CN112876467B - Fxr受体激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及式(I)所示的FXR受体激动剂化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，R1、X1、X2、M、Ar、环A、环B、L如说明书中所定义；本发明还涉及所述化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体的制备方法、含有所述化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体的药物组合物和药物制剂，及所述化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体在用于制备治疗和/或预防由FXR受体介导的疾病的药物中的应用，

Description

FXR受体激动剂
本申请是申请日为2018年7月6日、申请号为201880045263.0、发明名称为“FXR受 体激动剂”的申请的分案申请。
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种FXR受体激动剂、其制备方法、含有所述FXR受体激动剂的药物制剂，以及所述FXR受体激动剂的用途。
背景技术
法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)属于配体激活转录因子核受体家族成员，具有典型的核受体结构，即氨基末端高度保守的DNA结合区(DBD)，羧基末端配体结合区(LBD)，氨基末端配体非依赖性转录激活功能区(AF1)，羧基末端配体依赖性转录激活功能区(AF2)和脚链区。FXR可与视黄醇类X受体(RXR)形成异二聚体，当配体与FXR的LBD区域结合后，FXR构象可发生改变，DNA的结合区结合到靶基因启动子的FXR反应元件(IR-1)上面，释放辅抑制因子(如NCOR)，招募了辅激活因子，从而发挥转录调控作用。
FXR在多个器官组织中均有表达，包括脂肪组织、肝脏、胃肠道、肾脏等，其中肝脏中表达量最为丰富。FXR信号通路可调节多个下游基因的表达，如BSEP、SHP、CYP7A1、FGFR4、OSTα/β、SREBP-1C等基因，进而调节多种代谢途径，如：甘油三酯、胆固醇、血糖及能量稳定性代谢胆酸的代谢，具有治疗癌症、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、代谢紊乱、炎症等疾病的功能。FXR通过抑制胆酸的合成、结合及转运，调节其代谢，是体内胆酸平衡的主要调节者。
部分天然胆酸类化合物可激动FXR，如鹅去氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)及牛磺酸和这些胆酸的甘氨酸结合物。除去天然的化合物，目前国际上研发的FXR激动剂可主要分为两大类，一类是甾体类，以Intercept公司的奥贝胆酸为代表(obeticholicacid，OCA)，其于2016年5月份被批准用于治疗原发性胆管性肝硬化和非酒精性脂肪肝炎，目前处于临床III期研究阶段，但是该类产品在临床研发期间被发现会引起皮肤瘙痒等不良反应；另一类是新型分子实体，例如早期研发的化合物如GW4604(WO2000/037077)，虽然具有较强的激动活性，但其对光不稳定性且生物利用度较低。Phenex公司的PX-104(WO2011020615A1)已转让给Gilead公司，目前处于临床II期研究阶段。
Figure BDA0002909311530000011
Figure BDA0002909311530000021
另有Gilead公司研发的GS-9674和Novartis研发的LJN-452均处于临床II期研究阶段，适应症为原发性胆管性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝炎，结构未知。
Tully等人公开了一类FXR激动剂(参见专利申请WO2012087519A1)，并具体公开了化合物30-70。
Figure BDA0002909311530000022
目前，开发出高效、低毒、且稳定性较好的新型FXR受体激动剂，丰富药品种类，具有重要的临床意义。
发明内容
本发明涉及具有新型分子实体的化合物，可有效激动FXR，提升BSEP及SHP基因表达水平，同时有效抑制CYP7A1基因的表达。
在一方面，本发明提供了作为FXR激动剂的化合物。
本发明提供了通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，
Figure BDA0002909311530000023
其中，
R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基；
X1、X2分别独立选自N、NR2、O、S或CR3R4；R2、R3、R4分别独立地选自氢、卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷基氨基；
M选自C1-6亚烷基，所述的C1-6亚烷基中任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2；
环A选自7元桥环基或7元桥杂环基；
环B选自任选被一个或多个Q1取代的6-10元芳基、5-10元杂芳基，3-14杂环基或3-8元环烷基；
每个Q1独立地选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基；
L选自不存在或C1-6亚烷基，所述的C1-6亚烷基中任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2；
Ar选自任选被一个或多个Q2取代的6-10元芳基、6-10元芳基C1-6烷基、6-10元芳基C1-6烷氧基、5-10元杂芳基、5-10元杂芳基C1-6烷基、5-10元杂芳基C1-6烷氧基、3-8元环烷基或3-8元杂环基；
每个Q2独立地选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基C1-4烷基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基。
在某些实施方案中，X1、X2分别独立选自N、NR2、O、S或CR3R4；R2、R3、R4分别独立地选自氢、卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烷基氨基。
在某些实施方案中，M选自C1-4亚烷基，所述的C1-4亚烷基中任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2。
在某些实施方案中，环A选自7元桥环基或7元含氮桥杂环基。
在某些实施方案中，环B选自任选被1-2个Q1取代的含有1-3个杂原子或基团的8-10元稠杂芳基或7-14元稠杂环基，所述杂原子或基团独立地选自N、NH、O、S、SO或SO2。
在某些实施方案中，每个Q1独立地选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基。
在某些实施方案中，L选自不存在或C1-4亚烷基，所述的C1-4亚烷基中任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自NH、O、CO、S、SO或SO2。
在某些实施方案中，Ar选自任选被1-3个Q2取代的6-8元单环芳基、8-10元稠芳基、6-8元单环芳基C1-4烷基、8-10元稠芳基C1-4烷基、6-8元单环芳基C1-4烷氧基、8-10元稠芳基C1-4烷氧基、5-7元单环杂芳基、8-10元稠杂芳基、5-7元单环杂芳基C1-4烷基、8-10元稠杂芳基C1-4烷基、5-7元单环杂芳基C1-4烷氧基、8-10元稠杂芳基C1-4烷氧基、3-8元环烷基或3-8元杂环基。
在某些实施方案中，每个Q2独立地选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基C1-4烷基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基。
本发明进一步提供了通式(II)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，
Figure BDA0002909311530000041
其中，
R1、X1、X2、Q1、Ar如上述任一方案所述。
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基C1-4烷基、3-4元环烷基、3-4元环烷基C1-4烷基、3-4元环烷基C1-4烷氧基、3-4元单杂环基、3-4元单杂环基C1-4烷基或3-4元单杂环基C1-4烷氧基。
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自卤素原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲氨基、乙氨基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基。
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基；
优选地，R1选自环丙基或环丁基。
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
X1、X2分别独立选自N、NR2、O或S；R2选自氢、卤素原子、羟基、氨基、甲基、乙基、丙基、异丙基或三氟甲基；
优选地X1、X2分别独立选自N、NH、O或S；
更优选地，X1、X2均为O。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
M选自-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-NH-、-CH2-CH2-O-或-CH2-NH-CO-；
优选地，M选自-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
环A选自7元饱和桥环基或7元饱和含氮桥杂环基，当环A为饱和含氮杂环基时，优选环A通过环氮原子与L或环B相连。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
环A选自7元饱和桥环基或7元含1个氮和另外的0-1个杂原子或基团的饱和桥杂环基，所述杂原子或基团选自N、NH、O、S、CO、SO或SO2，当环A为所述7元含1个氮和另外的0-1个杂原子或基团的饱和桥杂环基时，优选环A通过环氮原子与L或环B相连；
优选地，环A选自下列基团：
Figure BDA0002909311530000051
Figure BDA0002909311530000061
并且，当环A选自这些基团中的饱和含氮杂环基时，优选地，环A通过环氮原子与L或环B相连；
进一步优选地，环A选自如下基团：
Figure BDA0002909311530000062
Figure BDA0002909311530000063
优选地，环A通过环氮原子与L或环B相连；
更优选地，环A选自：
Figure BDA0002909311530000064
优选地，环A通过环氮原子与L或环B相连。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
环B选自任选被1-2个Q1取代的含有1-2个杂原子或基团的9-10元稠杂芳基，所述的杂原子或基团独立地选自N、NH、O、S、SO或SO2；优选地，环B通过环碳原子与L或环A相连；
每个Q1独立地选卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基；
L选自不存在或C1-2亚烷基，所述的C1-2亚烷基中任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自NH、O、S或CO。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
环B选自任选被1个Q1取代的如下基团：
Figure BDA0002909311530000065
Figure BDA0002909311530000066
优选地，环B通过环碳原子与L或环A相连；
优选地，环B选自任选被1个Q1取代的如下基团：
Figure BDA0002909311530000071
优选地，环B通过环碳原子与L或环A相连；
Q1选自氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟代乙基、2-氟代乙基、1,1-二氟乙基、1,2-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、1-三氟甲基乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环戊基、环己基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、四氢呋喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噻唑烷基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、哌嗪基或吗啉基；
优选地，Q1选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙基氧基；
更优选地，Q1处于通式结构中羧基的间位；
L选自不存在。
在某些实施方案中，通式(II)的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
Q1选自氢、卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基；
优选地，Q1选自氢、氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟代乙基、2-氟代乙基、1,1-二氟乙基、1,2-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、1-三氟甲基乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环戊基、环己基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、四氢呋喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噻唑烷基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、哌嗪基或吗啉基；
进一步优选地，Q1选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙基氧基；
更优选地，所述Q1处于通式结构中羧基的间位。
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、苯基C1-4烷基、苯基C1-4烷氧基、5-6元单环杂芳基、5-6元单环杂芳基C1-4烷基或5-6元单环杂芳基C1-4烷氧基；
每个Q2独立地选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基C1-4烷基或C1-4烷基氨基；
优选地，Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、苯基甲基、苯基乙基、苯基甲氧基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、吡啶基或嘧啶基；每个Q2独立地选自氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、甲基氨基、乙基氨基、甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基；
在某些实施方案中，通式(I)或通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基或6元单环杂芳基；
优选地，Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、吡啶基、嘧啶基；每个Q2独立地选自氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、甲基氨基、乙基氨基、甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基；
