35天以内，3级毒性应当减退至≤2级，以便继续治疗。

治疗/干预过程中的评价

治疗过程中进行以下评价。

毒性/副作用

不良事件是指暂时地与使用医学治疗或过程相关的任何不利的或非预期的征兆(包括实验室发现的异常)症状或疾病，无论其是否被视为与该医学治疗或过程有关(归因为不相关、不可能、可能、很可能或明确)。在第1周期中，所有观察到的不良事件，无论治疗组或与研究药物的因果关系存疑者均加以记录。在随后的周期中，仅记录≥3级的预期毒性和≥2级的未预期毒性。不良事件的鉴别和评级使用美国国家癌症研究所(the NationalCancer Institute，NCI)开发的NCI常见毒性标准(NCI Common Toxicity Criteria)4.0版本。接下来确定不良事件是否与药物治疗相关(归因)。严重不良事件(SAE)。

与伊立替康相关的毒性

常见/预期：可导致脱水的腹泻、腹部绞痛、恶心和呕吐、厌食和体重减轻、便秘、出汗和潮红、脱发、衰弱、骨髓抑制、发热、粘膜炎、咳嗽、呼吸困难、皮疹和流泪和出汗，其作为胆碱能介导综合征一部分的。

偶发：变态反应、过敏反应、血栓形成。

罕见：间质性肺病、肾毒性、肝毒性、胃肠道出血、输注部位的局部刺激。

允许患者接受减轻伊立替康所诱发腹泻严重程度的治疗，包括抗生素或阿托品、活性炭、洛哌丁胺、阿托品和地芬诺酯。

与替莫唑胺相关的毒性

常见/预期：恶心、呕吐、厌食、便秘、腹泻、疲劳、骨髓抑制、脱发、无力、瘫痪。

偶发：头痛、肝毒性。

罕见：变态反应、机会性感染、继发恶性肿瘤、皮疹、再生障碍性贫血。

与hu3F8相关的毒性

常见/预期：疼痛、高血压、低血压、心动过速、荨麻疹、发热、恶心、呕吐、嗜睡。

偶发：血清疾病、咳嗽或喘息、腹泻、低钠血症、周围神经病变、视力调节受损、瞳孔对光反应差、转氨酶升高、气道收缩、感觉异常。

罕见：过敏反应和可逆性后部脑病综合征(PRES)。

与GM-CSF相关的毒性

常见/预期：骨痛、注射部位局部反应、注射后不久白细胞减少、和血小板计数减少。

偶发：发热、潮红、变态反应。

罕见：体重增加、胸腔或心包积液、心包栓塞、血栓形成、和第一次注射后呼吸困难。

毒性仅在最后一次治疗后直至30天或患者开始新的治疗前(以较早的时间为准)捕获。

治疗反应/结果评估标准

反应持续时间从用IT治疗的第一天起计算。如果在任何时间进行性疾病均明显，则认为患者在该方案下没有反应。

神经母细胞瘤的疾病反应使用国际神经母细胞瘤反应标准(the Internationalneuroblastoma Response Criteria，INRC)(Brodeur等,J Clin Oncol 11:1466-77,1993)，在此将其全文并入本公开作为参考：

■完全反应/缓解(CR)：无疾病证据。

■非常好的部分反应/缓解(VGPR)：所有疾病参数降低>90％，骨扫描不变或改善除外；骨髓必须无疾病。

■部分反应/缓解：所有疾病参数降低>50％，骨扫描不变或改善除外；阳性BM部位<1。

■混合反应：>1但并非全部的疾病标志物降低>50％

■疾病稳定：所有肿瘤标志物降低<50％。

■进行性疾病：新的病变，或者任意疾病标志物增加>25％。

试验充分性：所有满足资格要求并且接受一剂hu3F8治疗的患者均视为毒性可评价。

从研究中移除的标准

如果患者在任何时候有进行性疾病，并且从最后一次治疗起30天或直至他们开始新的治疗(以较早的为准)，在退出研究之前，患者停止治疗。使用最好的临床判断来确定患者是否必须在周期之间进行测试，以确保疾病没有在进展。如果患者有明显归因于HITS治疗的4级毒性(骨髓抑制以外)，则停止治疗。