优选地，每个Q2独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基或乙氧基。
在某些实施方案中，通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自环丙基或环丁基；
X1、X2均为O；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、吡啶基或嘧啶基；每个Q2独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基或乙氧基；
Q1选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙基氧基。
在某些实施方案中，通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基；
X1、X2分别独立选自N、NH、O或S；
Q1选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙基氧基；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、吡啶基或嘧啶基；每个Q2独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙氧基或三氟甲氧基。
在某些实施方案中，通式(II)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1为环丙基；
X1、X2均为O；
Ar为任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q2独立地选自氯、甲氧基、三氟甲氧基；
Q1选自氢、氟、甲基、甲氧基。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1选自环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基；
X1、X2分别独立选自N、NH、O或S；
M选自-CH2-；
环A选自
Figure BDA0002909311530000091
环B选自如下基团：
Figure BDA0002909311530000092
L选自不存在；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、吡啶基或嘧啶基；每个Q2独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基或三氟甲氧基。
在某些实施方案中，通式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其中，
R1为环丙基；
X1、X2均为O；
M为-CH2-；
环A为
Figure BDA0002909311530000093
环B为
Figure BDA0002909311530000094
L选自不存在；
Ar为任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q2独立地选自氯、甲氧基。
上述各实施方案之间以及各实施方案所涉及的各特征之间可以任意组合，所得到的技术方案均记载于本文中，属于本发明的技术方案。
以下为本发明的部分化合物
Figure BDA0002909311530000101
另一方面，本发明涉及包含通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体的药物组合物。
另一方面，本发明涉及包含通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体与一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物制剂，其可以制成药学上可接受的任一剂型。以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服方式给药时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，可制成栓剂等。用于经肺给药时，可制成吸入剂或喷雾剂等。
另一方面，本发明还涉及通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体在制备用于预防和/或治疗受试者中FXR介导的疾病及相关疾病的药物中的应用。
本发明还提供了治疗和/或预防受试者中FXR介导的疾病及相关疾病的方法，其包括将治疗和/或预防有效量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体或者本发明的药物组合物施用给有此需要的受试者。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
另一方面，本发明还涉及通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，其用于预防和/或治疗受试者中FXR介导的疾病及相关疾病。
本发明中，所述FXR介导的疾病及相关疾病包括但不限于：
(1)脂质或脂蛋白紊乱，如动脉粥样硬化、胆汁酸紊乱、原发性硬化性胆管炎、胆固醇结石、纤维化相关疾病、脂肪肝(酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝等)、肝硬化(原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管性肝硬化等)、肝炎(慢性肝炎、非病毒性肝炎、酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝炎等)、肝脏衰竭、胆汁郁积(良性肝内胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积、肝外胆汁郁积病症等)、胆石病、心肌梗塞、中风、血栓等；急性肝衰竭，胆石病，和/或炎性肠道疾病。
(2)I型或II型糖尿病的临床并发症，包括糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、及其临床显性长期糖尿病的其他观察到的结果。
(3)过度增殖性疾病，包括非恶性过度增殖性疾病和恶性过度增殖性疾病，包括肝细胞癌、结肠腺瘤和息肉病、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌和其他形式的胃肠道和肝脏肿瘤性疾病。
在本发明中，受试者或者患者可以是任何动物，优选地哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。其中，特别优选的受试者为人。
本发明还提供了一种试剂盒，其用于激动细胞中的FXR、提升细胞中的BSEP表达、提升细胞中SHP表达和/或抑制细胞中的CYP7A1表达，所述的试剂盒包括本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体，且任选地还包括使用说明。
本发明还提供了本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、或它们的立体异构体用于制备制剂的用途，所述制剂用于激动细胞中的FXR、提升细胞中的BSEP表达、提升细胞中SHP表达和/或抑制细胞中的CYP7A1表达。在某些实施方案中，所述制剂用于体内或者体外施用。例如，所述制剂可被施用至受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内；或者，所述制剂可被施用至体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞)。
本发明还提供了激动细胞中的FXR、提升细胞中的BSEP表达、提升细胞中SHP表达和/或抑制细胞中的CYP7A1表达的方法，其包括给所述细胞施用有效量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、或它们的立体异构体。在某些实施方案中，所述方法用于体内，例如所述细胞是受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内的细胞；或者，所述方法用于体外，例如所述细胞是体外的细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞)。
本发明还提供了本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、或它们的立体异构体，其用于激动细胞中的FXR、提升细胞中的BSEP表达、提升细胞中SHP表达和/或抑制细胞中的CYP7A1表达。
在某些实施方案中，所述细胞是来源于肝脏的细胞(例如来源于受试者的肝脏细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是肝癌细胞或肝实质细胞。在某些实施方案中，所述细胞是HepG2细胞或AML12细胞。
在本申请的说明书和权利要求书中，化合物都是依据化学结构式而命名的，如果表示同一化合物时化合物的命名与化学结构式不符，以化学结构式或化学反应式为准。
术语定义
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，下面提供了部分相关术语的定义和解释。另外，当本申请所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不一致时，以本申请所提供的术语的定义和解释为准。
本发明所述“卤代”是指被“卤素原子”取代，本发明所述的“卤素原子”包括氟、氯、溴和碘。
本发明所述的“C1-6烷基”是指直链或支链的含有1-6个碳原子的烷基，包括例如“C1-5烷基”、“C1-4烷基”、“C1-3烷基”、“C1-2烷基”、“C2-4烷基”、“C2-3烷基”、“C3-4烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。本发明所述的“C1-4烷基”是指C1-6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“卤代C1-6烷基”是指一个或多个卤素原子原子取代C1-6烷基上的一个或多个氢原子所衍生的基团，所述“卤素原子”和“C1-6烷基”如前文所定义。本发明所述的“卤代C1-4烷基”指卤代C1-6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“羟基C1-6烷基”是指一个或多个羟基取代C1-6烷基上的一个或多个氢原子所衍生的基团，所述“C1-6烷基”如前文所定义。本发明所述的“羟基C1-4烷基”指羟基C1-6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“氨基C1-6烷基”是指一个或多个氨基取代C1-6烷基上的一个或多个氢原子所衍生的基团，所述“C1-6烷基”如前文所定义。本发明所述的“氨基C1-4烷基”指氨基C1-6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基”是指以C1-6烷基-O-，C1-6烷基-NH-，C1-6烷基-C(O)-，C1-6烷基-S(O)2-，C1-6烷基-S(O)-方式连接的基团，其中“C1-6烷基”如前文所定义。本发明所述的“C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基”是指上述实例的烷基中含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“C1-6烷氧基C1-6烷基”是指一个或多个C1-6烷氧基取代C1-6烷基上的一个或多个氢原子所衍生的基团，所述“C1-6烷基”如前文所定义。本发明所述的“C1-4烷氧基C1-4烷基”指C1-6烷氧基C1-6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
本发明所述的“CR3R4”是指R3、R4分别取代亚甲基上的两个氢原子形成的基团，具体的连接方式为
Figure BDA0002909311530000131
本发明所述的“C1-6亚烷基”是指直链含1-6个碳原子的烷烃去除两个不在同一碳原子上的氢所衍生的基团，包括“C1-5亚烷基”、“C1-4亚烷基”、“C1-3亚烷基”、“C1-2亚烷基”，具体实例包括但不限于：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-等。
本发明所述的“C1-6亚烷基中的任意一个或多个碳原子任选被杂原子或基团所替代”是指“C1-6亚烷基”中的任意一个或多个碳原子可以任选被一个或多个杂原子或基团所替代，可以是C1-6亚烷基中的碳原子未被任何杂原子或基团所替代；也可以是C1-6亚烷基中的一个碳原子被一个杂原子或基团所替代；也可以是C1-6亚烷基中的任意两个碳原子被相同或不同的两个杂原子或基团所替代；也可以是C1-6亚烷基中的任意多个碳原子被相应的相同或不同的多个杂原子或基团所替代；所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2。
本发明所述的“3-8元环烷基”是指含有3-8个碳原子的单环饱和的环状烷基，包括例如“3-6元环烷基”、“3-5元环烷基”、“3-4元环烷基”、“4-5元环烷基”、“4-6元环烷基”、“4-7元环烷基”、“4-8元环烷基”等。具体实例包括但不限于：环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基、环辛烷基等。“3-6元环烷基”是指含有3-6个碳原子的饱和环状烷基。“3-4元环烷基”是指含有3-4个碳原子的饱和环状烷基。
本发明所述的“3-14元杂环基”是指含有3-14个环原子、且含有至少一个杂原子(例如1、2、3、4或5个杂原子)的饱和或部分饱和的单环或稠环化合物除去一个氢原子得到的基团。所述的“稠环”是指两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子所形成的基团。包括例如“3-12元杂环基”、“3-10元杂环基”、“3-8元杂环基”、“3-7元杂环基”、“3-6元单杂环基”、“3-4元单杂环基”、“4-7元单杂环基”、“4-6元单杂环基”、“5-6元单杂环基”、“7-10元稠杂环基”、“7-14元稠杂环基”等。3-14元部分饱和杂环基，是指含有双键、杂原子的环状基团。3-14元饱和杂环基，是指全部为饱和键的含有杂原子的环状基团。具体实例包括但不仅限于：环氧乙烷、氮杂环丙烷基、二氮杂环丙基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1,4-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌嗪基、吗啉基、苯并二氢呋喃基、苯并二氢吡喃基、苯并1,4-二氧杂环己烯基、苯并1,3-二氧杂环己烯基、苯并四氢吡啶基、苯并二氢噁嗪基、苯并四氢吡嗪基、1,2,3,4-四氢喹唑啉基、1,2,3,4-四氢噌啉基或四氢萘基等。所述“3-6元杂环基”是指3-14元杂环基中含有3-6个环原子的具体实例。所述“3-4元单杂环基”是指3-14元杂环基中含有3-4个环原子的单环杂环基的具体实例。
本发明所述的“3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基”是指3-8元环烷基取代C1-6烷基、C1-6烷氧基中的氢原子所衍生的基团，所述的“3-8元环烷基”、“C1-6烷基”、“C1-6烷氧基”如前文所定义。
本发明所述的“3-8元杂环基C1-6烷基、3-8元杂环基C1-6烷氧基”是指3-8元杂环基取代C1-6烷基、C1-6烷氧基中的氢原子所衍生的基团，所述的“3-8元杂环基”、“C1-6烷基”、“C1-6烷氧基”如前文所定义。
本发明所述的“3-6元环烷基C1-4烷基、3-4元环烷基C1-4烷基、3-6元单杂环基C1-4烷基、3-4元单杂环基C1-4烷基”是指3-6元环烷基、3-4元环烷基、3-6元单杂环基、3-4元单杂环基取代C1-4烷基中的氢原子所衍生的基团，所述的“3-6元环烷基”、“3-4元环烷基”、“3-6元单杂环基”、“3-4元单杂环基”、“C1-4烷基”如前文所定义。
本发明所述的“3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-4元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基C1-4烷氧基、3-4元单杂环基C1-4烷氧基”是指3-6元环烷基、3-4元环烷基、3-6元单杂环基、3-4元单杂环基取代C1-4烷氧基中的氢原子所衍生的基团，所述的“3-6元环烷基”、“3-4元环烷基”、“3-6元单杂环基”、“3-4元单杂环基”、“C1-4烷氧基”如前文所定义。
本发明所述的“6-10元芳基”是指含有6-10个环碳原子的具有芳香性的单环或多环基团。例如包括“6-8元单环芳基”、“6-7元单环芳基”、“8-10元稠芳基”等。具体实施例包括但不限于：苯基、环辛四烯基、萘基等。所述的“6-8元单环芳基”是指6-10元芳基中含有6-8个环碳原子的单环的具体实例。所述的“6-7元单环芳基”是指6-10元芳基中含有6-7个环碳原子的单环的具体实例。所述的“8-10元稠芳基”是6-10元芳基中含有8-10个环碳原子的多环的具体实例。
本发明所述的“5-10元杂芳基”是指含有5-10个环原子且至少一个环原子为杂原子的具有芳香性的单环或多环基团，所述杂原子为氮原子、氧原子和/或硫原子。包括例如“5-7元单环杂芳基”、“5-6元单环杂芳基”、“6元单杂芳基”、“7-10元稠杂芳基”、“8-10元稠杂芳基”、“9-10元稠杂芳基”。具体实施例包括但不限于：呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基等。所述的“5-6元单环杂芳基”是指5-10元杂芳基中含有5-6个环原子的单环的具体实例。所述的“7-10元稠杂芳基”、“8-10元稠杂芳基”、“9-10元稠杂芳基”是指5-10元杂芳基中含有7-10个、8-10个、9-10个环原子的多环的具体实例。
本发明所述的“6-10元芳基C1-6烷基、5-10元杂芳基C1-6烷基”是指6-10元芳基、5-10元杂芳基取代C1-6烷基中的氢原子所衍生的基团。所述的“6-10元芳基”、“5-10元杂芳基”、“C1-6烷基”如前文所述。
本发明所述的“6-10元芳基C1-6烷氧基、5-10元杂芳基C1-6烷氧基”是指6-10元芳基、5-10元杂芳基取代C1-6烷氧基中的氢原子所衍生的基团。所述的“6-10元芳基”、“5-10元杂芳基”、“C1-6烷氧基”如前文所述。
本发明所述的“6-8元单环芳基C1-4烷基、8-10元稠芳基C1-4烷基、6元单环芳基C1-4烷基、5-7元单环杂芳基C1-4烷基、8-10元稠杂芳基C1-4烷基”是指6-8元单环芳基、8-10元稠芳基、6元单环芳基、5-7元单环杂芳基、8-10元稠杂芳基取代C1-4烷基中氢原子所衍生出的基团。其中，“6-8元单环芳基”、“8-10元稠芳基”、“6元单环芳基”、“5-7元单环杂芳基”、“8-10元稠杂芳基”、“C1-4烷基”如前文所定义。
本发明所述的“6-8元单环芳基C1-4烷氧基、8-10元稠芳基C1-4烷氧基、6元单环芳基C1-4烷氧基、5-7元单环杂芳基C1-4烷氧基、8-10元稠杂芳基C1-4烷氧基”是指6-8元单环芳基、8-10元稠芳基、6元单环芳基、5-7元单环杂芳基、8-10元稠杂芳基取代C1-4烷氧基中氢原子所衍生出的基团。其中，“6-8元单环芳基”、“8-10元稠芳基”、“6元单环芳基”、“5-7元单环杂芳基”、“8-10元稠杂芳基”、“C1-4烷氧基”如前文所定义。
本发明所述的“L选自不存在”是指，当L为不存在时，环A与环B通过化学键直接相连。
本发明结构式或基团中虚键是指存在或不存在，例如基团，
Figure BDA0002909311530000151
是指包括/>
Figure BDA0002909311530000152
两种情况。
本发明所述的“7元桥环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个非相邻的环原子所形成的含有7个环碳原子的饱和或部分饱和的环状结构。包括例如“7元饱和桥环基”，具体实例包括但不仅限于：
Figure BDA0002909311530000153
等。所述的“7元饱和桥环基”是指7元桥环基中饱和桥环基的具体实例。
本发明所述的“7元桥杂环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个非相邻的环原子所形成的含有7个环原子(其中至少一个环原子为杂原子或基团，例如N、NH、O、S、CO、SO、SO2等)的饱和或部分饱和的环状结构，优选杂原子或基团的个数为1、2、3、4或5个，进一步优选1个或2个。例如包括“7元饱和桥杂环基”、“7元饱和含氮桥杂环基”等。具体实例包括但不限于：
Figure BDA0002909311530000161
Figure BDA0002909311530000162
Figure BDA0002909311530000163
等。所述的“7元饱和含氮桥杂环基”是指7元桥杂环基中至少含有一个氮原子的饱和桥环的具体实例。
本发明化合物结构式中所示的“顺式”或“反式”是指结构中桥环A中的主桥(碳原子最少的桥)与其相应取代基之间的位置关系。以化合物1为例，化合物1为顺式结构，具体结构式如下：
Figure BDA0002909311530000164
其表示，化合物1为含有两个对映异构体的消旋体，该两个对映异构体结构式分别为：
Figure BDA0002909311530000165
本发明化合物结构命名中，“(1RS,4RS,5SR)”表示其为含有两个对映异构体的消旋体，该两个对映异构体的绝对构型分别为“1R,4R,5S”和“1S,4S,5R”。
本发明所述的“任选”是指可以存在，也可以不存在。例如，本发明所述的“环B选自任选被一个或多个Q1取代”包括环B未被任何Q1取代的情况，也包括环B被一个或多个Q1取代的情况。
本发明所述的“部分饱和”是指相关基团至少包含一个双键或一个三键。
本发明还提供了式(I)化合物的制备方法，其包括但不限于下述工艺路线：
各缩写所代表的定义如下：
DMA：N,N-二甲基乙酰胺；THF：四氢呋喃；DCM：二氯甲烷；TFA：三氟乙酸；EA：乙酸乙酯；PE：石油醚；MeOH：甲醇。
Figure BDA0002909311530000171
R1、X1、X2、L、M、环A、环B和Ar如前文所述，X3、X4分别代表Cl或者Br。
具体的示例性步骤如下：
1、中间体1的制备
将原料2、叔丁醇钾、18-冠-6和KI加入到有机溶剂中，再加入原料1，25-60℃下反应，反应完毕，反应液浓缩，柱层析纯化，得中间体1。其中，有机溶剂优选为四氢呋喃。
2、中间体2的制备
将中间体1缓慢加入到含有酸性物质的溶液中反应，待反应完全后，用碱性溶液溶液调节pH至7-8，旋干体系，浓缩得中间体2。其中，含有酸性物质的溶液优选盐酸乙醇溶液、含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液等，所述碱性溶液优选饱和碳酸氢钠溶液。
3、中间体4的制备
将中间体2、中间体3和碳酸铯加入到有机溶剂中，微波反应或加热反应，反应完毕，经柱层析纯化得中间体4。其中，所述有机溶剂优选DMA。
4、式(I)化合物的制备
将中间体4加入到有机溶剂中，再加入含有碱性物质的水溶液，加热反应。反应结束后，用酸性物质溶液调解pH至4-6，旋干溶剂，经柱层析纯化得式(I)化合物。其中所述有机溶剂优选甲醇/四氢呋喃混合溶液，所述的碱性物质优选氢氧化锂、氢氧化钠等，所述酸性溶液优选盐酸。
本发明所述的原料1和原料2可以自制也可以市购。
本发明式(I)所示化合物的“药学上可接受的盐”是指式(I)化合物中存在的酸性官能团与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，包括与碱金属或碱土金属形成的盐、铵盐，以及与含氮有机碱形成的盐；以及式(I)化合物中存在的碱性官能团(例如-NH2等)与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，包括与无机酸，与有机羧酸。
本发明式(I)所示化合物的“酯”是指，当式(I)化合物存在羧基时，可以与醇发生酯化反应而形成的酯，当式(I)化合物存在羟基时，可以与有机酸、无机酸、有机酸盐等发生酯化反应而形成的酯。酯在酸或者碱存在的条件下，可以发生水解反应生成相应的酸或醇。作为通式(I)表示的化合物的可药用酯例如烷酰氧烷基酯，烷氧羰氧基烷基酯，烷氧基甲酯，烷酰氨基甲酯，环烷酰氧烷基酯，环烷氧基酰氧烷基酯等。
“立体异构”分为构象异构和构型异构，构型异构还可分为顺反异构和旋光异构(即光学异构)，构象异构是指具有一定构型的有机物分子由于碳、碳单键的旋转或扭曲而使得分子各原子或原子团在空间产生不同的排列方式的一种立体异构现象，常见的有烷烃和环烷烃类化合物的结构，如环己烷结构中出现的椅式构象和船式构象。“顺反异构体”是指当化合物含有如C＝C双键、C≡C叁键、C＝N双键、N＝N双键或脂环等不能自由旋转的官能团所产生的顺式或反式异构体，按照国际统一的“顺序规则”，当两个较优基团在π键或脂环的同侧为顺式异构体，当两个较优基团在π键或脂环的异侧为反式异构体，具体到本发明，化合物中含有桥环或桥杂环，顺式或反式是指桥环(或桥杂环)的主桥与X2连接的基团处于桥环(或桥杂环)的同侧或者异侧。“光学异构体”是指当本发明化合物含有一个或多个不对称中心，因而可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单一非对映异构体。本发明化合物有不对称中心，每个不对称中心会产生两个光学异构体，本发明的范围包括所有可能的光学异构体和非对映异构体混合物和纯的或部分纯的化合物。本发明所述的化合物可以以互变异构体形式存在，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点。例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。各互变异构体及其混合物都包括在本发明的化合物中。所有式(I)或通式(II)化合物的对映异构体、非对映异构体、外消旋体、内消旋体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物等，均包括在本发明范围中。
本发明还涉及以下方案：
方案1、通式(I)所示的化合物，其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，
Figure BDA0002909311530000181
其中，
R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基；
X1、X2分别独立选自N、NR2、O、S或CR3R4；R2、R3、R4分别独立的选自氢、卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷基氨基；
M选自C1-6亚烷基，所述的C1-6亚烷基中任一碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2；
环A选自7元桥环基或7元桥杂环基；
环B选自任选被一个或多个Q1取代的6-10元芳基、5-10元杂芳基，3-14杂环基或3-8元环烷基；
每个Q1独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基；
L选自不存在或C1-6亚烷基，所述的C1-6亚烷基中任一碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2；
Ar选自任选被一个或多个Q2取代的6-10元芳基、6-10元芳基C1-6烷基、6-10元芳基C1-6烷氧基、5-10元杂芳基、5-10元杂芳基C1-6烷基、5-10元杂芳基C1-6烷氧基、3-8元环烷基或3-8元杂环基；
每个Q2独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、3-8元环烷基、3-8元环烷基C1-6烷基、3-8元环烷基C1-6烷氧基、3-8元杂环基、3-8元杂环基C1-6烷基或3-8元杂环基C1-6烷氧基。
方案2、如方案1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基C1-4烷基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基；
X1、X2分别独立选自N、NR2、O、S或CR3R4；R2、R3、R4分别独立的选自氢、卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烷基氨基；
M选自C1-4亚烷基，所述的C1-4亚烷基中任一碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自N、NH、O、CO、S、SO或SO2；
环A选自7元桥环基或7元含氮桥杂环基；
环B选自任选被1-2个Q1取代的含有1-3个杂原子或基团的8-10元稠杂芳基或7-14元稠杂环基，所述杂原子或基团独立的选自N、NH、O、S、SO或SO2；
每个Q1独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基；
L选自不存在或C1-4亚烷基，所述的C1-4亚烷基中任一碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自NH、O、CO、S、SO或SO2；
Ar选自任选被1-3个Q2取代的6-8元单环芳基、8-10稠芳基、6-8元单环芳基C1-4烷基、8-10元稠芳基C1-4烷基、6-8元单环芳基C1-4烷氧基、8-10元稠芳基C1-4烷氧基、5-7元单环杂芳基、8-10元稠杂芳基、5-7元单环杂芳基C1-4烷基、8-10元稠杂芳基C1-4烷基、5-7元单环杂芳基C1-4烷氧基、8-10元稠杂芳基C1-4烷氧基、3-8元环烷基或3-8元杂环基；
每个Q2独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基C1-4烷基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基。
方案3、如方案1-2任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，M选自-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-NH-、-CH2-CH2-O-、-CH2-NH-CO-；
环A选自7元饱和桥环基或7元饱和含氮桥杂环基，当环A为饱和含氮桥杂环基时，优选的，环A通过环氮原子与L或环B相连。
方案4、如方案1-3任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
R1选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基C1-4烷基、3-4元环烷基、3-4元环烷基C1-4烷基、3-4元环烷基C1-4烷氧基、3-4元单杂环基、3-4元单杂环基C1-4烷基或3-4元单杂环基C1-4烷氧基；
环A选自下列基团：
Figure BDA0002909311530000201
方案5、如方案1-4任一项所述的化合物其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
环B选自任选被1-2个Q1取代的含有1-2个杂原子或基团的9-10元稠杂芳基，所述杂原子或基团独立的选自N、NH、O、S、SO、SO2；优选的，环B通过环碳原子与L或环A相连；
每个Q1独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、3-6元环烷基、3-6元环烷基C1-4烷基、3-6元环烷基C1-4烷氧基、3-6元单杂环基、3-6元单杂环基C1-4烷基或3-6元单杂环基C1-4烷氧基；
L选自不存在或C1-2亚烷基，所述的C1-2亚烷基中任一碳原子任选被杂原子或基团所替代，所述的杂原子或基团选自NH、O、S或CO。
方案6、如方案1-5任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、苯基C1-4烷基、苯基C1-4烷氧基、5-6元单环杂芳基、5-6元单环杂芳基C1-4烷基或5-6元单环杂芳基C1-4烷氧基；每个Q2独立的选自卤素原子、羟基、氨基、氰基、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、氨基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基C1-4烷基或C1-4烷基氨基。