药物治疗的研究出于以下原因中止：

■不良事件，包括不可接受的毒性或基础疾病的恶化，与研究药物的给药相关，并迫使治疗中止。由于不良事件而从研究中移除的患者将根据既定的、可接受的医疗惯例进行治疗和随访。所有与此类治疗结果相关的信息均录入MSKCC机构临床研究数据库(theMSKCC institutional Clinical Research Database，CRBD)。跟踪患者，直至不良事件解决或稳定。

■撤回知情同意书。患者从研究中撤出的意愿任何时候均可能发生。

■在没有不良事件的情况下由医师出于与研究药物无关的原因退出。

■违反研究方案，包括不能返回进行治疗或评估。如果错过多于一个的预定剂量，则将不能返回治疗的患者从研究中退出。

生物统计学

这是一项关于伊立替康和替莫唑胺(IT)联合hu3F8和GM-CSF治疗耐药性神经母细胞瘤的研究。如果在前两个周期中至少有9/10的患者没有需要停止治疗的毒性，则该方案被认为是安全的。观察1/10的毒性，导致毒性率的95％置信区间为(0.005,0.4)。如果真正的毒性率是5％，则看到0或1毒性的概率为91％，看到2或更多毒性的概率为9％。如果真正的毒性率是10％，则看到0或1毒性的概率为74％，看到2或更多毒性的概率是26％。如果真正的毒性率是20％，则看到0或1毒性的概率为38％，看到2或更多毒性的概率为62％。

为使该方案被认为是安全的，要求9名患者在不因为毒性停止治疗的情况下完成两个周期。如果患者在前两个治疗周期由于其他原因例如进行性疾病或自我移除(包括由于DLT外的毒性而自我移除)而退出研究，他们将被替换成安全评估。如果患者具有DLT，则他们退出治疗方案，并且不被替换。

次要和探索性终点包括反应率、hu3F8的药代动力学、NK细胞激活水平、血清细胞因子以及骨髓中的无细胞RNA和MRD状态的变化。药代动力学测量结果、NK细胞激活和血清细胞因子水平以概括统计学分析，包括平均值、中位数和标准差。达到CR、VGPR或PR的患者被认为有过反应。在反应评价中考虑任何点的最佳反应。反应率和在cfRNA和肿瘤RNA之间MRD状态一致的患者的比例概括为具有相应的95％置信区间的比例。累积率预期为两个月1例患者。

实施例2：耐药性高风险神经母细胞瘤的基于Hu3F8的化学免疫疗法：HITS试点/II期多中心研究的初步结果

化疗耐药和复发性疾病是治愈高风险神经母细胞瘤(HR-NB)的主要障碍。抗GD2单克隆抗体(MoAb)可以有效地预防缓解后复发。然而，复发性或进行性疾病(PD)的反应可能很罕见。本实施例研究了人源化抗GD2 MoAb Hu3F8抗体(其包括根据序列ID NO.11的重链和根据序列ID No.5的轻链)、伊立替康、替莫唑胺和沙格司亭的联合(HITS)用于治疗HR-NB。沙格司亭是重组的人GM-CSF。针对耐药HR-NB的试点HITS方案现已扩展到II期多中心研究(NCT03189706)。

显著的资格标准包括具有可评估或可测量的耐化疗疾病。允许有之前的抗GD2MoAb和/或伊立替康/替莫唑胺(I/T)治疗。每个周期包括伊立替康50mg/m²/天静脉内(IV)加替莫唑胺150mg/m²/天IV或口服(第1-5天)；30分钟的Hu3F8抗体2.25mg/kg/天IV(第2、4、8和10天)；和GM-CSF 250mg/m²/天皮下(第6-10天)。通过不良事件常用术语标准(CTCAE)v4.0评估毒性，并通过改进的国际神经母细胞瘤反应标准(International NeuroblastomaResponse Criteria)评估反应。

29例接受过严格治疗的患者接受了99个(范围1-9)周期。其中，15例纳入方案，14例纳入同情/单一患者使用基础。患者入组时的中位数年龄为86.9个月，之前复发的中位数为2。入组时，4例患者具有诱导化疗难治性HR-NB，而25例患者具有之前的复发。毒性包括I/T所预期的骨髓抑制和腹泻，Hu3F8抗体所预期的疼痛和高血压。没有发生其他的>2级的相关毒性；门诊治疗。记录有14例(48％)患者2个周期后评估的反应，其中6例完全反应，6例部分反应，2例是混合的。5例患者具有稳定的疾病。反应在难治性(2/4；50％)和PD(12/25；48％)亚组中均得以实现。反应在之前接受过I/T(11/20；55％)和/或抗GD2 MoAb(10/19；53％)的患者中也得以实现。在软组织(4/16；25％)和骨髓(osteomedullary)部位(11/24；45％)中均观察到反应。