方案7、如方案1-6任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
R1选自卤素原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲氨基、乙氨基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基；
X1、X2分别独立选自N、NH、O或S；
M选自-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-；
环A选自：
Figure BDA0002909311530000211
环B选自任选被1个Q1取代的如下基团：
Figure BDA0002909311530000212
Q1选自氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟代乙基、2-氟代乙基、1,1-二氟乙基、1,2-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、1-三氟甲基乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环戊基、环己基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、四氢呋喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噻唑烷基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、哌嗪基或吗啉基；
L选自不存在；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、苯基甲基、苯基乙基、苯基甲氧基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基；每个Q2独立的选自氟、氯、溴、羟基、氨基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、甲基氨基、乙基氨基、甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基。
方案8、如方案7所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，其中，
R1选自环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基甲氧基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基甲氧基、环氧乙基、环氧乙基甲基、氮杂环丙基、氮杂环丙基甲基、氧杂环丁基或氮杂环丁基；
环A选自
Figure BDA0002909311530000221
环B选自任选被1个Q1取代的如下基团：
Figure BDA0002909311530000222
Q1选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙基氧基；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基、吡啶基或嘧啶基；每个Q2独立的选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基或乙氧基。
方案9、如方案1-8任一项所述的化合物，其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，具有如下通式(II)所示的结构，
Figure BDA0002909311530000223
方案10、如方案1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体，所述化合物选自：
Figure BDA0002909311530000231
方案11、含有方案1-10任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体的药物制剂，其特征在于包含一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，所述的药物制剂为药学上可接受的任一剂型。
方案12、方案1-10任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯或其立体异构体在制备预防和/或治疗由FXR介导的疾病的药物中的用途，所述的疾病包括动脉粥样硬化、胆汁酸紊乱、原发性硬化性胆管炎、胆固醇结石、纤维化相关疾病、脂肪肝、肝硬化、肝炎、肝脏衰竭、胆汁郁积、胆结石病、心肌梗塞、中风、血栓、I型或II型糖尿病的临床并发症、过度增殖性疾病和炎性肠道疾病。
方案13、如方案12所述的用途，其中所述疾病选自酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管性肝硬化、慢性肝炎、非病毒性肝炎、酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝炎、良性肝内胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积、药物诱导的胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积、与肠胃营养相关的胆汁淤积、肝外胆汁郁积病症、高胆固醇血症、新生儿黄疸、核黄疸、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病及其临床显性长期糖尿病的其他观察到的结果、肝细胞癌、结肠腺瘤、息肉病、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌和其他形式的胃肠道和肝脏肿瘤性疾病。
本发明化合物具有以下优点中的一个或多个：
(1)本发明化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体具有优异的FXR受体激动活性，能被安全的用于治疗和/或预防非酒精性脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化、脂质代谢紊乱、糖尿病并发症及恶性肿瘤等相关疾病；
(2)本发明化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体显示出良好的代谢稳定性，作用更持久，生物利用度高。
(3)本发明化合物、其药学上可接受的盐、其酯或它们的立体异构体显示出较低的毒性，耐药性好，安全性高。
实验方案
以下提供本发明的部分化合物的示例性实验方案，以显示本发明化合物的有益活性和有益技术效果。但是应当理解，下述实验方案仅仅是对本发明内容的示例，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员在本说明书的教导下，能够对本发明的技术方案进行适当的修改或改变，而不背离本发明的精神和范围。
实验例1：本发明化合物对HepG2细胞BSEP mRNA相对表达量的影响
1、测试物：本发明化合物，其化学名称和制备方法见各个化合物的制备实施例；化合物PX-104、化合物30-70，其结构参见背景技术，制备方法参见专利申请WO2011020615A1和WO2012087519A1。
PBS代表磷酸盐缓冲液。
2、实验方法：
(1)铺细胞，加化合物和收集细胞
使用胰酶消化、收集细胞，测定细胞浓度；根据计数结果，重悬细胞至7.5×105cell/mL密度；6孔细胞培养板，每孔接种2mL细胞；将培养板至于培养箱中，于37℃，5％CO2条件培养24小时。
使用DMSO稀释待测化合物至0.3和3mM；取上一步稀释得到的储液5μL分别加到5mL培养基中。得到的工作液浓度分别为0.3和3μM。对照组培养基使用等体积的DMSO代替储液配制；从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，加入工作液和对照培养基；将培养板放回培养箱，于37℃，5％CO2条件培养24小时。
处理24小时后，从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，用预冷(4℃)的PBS润洗细胞3次；每孔加入200μL胰酶(预热至37℃)，轻轻晃动使得胰酶均匀覆盖板底。将培养板放回培养箱温育直至细胞脱离板底。加入1mL培养基终止消化。用移液器轻轻吹打几次后，将孔中所有物质吸入到1.5mL的Rnase-free的离心管中，200×g离心5分钟；移除上清，收集细胞样品。
(2)从细胞样品中提取和纯化RNA
细胞裂解：准备新鲜的RNA裂解液(1mL裂解液加10μL 2-巯基乙醇)；向细胞样品加入600μL裂解液；剧烈涡旋1-2分钟，使细胞完全裂解；将细胞裂解液于12,000×g离心5分钟；取上清转移至RNase-free的1.5mL离心管中。
RNA提取纯化：添加等量的70％的乙醇到细胞裂解液中；剧烈震荡离心管，充分混合，尽量分散加入乙醇后可能形成的微粒沉淀；将吸附柱置于收集管上，转移混合物至吸附柱中。每次最多转移700μL；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；将剩余的混合物全部转移到吸附柱中。加700μL洗脱液I至吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。将吸附柱放置于新的收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心1-2分钟，将吸附柱放置于RNA收集管上；加入50μLRNase-free水至吸附柱的中心位置，室温孵育1分钟；室温14,000×g离心2分钟，将RNA洗脱至收集管中。
测量提取的RNA的浓度和质量。RNA存储于-80℃。
(3)RNA逆转录为cDNA
将第二步骤中提取的RNA在70℃孵育5分钟使RNA变性。处理后将样品置于冰上；
使用RNAse-free水稀释RNA样品至200ng/μL；按照下表配制10μL的逆转录溶液，并和10μL变性RNA混合。逆转录反应中RNA的总量为2μg。实验过程中，所有试剂均放置于冰上。
Figure BDA0002909311530000251
逆转录在G-Storm GS1 thermal cycler PCR热循环仪上进行。逆转录过程设置如下：25℃10分钟→37℃120分钟→85℃5分钟→4℃∞。逆转录产物(cDNA)存储于-20℃。
(4)样品qPCR实验
根据qPCR扩增效率，选择合适的cDNA浓度进行样品的qPCR实验。第三步骤逆转录得到的cDNA样品，取10μL加60μL Rnase-free水稀释7倍。
按照下表准备80μL的反应混合物，用移液器取20μL到96孔PCR反应板中，3个重复(每个反应孔加7μL 100ng)cDNA样品。
Figure BDA0002909311530000252
qPCR在ABI7500实时定量PCR仪上进行，程序设置如下：50℃2分钟→95℃10分钟→95℃15秒→60℃60秒，其中95℃15秒与60℃60秒之间设置40个循环。
(5)实验结果和结论：
表1.本发明化合物处理的HepG2细胞中BSEP mRNA相对表达量的检测结果
Figure BDA0002909311530000261
/>
表2.本发明化合物处理的HepG2细胞中BSEP mRNA相对表达量的检测结果
Figure BDA0002909311530000262
注：表1至表2中的相对表达量数据均是以PX-104在3μM时的表达量作为100％，其他表达量与PX-104在3μM时的表达量的比值作为该化合物在该浓度下的相对表达量(％)。
由表1和表2的统计结果可知，本发明化合物对HepG2细胞中BSEP mRNA有较好的激动作用，BSEP是FXR的直接下游基因，调控胆汁酸排出肝脏，是初筛化合物对FXR的激动活性较好的一个指标，对于治疗非酒精性脂肪肝具有重要的意义。
实验例2：本发明化合物在不同种属中的肝微粒体代谢稳定性实验
供试品：本发明化合物1、2、4和5，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
实验材料：
SD大鼠和人的混合肝微粒体均购自XenoTech，批号分别为：1410271(SD大鼠)、1410013(人)，肝微粒体蛋白浓度均为20mg·mL-1。
实验启动因子β-NADPH购于美国Roche公司(批号：524F0231)；pH7.4的磷酸盐缓冲液由本实验室自制。
供试品溶液制备：
精密称取供试品粉末适量，加入适量的二甲基亚砜(DMSO)溶解到1mM，再用甲醇稀释20倍到50μM的工作液。
实验方法:
表3.肝微粒体代谢稳定性实验温孵体系组成
Figure BDA0002909311530000263
Figure BDA0002909311530000271
实验操作步骤：
(1)按照上面表3“实验温孵体系的构成”比例，每个化合物取100mM PBS 6mL，20mMMgCl2溶液0.6mL及H2O 3.66mL，制备温孵体系混合溶液1(不含微粒体、供试品和β-NADPH)。
(2)从-80℃冰箱中取出肝微粒体(20mg蛋白/mL)，置于37℃水浴恒温振荡器上预温孵3min。
(3)每个化合物取1.88mL温孵体系混合溶液1，加入55μL微粒体，制备温孵体系混合溶液2(不含供试品和β-NADPH)。
(4)样品组(含微粒体和β-NADPH)：取616μL温孵体系混合溶液2，加入14μL浓度为50μM的供试品工作溶液，加入70μL 10mM的β-NADPH工作溶液。混匀，复样。取样时间点为0min，5min,10min,20min,30min,60min。
(5)对照组(含微粒体，不含β-NADPH，以水代替β-NADPH)：取264μL温孵体系混合溶液2，加入6μL浓度为50μM的供试品工作溶液，加入30μL水。混匀，复样。取样时间点为0min和60min。
(6)于各个预定时间点从孵育样品管中取样50μL，加入至终止样品管(内含300μL冷的终止剂)，涡旋，终止反应。
(7)涡旋10min后，离心5min(12000rpm)。
(8)取上清液100μL，加入100μL水，涡旋混匀，LC-MS/MS进样分析。
数据分析：
按照下面公式计算剩余量百分比。
Figure BDA0002909311530000272
实验结果：
表4.本发明化合物的体外肝微粒体代谢稳定性
Figure BDA0002909311530000273
实验结论：
本发明化合物均具有较好的肝微粒体代谢稳定性，利于在体内更好地发挥药理作用，并且具有较好的临床试验价值和良好的成药性。
实验例3：本发明化合物对HepG2细胞BSEP,SHP,CYP7A1mRNA相对表达量的影响
1、测试物：本发明化合物，其化学名称和制备方法见各个化合物的制备实施例。
HepG2细胞：人源肝癌细胞；
BSEP(Bile Salt Export Pump)：胆盐输出泵；
SHP(small heterodimer partner)：小异源二聚体伴侣；
CYP7A1(cholesterol 7-alpha hydroxylase)：固醇7α-羟化酶。
对照品：化合物1-1B，结构如下所示，按照现有技术方法制备，具体参见专利申请WO2012087519A1。
Figure BDA0002909311530000281
2、实验方法：
(1)细胞培养、化合物处理和细胞收集
使用胰酶消化、收集细胞，测定细胞浓度；根据计数结果，重悬细胞至7.5×105cell/mL密度；6孔细胞培养板，每孔接种2mL细胞；将培养板至于培养箱中，于37℃，5％CO2条件培养24小时。
用DMSO将化合物稀释到3000，1000、200、8、1.6、0.32，0.0128，0.00256，0.000512μM。取上一步稀释的不同浓度化合物用培养基稀释1000倍制成工作液，含0.1％DMSO培养基作为对照组。从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，加入工作液和对照培养基。将培养板放回培养箱，于37℃，5％CO2条件下培养24小时。