该实施例表明，该基于高剂量Hu3F8抗体的化学免疫疗法是安全的，针对化疗耐药的HR-NB是有效的。

实施例3：耐药性高风险神经母细胞瘤的基于Hu3F8的化学免疫疗法：“HITS”试点/II期研究的初步结果

化疗耐药和复发性疾病是治愈高风险神经母细胞瘤(HR-NB)的主要障碍。抗GD2单克隆抗体(MoAb)有效地预防缓解后复发，但是在复发性或进行性疾病(PD)中反应罕见。我们考察了人源化抗GD2MoAb Hu3F8抗体(其包括根据序列ID NO.11的重链和根据序列IDNo.5的轻链)、伊立替康、替莫唑胺和沙格司亭(GM-CSF)的联合：针对耐药HR-NB的试点“HITS”方案现已扩展到II期研究(NCT03189706)。

显著的资格标准包括具有可评估或可测量的耐化疗疾病。允许有之前的抗GD2MoAb和/或伊立替康/替莫唑胺(I/T)治疗。每个周期包括伊立替康50mg/m²/天静脉内(IV)加替莫唑胺150mg/m²/天IV或口服(第1-5天)；30分钟的Hu3F8抗体2.25mg/kg/天IV，第2、4、8和10天(共计9mg/kg)；和GM-CSF 250mg/m²/天皮下，第6-10天。通过CTCAEv4.0评估毒性，通过INRC评估反应。

46例(23例纳入方案；23例纳入同情-使用基础)接受过严格治疗的患者(入组时的中位数年龄：6.6岁；之前复发的中位数：2)接受了175个(中位数2；范围1-19)周期。入组时，7例患者具有诱导化疗难治性HR-NB，而39例具有之前的复发。毒性包括I/T所预期的骨髓抑制和腹泻，Hu3F8抗体所预期的疼痛和高血压。没有发生其他的>2级的相关毒性；门诊治疗。记录有18例(39％)患者(完全反应，n＝9；部分反应，n＝8；混合反应，n＝1)2个周期后评估的早期反应，其中13例患者具有稳定的疾病。反应在难治性(3/7；43％)和PD(15/39；38％)亚组中；在之前接受过I/T(12/34；35％)和/或抗GD2 MoAb(14/36；39％)的患者中；以及在软组织(6/22；27％)、MIBG-avid骨骼部位(20/36；56％)中以及在骨髓组织学(9/12；75％)上均得以实现。

尽管已对本文公开的主题及其优势加以详述，但应当理解到，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以在此进行各种改变、替换和变更。而且，无意于将本申请的范围限于说明书中所述的方法、设备、制造和物质的组成、方式、方法和步骤的具体实施方式。从本公开主题的发明，本领域普通技术人员将很容易认识到，现有的或者后来开发的与本文所述的相应实施方式发挥基本上相同的功能或者实现基本上相同的结果的方法、设备、制造、物质的组成、方式、方法或步骤，均可以根据本公开的主题加以应用。因此，所附权利要求意图在其范围内包括这些方法、设备、制造、物质的组成、方式、方法或步骤。

在本申请中引用了各个专利、专利申请、出版物、产品说明、协议和序列编号，在此将其发明出于所有目的全文并入作为参考。

序列表

<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心

<120> 联合疗法治疗神经母细胞瘤的方法

<130> 072734.0931

<150> US 62/721,433

<151> 2018-08-22

<160> 11

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

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Lys

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<211> 211

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

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20 25 30

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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

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Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

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180 185 190

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210

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

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100 105 110

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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

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290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

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Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

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405 410 415

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420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 5

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

100 105 110

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

130 135 140

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

145 150 155 160

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

165 170 175

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

180 185 190

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

195 200 205

Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

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210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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<210> 7

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly

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Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Tyr Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly

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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

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Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

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195 200 205

Gly Glu Cys

210

<210> 8

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

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Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

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275 280 285

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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

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<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 10

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

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Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr

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Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

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260 265 270

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275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

Claims

1.一种治疗受试者中神经母细胞瘤的方法，其包括向所述受试者施用抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种化疗剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述抗GD2抗体是人源化3F8(hu3F8)抗体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述至少一种造血生长因子选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述GM-CSF是重组GM-CSF。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述重组GM-CSF是沙格司亭。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种化疗剂选自拓扑异构酶I抑制剂、和烷化剂及其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其包括两种化疗剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述两种化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述烷化剂是替莫唑胺。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中将所述抗GD2抗体或其抗原结合片段以约2.25mg/kg/天的量给药。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中将所述抗GD2抗体或其抗原结合片段静脉内给药。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中将所述造血生长因子以约250mg/m²/天的量给药。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将所述造血生长因子皮下给药。

19.根据权利要求10-18中任一项所述的方法，其中将所述拓扑异构酶I抑制剂以约50mg/m²/天的量给药。

20.根据权利要求10-19中任一项所述的方法，其中将所述拓扑异构酶I抑制剂静脉内给药。

21.根据权利要求10-20中任一项所述的方法，其中将所述烷化剂以约150mg/m²/天的量给药。

22.根据权利要求10-21中任一项所述的方法，其中将所述烷化剂口服或静脉内给药。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中将所述抗GD2抗体或其抗原结合片段、所述至少一种造血生长因子和所述至少一种化疗剂循环给药。

24.根据权利要求23所述的方法，其中循环数是1至24个循环。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中一个循环包括在所述循环中在四天施用所述抗GD2抗体或其抗原结合片段。

26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述循环中将所述抗GD2抗体或其抗原结合片段在第2天、第4天、第8天和第10天给药。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中一个循环包括在所述循环中施用所述至少一种造血生长因子5天。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在所述循环中将所述至少一种造血生长因子在第6-10天给药。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中一个循环包括在所述循环中在5天施用所述至少一种化疗剂。

30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中在所述循环中将所述至少一种化疗剂在第1-5天给药。

31.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中一个循环包括在所述循环中在5天施用所述至少一种化疗剂。

32.根据权利要求23-31中任一项所述的方法，其中每个循环的持续时间是10天。

33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中每个循环之后是休息期。

34.根据权利要求33所述的方法，所述休息期是约3周至约5周。

35.根据权利要求33或34所述的方法，所述休息期是约4周至约6周。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述神经母细胞瘤是难治性神经母细胞瘤、复发性神经母细胞瘤或者难治性和复发性神经母细胞瘤。

37.一种组合物，其包括抗GD2抗体或其抗原结合片段、至少一种造血生长因子和至少一种化疗剂。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-95或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。

39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-35或其保守修饰物的重链可变区CDR1、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基50-65或50-64或其保守修饰物的重链可变区CDR2、包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4的氨基酸残基98-108或其保守修饰物的重链可变区CDR3、包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基24-34或其保守修饰物的轻链可变区CDR1、包括SEQID NO:5的氨基酸残基50-56或其保守修饰物的轻链可变区CDR2、和包括SEQ ID NO:5的氨基酸残基89-94或其保守修饰物的轻链可变区CDR3。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的组合物，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的轻链可变区。

41.根据权利要求37-40中任一项所述的组合物，其中所述抗GD2抗体或其抗原结合片段包括：包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包括SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

42.根据权利要求37-41中任一项所述的组合物，其中所述抗GD2抗体是人源化3F8(hu3F8)抗体。

43.根据权利要求37-42中任一项所述的组合物，所述至少一种造血生长因子选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述GM-CSF是重组GM-CSF。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述重组GM-CSF是沙格司亭。

46.根据权利要求37-45中任一项所述的组合物，其中所述至少一种化疗剂选自拓扑异构酶I抑制剂、和烷化剂及其组合。

47.根据权利要求37-46中任一项所述的组合物，其包括两种化疗剂。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述两种化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂和烷化剂。

49.根据权利要求45-48中任一项所述的组合物，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康。

50.根据权利要求45-49中任一项所述的组合物，其中所述烷化剂是替莫唑胺。

51.根据权利要求37-50中任一项所述的组合物，其用于治疗神经母细胞瘤。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述神经母细胞瘤是难治性神经母细胞瘤、复发性神经母细胞瘤或者难治性和复发性神经母细胞瘤。

53.根据权利要求37-52中任一项所述的组合物，其是还包括药学上可接受的载体的药物组合物。

54.根据权利要求37-53中任一项所述的组合物，其用于治疗神经母细胞瘤。

55.根据权利要求37-54中任一项所述的组合物在制造用于治疗神经母细胞瘤的药物中的用途。