处理24小时后，从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，用预冷(4℃)的PBS(磷酸盐缓冲液)润洗细胞3次；每孔加入200μL胰酶(预热至37℃)，轻轻晃动使得胰酶均匀覆盖板底。将培养板放回培养箱温育直至细胞脱离板底。加入1mL培养基终止消化。用移液器轻轻吹打几次后，将孔中所有物质吸入到1.5mL的Rnase-free的离心管中，200×g离心5分钟；移除上清，收集细胞样品。
(2)细胞RNA样本提取和纯化
细胞裂解：准备新鲜的RNA裂解液(1mL裂解液加10μL 2-巯基乙醇)；向细胞样品加入600μL裂解液；剧烈涡旋1-2分钟，使细胞完全裂解；将细胞裂解液于12000×g离心5分钟；取上清转移至RNase-free的1.5mL离心管中。
RNA提取纯化：添加等量的70％的乙醇到细胞裂解液中；剧烈震荡离心管，充分混合，尽量分散加入乙醇后可能形成的微粒沉淀；将吸附柱置于收集管上，转移混合物至吸附柱中。每次最多转移700μL；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；将剩余的混合物全部转移到吸附柱中。加700μL洗脱液I至吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。将吸附柱放置于新的收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心1-2分钟，将吸附柱放置于RNA收集管上；加入50μLRNase-free水至吸附柱的中心位置，室温孵育1分钟；室温14,000×g离心2分钟，将RNA洗脱至收集管中。
测量提取的RNA的浓度和质量。RNA存储于-80℃。
(3)RNA逆转录为cDNA
将上一步骤中提取的RNA在70℃孵育5分钟使RNA变性。处理后将样品置于冰上；使用RNAse-free水稀释RNA样品至200ng/μL；按照下表配制10μL的逆转录溶液，并和10μL变性RNA混合。逆转录反应中RNA的总量为2μg。实验过程中，所有试剂均放置于冰上。
Figure BDA0002909311530000291
逆转录在G-Storm GS1 thermal cycler PCR热循环仪上进行。逆转录过程设置如下：25℃10分钟→37℃120分钟→85℃5分钟→4℃∞。逆转录产物(cDNA)存储于-20℃。
(4)样品qPCR实验
根据qPCR扩增效率，选择合适的cDNA浓度进行样品的qPCR实验。第三步骤逆转录得到的cDNA样品，取10μL加60μL Rnase-free水稀释7倍。
按照下表准备80μL的反应混合物，用移液器取20μL到96孔PCR反应板中，3个重复(每个反应孔加7μL 100ng)cDNA样品。
Figure BDA0002909311530000292
qPCR在ABI7500实时定量PCR仪上进行，程序设置如下：50℃2分钟→95℃10分钟→95℃15秒→60℃60秒，其中95℃15秒与60℃60秒之间设置40个循环。
3、实验结果：
Figure BDA0002909311530000301
注：EC50是指半数效应浓度，IC50是指半数抑制浓度。
4、实验结论：
由实验结果可知，本发明化合物对HepG2细胞中BSEP和SHP mRNA有较好的激动作用，且EC50值均明显小于对照化合物1-1B；对CYP7A1 mRNA有较好抑制作用，IC50值明显小于对照化合物1-1B。BSEP和SHP是FXR的直接下游基因，它们的表达激动情况直接反应FXR的激动活性；CYP7A1是FXR的次下游基因，它的表达抑制情况间接反应FXR的激动活性。它们均是初筛化合物对FXR的激动活性较好的指标。
实验例4：本发明化合物对AML12细胞SHP mRNA相对表达量的影响
1、测试物：本发明化合物，其化学名称和制备方法见各个化合物的制备实施例。
AML12细胞：鼠源肝细胞。
对照品：化合物1-1B，结构如下所示，按照现有技术方法制备，具体参见专利申请WO2012087519A1。
Figure BDA0002909311530000302
2、实验方法：
(1)细胞培养、化合物处理和细胞收集
使用胰酶消化、收集细胞，测定细胞浓度；根据计数结果，重悬细胞至7.5×104cell/mL密度；12孔细胞培养板，每孔接种1mL细胞；将培养板至于培养箱中，于37℃，5％CO2条件培养24小时。
用DMSO将化合物稀释到1000、200、8、1.6、0.32、0.128、0.0256、0.00512μM。取上一步稀释的不同浓度化合物用培养基稀释1000倍制成工作液，含0.1％DMSO培养基作为对照组。从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，加入工作液和对照组培养基。将培养板放回培养箱，于37℃，5％CO2条件下培养24小时。
处理24小时后，从培养箱中取出细胞培养板，移除培养基，用预冷(4℃)的PBS(磷酸盐缓冲液)润洗细胞3次；每孔加入200μL胰酶(预热至37℃)，轻轻晃动使得胰酶均匀覆盖板底。将培养板放回培养箱温育直至细胞脱离板底。加入1mL培养基终止消化。用移液器轻轻吹打几次后，将孔中所有物质吸入到1.5mL的Rnase-free的离心管中，200×g离心5分钟；移除上清，收集细胞样品。
(2)细胞RNA样本提取和纯化
细胞裂解：准备新鲜的RNA裂解液(1mL裂解液加10μL 2-巯基乙醇)；向细胞样品加入600μL裂解液；剧烈涡旋1-2分钟，使细胞完全裂解；将细胞裂解液于12,000×g离心5分钟；取上清转移至RNase-free的1.5mL离心管中。
RNA提取纯化：添加等量的70％的乙醇到细胞裂解液中；剧烈震荡离心管，充分混合，尽量分散加入乙醇后可能形成的微粒沉淀；将吸附柱置于收集管上，转移混合物至吸附柱中。每次最多转移700μL；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；将剩余的混合物全部转移到吸附柱中。加700μL洗脱液I至吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。将吸附柱放置于新的收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心15秒。弃掉收集管中的溶液，并将吸附柱重新放置于收集管上；加500μL洗脱液II到吸附柱中；室温12,000×g离心1-2分钟，将吸附柱放置于RNA收集管上；加入50μLRNase-free水至吸附柱的中心位置，室温孵育1分钟；室温14,000×g离心2分钟，将RNA洗脱至收集管中。
测量提取的RNA的浓度和质量。RNA存储于-80℃。
(3)RNA逆转录为cDNA
将上一骤中提取的RNA在70℃孵育5分钟使RNA变性。处理后将样品置于冰上；使用RNAse-free水稀释RNA样品至100ng/μL；按照下表配制10μL的逆转录溶液，并和10μL变性RNA混合。逆转录反应中RNA的总量为1μg。实验过程中，所有试剂均放置于冰上。
Figure BDA0002909311530000311
逆转录在G-Storm GS1 thermal cycler PCR热循环仪上进行。逆转录过程设置如下：25℃10分钟→37℃120分钟→85℃5分钟→4℃∞。逆转录产物(cDNA)存储于-20℃。
(4)样品qPCR实验
根据qPCR扩增效率，选择合适的cDNA浓度进行样品的qPCR实验。第三步骤逆转录得到的cDNA样品，按照下表准备20μL反应液，并加到96孔PCR反应板中，每个反应孔加4μLcDNA样品。
Figure BDA0002909311530000321
qPCR在ABI7500实时定量PCR仪上进行，程序设置如下：50℃2分钟→95℃10分钟→95℃15秒→60℃60秒，其中95℃15秒与60℃60秒之间设置45个循环。
3、实验结果：
本发明化合物对AML12细胞SHP mRNA相对表达量的影响EC50检测结果
Figure BDA0002909311530000322
4、实验结论：
由实验结果可知，本发明化合物对AML12细胞中SHP mRNA有较好的激动作用，且EC50值明显小于对照化合物1-1B。SHP是FXR的直接下游基因，SHP mRNA的表达情况直接反应FXR的激动活性，是初筛化合物对FXR的激动活性较好的一个指标，FXR激动剂有望成为非酒精性脂肪肝疾病治疗的首选。
实验例5：本发明化合物对高脂诱导NAFLD小鼠的影响
1.实验方法
1.1动物造模
小鼠NAFLD/NASH(non-alcoholic fatty liver disease/nonalcoholicsteatohepatitis)模型建立：6周龄雄性C57BL/6J小鼠，高脂饲料饲养，每周称量并记录小鼠体重，高脂喂养8周，检测体重确认造模是否成功。
1.2分组给药及终点处理
参考体重值(一般认为40g为筛选临界点)，将造模成功的小鼠分为：空白对照组，模型对照组和化合物2-1(1mg/kg)组，每组平均体重相一致，无显著差异。每天给药1次(QD)(8号灌胃针)，连续给药3周。
末次给药24h后，眼内眦采血，室温静置1-2h，4000rpm离心15分钟，收集血清；之后进行安乐死，取一肝大叶和一肝小叶置于10％中性甲醛，剩余置于-80℃冰箱保存。详细的给药方法、给药剂量和给药途径见下表。
本发明化合物对高脂诱导NAFLD/NASH小鼠的影响实验给药途径、剂量及方案
Figure BDA0002909311530000331
*:以2％HPC+0.1％吐温80替代测试化合物。
2实验评价指标
2.1实验观察指标
1)体重：造模开始每周称重1次。给药后每周1次称重。
2)肝脏形态学及病理学变化分析：分离收集肝脏组织，拍照。称肝脏重量，作肝重/体重比值。H&E组织切片染色(NAFLD score,NAS)。
3)肝脏生化指标检测：按组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(购自北京普利莱基因技术有限公司E1013)说明书提取肝脏内TG，并进行检测。
4)血清生化指标检测：全自动生化分析仪(日立7180，型号X594)检测血清中LDL。
2.2统计学处理
数据结果以mean±S.E.M.表示，统计数据由SPSS 16.0统计软件进行one-wayanalysis of variance(ANOVA)followed LSD或者独立样本T检验分析。检验统计学差异，p<0.05定义为差异有显著性。
3实验结果
本发明化合物对高脂诱导NAFLD/NASH小鼠的影响实验结果
Figure BDA0002909311530000332
*：实验组与模型组比较升高或降低的比值，负值表示降低，正值表示升高。
LDL：低密度脂蛋白；TG：甘油三酯；p值具有统计学意义，p1﹤0.01，p2﹤0.001。
4结论
本发明化合物2-1在给药剂量下对小鼠NAFLD症状表现出很好的改善作用。肝重增加为FXR激动剂常见的副作用，由实验结果可知，本发明化合物对实验动物的肝重/体重比没有表现出明显的增加，即没有表现出明显副作用，安全性较高。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：2-((1RS，4RS，5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物1)
Figure BDA0002909311530000341
1.(1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000342
将(1RS,4RS,5SR)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(700mg,3.3mmol)，叔丁醇钾(560mg,5.0mmol)，18-冠-6(1.32g,5.0mmol)，和KI(830mg,5.0mmol)加入到THF(15mL)中，加入4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(1.20g,4.0mmol)，50℃反应6小时。加入水和乙酸乙酯(各100mL)萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)纯化，得到标题化合物(1.38g,产率87.3％)。
2.4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000343
将(1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(1.18g,2.5mmol)加入DCM(15mL)中，加入TFA(8mL)。冰水浴下反应2小时。冰水浴下用饱和碳酸氢钠调pH至8，加入水和DCM各100mL，萃取，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物(900mg,产率96.4％)。
3.2-氨基-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000351
将4-氨基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.81g,10.0mmol)，KSCN(3.88g,40.0mmol)加入到冰乙酸(10mL)中，15分钟后，加入溴素(1.60g,10.0mmol)25℃反应16小时。用氨水调pH至8，抽滤，固体干燥得粗品标题化合物(2.40g)，未经纯化，直接用于下一步。
4.2-溴-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000352
将2-氨基-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯粗品(2.40g,10.0mmol)，溴化铜(3.35g,15.0mmol)，加入乙腈(20mL)中。0℃下滴加亚硝酸叔丁酯(1.55g,15.0mmol)滴加完毕25℃搅拌反应0.5小时，加入水和乙酸乙酯各100mL，萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化，得到标题化合物(1.21g,两步总产率:40.1％)。
5.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000353
将2-溴-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(157mg,0.52mmol)，4-((((1RS，4RS，5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(100mg,0.26mmol)和碳酸铯(254mg,0.78mol)，加入到DMA(2mL)中，110℃反应16小时，加入水和乙酸乙酯各50mL，萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)纯化，得到标题化合物(80mg,产率50.4％)。
6.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000354
将2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲氧基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(80mg,0.13mmol)，溶解到THF(1.5mL)和甲醇(1.5mL)中，加入2M的氢氧化锂(0.65mL)，40℃下搅拌反应1小时。用1M的盐酸调pH至6，加入乙酸乙酯30mL萃取，有机相浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化，得标题化合物(40mg,产率51.3％)。
分子式：C28H25Cl2N3O5S分子量：585.1LC-MS(m/z)：586.2(M+H+)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.95(s,1H),7.72-7.52(m,3H),7.40-7.35(m,1H),4.35-4.45(m,2H),3.87(s,3H),3.65-3.55(m,1H),2.95-2.85(m,1H),2.40-2.30(m,1H),1.92-1.81(m,1H),1.63-1.52(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.28-1.02(m,4H),0.90-0.80(m,2H)
实施例2：2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物2)
Figure BDA0002909311530000361
1.(1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000362
将(1RS,4RS,5SR)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(213mg,1.0mmol)，叔丁醇钾(168mg,1.5mmol)，18-冠-6(396mg,1.5mmol)加入到THF(20mL)中，25分钟后，加入4-(溴甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(416mg,1.2mmol)，25℃反应16小时。加入水和乙酸乙酯各(100mL)萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化，得到标题化合物(367mg,产率:76.7％)。
2.4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000363
将(1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(360mg,0.75mmol)加入DCM(10mL)中，加入TFA(3mL)。冰水浴下反应2小时。冰水浴下用饱和碳酸氢钠调pH至8，加入水和DCM各100mL，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物(280mg,产率:98.3％)。
3.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000371
将4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(280mg,0.74mmol)，2-溴苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(403mg,1.48mmol)和碳酸铯(724mg,2.22mmol)，加入到DMA(6mL)中，微波100℃反应1小时，加入水和乙酸乙酯各100mL，萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化，得到标题化合物(305mg,产率:72.6％)。
4.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000372
将2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(300mg,0.53mmol)，一水合氢氧化锂(111mg,2.64mmol)加入到甲醇(6mL)，THF(6mL)，和水(3mL)的混合溶液中，55℃下搅拌反应3小时，用1M的盐酸调pH至2，加入水和乙酸乙酯各100mL萃取，有机相用饱和氯化钠(100mL)洗，浓缩，经反相制备色谱(甲醇/水＝70％)纯化，得标题化合物(78mg,产率26.7％)。
分子式：C27H23Cl2N3O4S分子量：555.1LC-MS(m/z)：556.2(M+H+)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.31(s,1H),7.90-7.82(m,1H),7.75-7.55(m,3H),7.56-7.35(m,1H),4.32-4.25(m,2H),3.62-3.58(m,1H),2.98-2.88(m,1H),2.55-2.52(m,2H),2.40-2.30(m,1H),2.10-1.99(m,1H),1.98-1.85(m,1H),1.65-1.54(m,1H),1.52-1.42(m,1H),1.30-1.25(m,1H),1.20-1.10(m,2H),1.10-1.05(m,2H).
实施例2-1：2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物2-1)
Figure BDA0002909311530000373
1.(1S,4R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000374
将(1S,4R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(3.0g,27.5mmol)溶于THF(80mL)中，0℃下，加入LiAlH4(1.36g,35.8mmol)，25℃反应3小时，再升至60℃反应4h。然后0℃下加入水(2mL)淬灭反应。硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(50mL)洗涤，滤液浓缩至50mL。向反应液加入Boc2O(9.0g,41.2mmol)，25℃反应16小时，反应液浓缩，经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化，得产物(3.0g，两步产率55.9％)。
2.(1S,4S,5R)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000381
将(1S,4R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁酯(1.5g,7.68mmol)和NaBH4(0.24g,6.3mmol)加入到THF(20mL)中，氮气保护，25℃反应0.5h，再加入硫酸二甲酯(0.57mL,6.3mmol)的THF(2mL)溶液，35℃反应4h。降至0℃，加入水(5mL)淬灭，再滴入H2O2(0.96mL,30％)和1M氢氧化钠(15mL,15mmol)水溶液，25℃反应1小时，加入乙酸乙酯(100mL)萃取，有机层浓缩，经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得产物(700mg，产率42.7％)。
3.(1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000382
将(1S,4S,5R)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.2g,0.94mmol)溶于THF(30mL)中，加入叔丁醇钾(158mg,1.4mmol)，18-冠醚-6(248mg,0.94mmol)25℃反应半小时，再加入4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(427mg,1.4mmol)和KI(232.4mg,1.4mmol)，40℃反应2小时，浓缩，经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得产物(300mg，产率66.6％)。
4.4-((((1S，4S，5R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑三氟乙酸盐的制备
Figure BDA0002909311530000383
将(1S，4S，5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.25g,0.52mmol)加入到DCM(8mL)中，加入TFA(2mL)，25℃反应2小时，浓缩得粗产物(400mg)，不经纯化直接用于下一步。
5.2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000391
将4-((((1S,4S,5R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑三氟乙酸盐(400mg,粗品)，2-溴苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(212mg,0.78mmol)和碳酸铯(508mg,1.56mmol)加入到己二酸二甲酯(8mL)中，微波120℃反应0.5小时，倒入水(20mL)中，过滤，滤饼经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得产物(200mg，两步产率67.4％)。
6.2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000392
将2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(200mg,0.35mmol)，氢氧化锂一水合物(103mg,2.45mmol)溶于甲醇(8mL)，四氢呋喃(8mL)和水(8mL)的混合溶剂中，40℃搅拌2小时，浓缩，再向残余物加入水(20mL)，用1M稀盐酸调pH＝2，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取，合并有机层，浓缩，残余物经C18反相硅胶柱层析(甲醇:水＝0％-70％)纯化，得产物(70mg，产率35.9％)。
分子式:C27H23Cl2N3O4S分子量:555.1LC-MS(m/z):556.1(M+H+)
[α]2 D 0＝-84.97(C＝1.0,CH3OH)
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.34(s,1H),8.05(dd,J＝1.6Hz,J＝8.4Hz,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,1H),7.32-7.45(m,3H),4.26-4.33(m,2H),3.61(d,J＝7.2Hz,1H),3.50(s,2H),3.03(s,1H),2.60(s,1H),2.10-2.15(m,1H),2.01-2.10(m,1H),1.65-1.69(m,2H),1.44(d,J＝13.6Hz,1H),1.26-1.30(m,2H),1.11-1.17(m,2H).
实施例2-2：2-((1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物2-2)
Figure BDA0002909311530000393
1.(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯的制备
Figure BDA0002909311530000394
将(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(5.0g,45.8mmol)加入到无水THF(100mL)中，0℃下分批次加入四氢铝锂(2.26g,59.5mol)，25℃下反应3小时。再加热至60℃反应4小时，体系在0℃下用水淬灭，加入EA(100mL)和氯化钠水溶液(80mL)萃取分液，有机相用无水硫酸钠干燥，得粗品无需提纯直接用于下一步。
2.(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000401
将(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯(4.35g,45.8mmol)加入到THF(100mL)中，再加入(Boc)2O(15.0g,68.7mmol)，在25℃下反应1小时。体系直接旋干，经硅胶柱层析(PE:EA＝10:1)纯化，得到产物(7.0g,两步产率78.4％)。
3.(1R,4R,5S)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000402
将(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁酯(1.5g,7.68mmol)和硼氢化钠(0.24g,6.30mmol)加入到THF(9mL)中，氮气保护下23℃搅拌0.5小时。35℃下加入硫酸二甲酯(0.57mL,6.30mmol)的THF(2mL)溶液，剧烈搅拌下35℃下反应4小时。降至0℃，用水(5.0mL)淬灭反应，依次加入1M NaOH(15mL)和过氧化氢(30wt％in H2O,0.96mL)，在23℃下反应1小时。加入EA(100mL)和水(50mL)萃取分液，有机相旋干，经硅胶柱层析(PE:EA＝2:1)纯化，得到产物(600mg,产率36.7％)。
4.(1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000403
将(1R,4R,5S)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(600mg,2.8mmol)18冠醚6(739mg,2.8mmol)，叔丁醇钾(627mg,5.6mmol)加入到THF(80mL)中，25℃下反应半小时，再加入4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(1.28g,4.2mmol)和碘化钾(697mg,4.2mmol)，50℃下反应4小时。体系加入EA(100mL)和水(50mL)萃取分液，有机相旋干，柱层析纯化(PE:EA＝2:1)，得到产物(700mg,产率52.2％)。
5.4-((((1R,4R,5S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000411
0℃下，将(1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(700mg,1.46mmol)慢慢加入到含有4M HCl的乙醇溶液(6mL)中，维持0℃反应4小时。反应完毕，在0℃下用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8，体系旋干有机溶剂，加入乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)萃取分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得产物(400mg，产率72.3％)。
6.2-((1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000412
将4-((((1R,4R,5S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(400mg,1.06mmol)，2-溴基苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯(431mg,1.58mmol)，碳酸铯(691mg,2.12mmol)加入到DMA(10mL)中，微波110℃下反应半小时。反应结束，降至25℃，体系加入乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)萃取分液，有机相旋干，经硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)纯化，得产物(450mg,产率74.5％)。
7.2-((1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000413
将2-((1R,4R,5S)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(450mg,0.79mmol)加入到甲醇(5mL)和THF(5mL)的混合溶液中，然后加入含氢氧化锂一水合物(133mg,3.2mmol)的水溶液(2mL)中，体系加热至50℃反应12小时。反应结束后，降至25℃，体系用1N HCl调节pH至4，旋干溶剂，加入乙酸乙酯(100mL)和氯化钠水溶液(50mL)萃取分液，有机相旋干，经硅胶柱层析(DCM:MeOH＝40:1)纯化，得产物(390mg，产率89.1％)。
分子式：C27H23Cl2N3O4S分子量：555.1LC-MS(m/z):556.1(M+H+)
Figure BDA0002909311530000414
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.25(s,1H),8.08-8.04(m,1H),7.62(m,1H),7.47-7.34(m,3H),4.35-4.28(m,2H),3.71-3.68(m,2H),2.68(s,1H),2.15-2.08(m,2H),1.85-1.70(m,2H),1.55-1.48(m,1H),1.30-1.21(m,3H),1.20-1.09(m,2H).
实施例3：2-((1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物3)
Figure BDA0002909311530000421
/>
1.(1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000422
将(1RS,4RS,5RS)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.25g,1.17mmol)溶于THF(30mL)中，加入叔丁醇钾(196mg,1.75mmol)，18-冠醚-6(310mg,1.17mmol)，25℃反应半小时，再加入4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(530mg,1.75mmol)和KI(290mg,1.75mmol)，30℃反应4小时，反应液浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化，得目标产物(450mg，产率80％)。
2.4-((((1RS,4RS,5RS)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑三氟乙酸盐的制备
Figure BDA0002909311530000423
将(1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.4g,0.83mmol)加入到二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(4mL)，25℃反应2小时，浓缩得粗产物(500mg)，直接用于下一步反应。
3.2-((1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000424
将4-((((1RS,4RS,5RS)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑三氟乙酸盐(500mg,粗品)，2-溴苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(338mg,1.24mmol)和碳酸铯(811mg,2.49mmol)加入到DMA(6mL)中，微波120℃反应0.5小时，倒入水(20mL)中，过滤，滤饼经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得目标产物(400mg，两步产率84.5％)。
4.2-((1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000431
将2-((1RS,4RS,5RS)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(200mg,0.35mmol)，氢氧化锂一水合物(80mg,1.9mmol)溶于甲醇(10mL)、四氢呋喃(10mL)和水(10mL)的混合溶剂中，40℃搅拌2小时，浓缩，再向残余物中加入水(10mL)，用1M稀盐酸调pH＝2，用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机层，浓缩，残余物经C18反相硅胶柱层析(甲醇:水＝0％-70％)纯化，得目标产物(50mg，产率25.7％)。
分子式:C27H23Cl2N3O4S分子量:555.1LC-MS(m/z):556.1(M+H+)
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.39(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.10-7.19(m,2H),4.22-4.33(m,2H),4.00-4.03(m,1H),3.64(s,1H),3.36(s,1H),2.76(s,1H),2.06-2.13(m,1H),1.86-1.99(m,2H),1.62(d,J＝10.0Hz,1H),1.20-1.47(m,4H),1.07-1.12(m,2H).
实施例4：2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物4)
Figure BDA0002909311530000432
1.4-氨基-3-氟苯甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000433
将3-氟-4-硝基苯甲酸甲酯(1.99g,10.0mol)，加入到甲醇(200mL)中，加入Pd/C(200mg)，氢化16小时。抽滤，滤液浓缩得标题化合物(1.68g,产率:99.4％)。
2.2-氨基-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000434
将4-氨基-3-氟苯甲酸甲酯(1.68g,9.9mmol)，KSCN(3.84g,39.6mmol)加入到冰乙酸(20mL)中，15分钟后，加入溴素(1.58g,9.9mmol)25℃反应16小时。加入水(100mL)，用氨水调pH至8，抽滤，固体干燥得标题化合物粗品(2.30g)，直接用于下一步反应。
3.2-溴-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000441
将2-氨基-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯粗品(2.30g,9.9mmol)，溴化铜(3.31g,14.9mmol)，加入乙腈(20mL)中。0℃下滴加亚硝酸叔丁酯(1.53g,14.9mmol)滴加完毕25℃搅拌反应1小时，直接浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化，得到标题化合物(480mg,两步总产率:16.7％)。
4.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000442
将2-溴-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(151mg,0.52mmol)，4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(100mg,0.26mmol)和碳酸铯(254mg,0.78mmol)，加入到DMA(2mL)中，110℃反应16小时，加入水和乙酸乙酯各50mL，萃取，有机相浓缩，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)纯化，得到标题化合物(50mg,产率:32.3％)。
5.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000443
将2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(50mg,0.09mmol)，溶解到THF(2mL)和甲醇(2mL)中，加入1M的氢氧化锂(0.9mL)，40℃下搅拌反应1小时用1M的盐酸调pH至4，加入乙酸乙酯(30mL)萃取，有机相浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化，得标题化合物(30mg,产率61.5％)。
分子式：C27H22Cl2FN3O4S分子量：573.1LC-MS(m/z)：574.1(M+H+)
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.18(s,1H),7.76-7.48(m,4H),4.32-4.20(m,2H),3.65-3.58(m,1H),3.45-3.40(m,2H),2.58-2.52(m,1H),2.40-2.28(m,1H),1.95-1.85(m,1H),1.65-1.55(m,1H),1.53-1.42(m,1H),1.20-1.13(m,2H),1.13-1.09(m,2H),0.90-0.78(m,2H).
实施例5：2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物5)
Figure BDA0002909311530000451
1.2-氨基-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000452
/>
将4-氨基-3-甲基苯甲酸甲酯(33.0g,0.2mol)，KSCN(68.0g,0.7mol)于0℃下加入到冰乙酸(200mL)中，0℃下慢慢滴加溴素(31.9g,0.2mol)，滴加完毕转至25℃反应10小时。倒入冰水中，用氨水调pH至8，析出固体，抽滤，干燥后直接用于下一步。
2.2-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000453
0℃下将2-氨基-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(44.5g,0.20mol)，溴化铜(75.9g,0.34mol)溶入乙腈(300mL)中慢慢滴加亚硝酸叔丁酯(24.7g,0.24mol)，滴加完毕25℃搅拌反应3小时，倒入冰水中，析出固体，抽滤，滤饼用混合溶剂(PE:EA＝5:1,600mL)洗涤，滤液浓缩，得到目标产物(34.3g,两步产率60.0％)。
3.4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000454
将(1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(200mg,0.42mmol)加入二氯甲烷(20mL)，加入三氟乙酸(10mL)于25℃下反应2h，反应液浓缩直接用于下一步。
4.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000461
将2-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(120mg,0.42mmol)、4-((((1RS,4RS,5SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(160mg,0.42mmol)和碳酸铯(410mg,1.26mmol)，加入到乙腈(30mL)中，90℃反应10小时，冷却，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝3:1)纯化，得到标题化合物(45mg,两步产率18.4％)。
5.2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000462
将2-((1RS,4RS,5SR)-5-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(45mg,0.077mmol)，一水合氢氧化锂(16mg,0.38mmol)加入到甲醇(8mL)，THF(8mL)，和水(4mL)的混合溶液中，25℃下搅拌反应5小时，用稀盐酸调pH至5，浓缩，得目标产物(34mg，收率77.4％)。
分子式：C28H25Cl2N3O4S分子量：569.1LC-MS(m/z)：570.2(M+H+)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.19(s,1H),7.84(s,1H),7.56-7.50(m,3H),4.36(s,2H),3.63-3.48(m,2H),3.17-3.08(m,1H),2.69-2.62(m,1H),2.55(s,3H),2.48-2.35(m,1H),2.15-2.03(m,2H),1.75-1.68(m,1H),1.49-1.46(m,1H),1.40-1.32(m,2H),1.18-1.21(m,2H)
实施例6：2-((1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物6)
1.(1RS,4SR,6RS)-6-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000463
将(1RS,4SR,6RS)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-6-醇盐酸盐(0.5g,3.3mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入二碳酸二叔丁酯(0.73g,3.3mmol)，三乙胺(0.37g,3.7mmol)，25℃，反应3小时，溶剂旋干，剩余物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得目标化合物(0.65g，产率91.5％)。
2.(1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000471
将(1RS,4SR,6RS)-6-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.1g,0.47mmol)，4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(0.21g，0.69mmol)，叔丁醇钾(79mg，0.70mmol)和18-冠醚-6(0.15g,0.57mmol)，碘化钾(0.12g，0.72mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，加热至60℃搅拌反应3小时。加入水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，分液，水相用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得化合物(0.2g,产率90.9％)。
3.4-((((1RS,4SR,6RS)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-6-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000472
将(1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.20g,0.42mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，冷却至0℃，加入盐酸乙醇溶液(2mL)，反应3小时。反应体系用饱和碳酸氢钠溶液调pH＝7-8，二氯甲烷(10mL×2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得化合物粗品(0.158g,产率100％)直接用于下一步反应。
4.2-((1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000473
将4-((((1RS,4SR,6RS)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-6-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(0.158g,0.42mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(3mL)中，加入2-溴苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(0.23g,0.84mmol)，碳酸铯(0.41g,1.3mmol)，微波加热至100℃，反应30分钟。加入水(30mL)，用乙酸乙酯(20mL×2)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得化合物(0.15g,产率62.5％)。
5.2-((1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000481
将2-((1RS,4SR,6RS)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(0.15g,0.26mmol)溶于四氢呋喃(2mL)和甲醇(2mL)混合溶液中，加入氢氧化钠(52mg,1.3mmol)的水(1mL)溶液，60℃搅拌反应3小时。反应体系用1N盐酸调节pH＝3-4。加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×2)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得化合物(0.11g,产率73.3％)。
分子式：C27H23Cl2N3O4S分子量：555.1LC-MS(m/z):556.1(M+H+)
1H-NMR(400MHz,MeOD)δ:8.33(s,1H),7.98(dd,J1＝8.8Hz,J2＝1.6Hz,1H),7.49-7.51(m,2H),7.41-7.46(m,2H),4.38-4.47(m,2H),3.57-3.58(m,1H),3.42-3.44(m,1H),2.95-3.01(m,1H),2.62-2.65(m,1H),2.32-2.36(m,1H),1.75-1.79(m,1H),1.61-1.69(m,2H),1.33-1.36(m,1H),1.07-1.19(m,4H)
实施例7：2-((1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备(化合物7)
Figure BDA0002909311530000482
1.(1RS,4SR,6SR)-6-((4-硝基苯甲酰基)氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000483
将(1RS,4SR,6RS)-6-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.2g,0.94mmol)，对硝基苯甲酸(0.172g,1.03mmol)，偶氮二甲酸二乙酯(0.24g,1.38mmol)，三苯基膦(0.37g,1.41mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，25℃，反应3小时，溶剂旋干，所得粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得目标产物(0.32g，产率94.1％)。
2.(1RS,4SR,6SR)-6-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000484
将(1RS,4SR,6SR)-6-((4-硝基苯甲酰基)氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.32g,0.88mmol)，氢氧化钾(0.5g,8.9mmol)溶于四氢呋喃(30mL)和水(3mL)的混合溶剂中，25℃搅拌反应16小时。旋干溶剂，所得粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得目标产物(0.13g,产率68.4％)。
3.(1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000491
将(1RS,4SR,6SR)-6-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.13g,0.61mmol)，4-(氯甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(0.28g，0.92mmol)，叔丁醇钾(0.1g，0.89mmol)和18-冠醚-6(0.2g,0.76mmol)，碘化钾(0.15g，0.90mmol)溶于四氢呋喃(20mL)中，加热至60℃搅拌反应3小时。加入水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，分液，水相用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得目标产物(0.25g,产率86.2％)。
4.4-((((1RS,4SR,6SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-6-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑的制备
Figure BDA0002909311530000492
将(1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.25g,0.52mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，冷却至0℃，加入盐酸乙醇(2mL)，反应3小时。反应体系用饱和碳酸氢钠溶液调pH＝7-8，二氯甲烷(10mL×2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物直接用于下一步反应。
5.2-((1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000493
将4-((((1RS,4SR,6SR)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-6-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑(上步粗品,0.52mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(3mL)中，加入2-溴苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(0.28g,1.0mmol)，碳酸铯(0.51g,1.6mmol)，微波加热至100℃，反应30分钟。加入水(30mL)，乙酸乙酯(20mL×2)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得目标产物(0.24g,产率80.0％)。
6.2-((1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸的制备
Figure BDA0002909311530000501
将2-((1RS,4SR,6SR)-6-((5-环丙基-3-(2,6-二氯苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)苯并[d]噻唑-6-羧酸甲酯(0.24g,0.42mmol)溶于四氢呋喃(2mL)和甲醇(2mL)中，加入氢氧化钠(80mg,2.0mmol)的水(1mL)溶液，60℃搅拌反应3小时。1N盐酸调节pH＝3-4，加入水(10mL)，乙酸乙酯(10mL×2)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得目标产物(0.13g,产率56.5％)。
分子式：C27H23Cl2N3O4S分子量：555.1LC-MS(m/z):556.1(M+H+)
1H-NMR(400MHz,MeOD)δ:8.33(s,1H),7.98(dd,J1＝8.8Hz,J2＝1.6Hz,1H),7.49-7.51(m,2H),7.41-7.46(m,2H),4.39-4.47(m,2H),3.57-3.59(m,1H),3.43-3.45(m,1H),2.95-3.01(m,1H),2.62-2.65(m,1H),2.32-2.36(m,1H),1.75-1.79(m,1H),1.61-1.69(m,2H),1.33-1.36(m,1H),1.07-1.20(m,4H)
实施例8：2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸的制备(化合物8)
Figure BDA0002909311530000502
1.4-氨基-3-氟苯甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000503
将3-氟-4-硝基苯甲酸甲酯(3.0g,15.1mmol)溶于MeOH(50mL)中，N2保护下加入Pd/C(1.2g)，25℃下氢化反应3小时。硅藻土过滤掉Pd/C，浓缩得产物(2.5g,产率:98.0％)。
2.2-氨基-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000504
将4-氨基-3-氟苯甲酸甲酯(2.5g,14.8mmol)，KSCN(5.7g,59.1mmol)溶于冰乙酸(50mL)，25℃下搅拌15分钟，滴加溴素(2.4g,14.9mmol)，25℃下继续反应16小时。过滤，滤液加水(50mL)稀释，用氨水调pH＝8，过滤，滤饼经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，得产品(200mg,产率:6.0％)。
3.2-溴-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000511
将2-氨基-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯(200mg,0.88mmol)，CuBr2(395mg,1.77mmol)，溶于乙腈(10mL)中，0℃下滴加亚硝酸叔丁酯(182mg,1.77mmol)，加毕，25℃反应1小时。加入EA(50mL)稀释，水(50mL×3)洗涤，干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，得产物(230mg,产率:89.7％)。
4.(E)-2-三氟甲氧基苯甲醛肟的制备
Figure BDA0002909311530000512
将盐酸羟胺(5.88g,84.7mmol)溶于水(60mL)中，0℃下搅拌，将NaOH(3.5g,87.6mmol)溶于水(60mL)，滴加到反应瓶中，再将2-三氟甲氧基苯甲醛(14g,73.6mmol)溶于无水乙醇(60mL)中，滴加到反应瓶中，加毕25℃反应1小时。加水(300mL)稀释，乙酸乙酯(500mL×3)萃取，合并有机相，干燥浓缩得粗产物(15.4g)。
5.N-羟基-2-(三氟甲氧基)亚胺苄基氯的制备
Figure BDA0002909311530000513
将(E)-2-三氟甲氧基苯甲醛肟(15.4g,粗品)溶于DMF(150mL)中，分批次加入NCS(11.23g,84.1mmol)，保持温度不超过25℃，加毕，25℃反应1小时。加水(150mL)稀释，乙酸乙酯(500mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品(16.6g)。
6.5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000514
将碳酸钾(10.44g,75.52mmol)加入THF(100mL)中，将3-环丙基-3氧代丙酸甲酯(10.44g,73.4mmol)的THF(50mL)溶液加入反应体系，于-10℃搅拌30分钟，于-5℃，向反应体系中加入N-羟基-2-(三氟甲氧基)亚胺苄基氯(16.6g,粗品)的THF(50mL)溶液，然后于35℃反应6小时。加水(200mL)稀释，乙酸乙酯(500mL×3)萃取。有机相干燥浓缩经硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得产品(11.3g，产率:47.1％)。
7.(5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)-甲醇的制备
Figure BDA0002909311530000521
将5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-甲酸甲酯(2.4g,7.33mmol)溶于无水THF(50mL)中，0℃下滴加DIBAL-H(1.5M甲苯溶液,15mL)，加毕，25℃下反应2小时。0℃下，向反应体系中滴加MeOH(2mL)淬灭反应，再加入水(50mL)和乙酸乙酯(100mL)，硅藻土过滤，滤液分液，水相用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，干燥浓缩硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得产品(1.0g，产率:45.6％)。
8.4-(溴甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑的制备
Figure BDA0002909311530000522
将(5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)-甲醇(1g,3.34mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入三苯基膦(1.31g,5.01mmol)，0℃下分批次加入四溴化碳(1.66g,5.07mmol)，加毕，25℃反应2小时。浓缩经硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)得产品(860mg，产率:72.0％)。
9.(1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的制备
Figure BDA0002909311530000523
将(1S,4S,5R)-5-羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(0.15g,0.7mmol)，叔丁醇钾(118mg,1.05mmol)，18冠6(93mg,0.35mmol)溶于THF(20mL)中25℃反应5分钟，再加入4-(溴甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑(280mg,0.77mmol)，25℃反应3小时，浓缩，经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得产物(200mg，产率:57.7％)。
10.4-((((1S,4S,5R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑三氟乙酸盐的制备
Figure BDA0002909311530000524
将(1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(0.2g,0.4mmol)加入到DCM(10mL)中，加入TFA(4mL)，25℃反应2小时，浓缩得粗产物(300mg)。
11.2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0002909311530000531
将4-((((1S,4S,5R)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑三氟乙酸盐(300mg,粗品)，2-溴-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯(256mg,0.88mmol)和碳酸铯(600mg,1.84mmol)加入到DMA(6mL)中，微波110℃反应0.5小时，倒入水(30mL)中，过滤，滤饼经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得产物(200mg，两步产率:82.8％)。
12.2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸的制备
Figure BDA0002909311530000532
将2-((1S,4S,5R)-5-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-4-基)甲氧基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸甲酯(200mg,0.33mmol)，氢氧化锂一水合物(70mg,1.65mmol)溶于甲醇(10mL)，四氢呋喃(10mL)，水(10mL)中，25℃搅拌4.6小时，浓缩，水相用稀盐酸(1M)调pH＝2，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机层，浓缩，残余物经TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得产物(120mg，产率:61.7％)。
分子式:C28H23F4N3O5S分子量:589.56LC-MS(M/e):590.2(M+H+)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.09(s,1H),7.72(d,J＝6.0Hz,1H),7.52(s,2H),7.35-7.38(m,2H),4.29-4.35(m,2H),3.59(s,1H),3.49(s,1H),3.00(s,1H),2.63(s,1H),2.07(s,2H),1.69(s,2H),1.47-1.50(m,1H),1.21(s,2H),1.10(m,2H).

Claims (14)

1.通式(I)所示的化合物，其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，
Figure FDA0004195769040000011
其中，
R1选自3-6元环烷基；
X1、X2分别独立选自O或S；
M选自C1-6亚烷基；
环A为
Figure FDA0004195769040000012
且环A通过环氮原子与L或环B相连；
环B选自任选被一个或多个Q1取代的
Figure FDA0004195769040000013
环B通过环碳原子与L或环A相连；
每个Q1独立地选自卤素原子、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基；
L选自不存在；
Ar选自任选被一个或多个Q2取代的6-10元芳基；
每个Q2独立地选自卤素原子、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基；
并且，式(I)化合物不为以下化合物：
Figure FDA0004195769040000014
Figure FDA0004195769040000021
2.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，R1选自3-4元环烷基。
3.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，R1选自环丙基。
4.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，X1、X2均为O。
5.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q2独立地选自卤素原子、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烷氧基C1-4烷基。
6.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q 2独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基。
7.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，
M为-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-。
8.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，
R1选自环丙基；
X1、X2均为O；
M选自-CH2-；
环A选自
Figure FDA0004195769040000031
且环A通过环氮原子与L或环B相连；
环B选自任选被1个Q1取代的
Figure FDA0004195769040000032
环B通过环碳原子与L或环A相连；
Q1选自氟、氯、甲基、乙基、丙基、异丙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟代乙基、2-氟代乙基、1,1-二氟乙基、1,2-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、1-三氟甲基乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基；
L选自不存在；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q2独立地选自氟、氯、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基。
9.如权利要求8所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，其中，
环B选自
Figure FDA0004195769040000033
环B通过环碳原子与L或环A相连；
Ar选自任选被1-2个Q2取代的苯基；每个Q2独立地选自氟或氯。
10.如权利要求1-9任一项所述的化合物，其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，具有如下通式(II)所示的结构，
Figure FDA0004195769040000041
11.通式(II)所示的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体，
Figure FDA0004195769040000042
其中，R 1为环丙基；X 1、X 2均为O；
Ar为任选被1-2个Q 2取代的苯基；每个Q 2独立地选自氯、甲氧基、三氟甲氧基；
Q1选自氢、氟或甲氧基。
12.含有权利要求1-11任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体的药物制剂，其特征在于包含一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，所述的药物制剂为药学上可接受的任一剂型。
13.权利要求1-11任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体在制备预防和/或治疗由FXR介导的疾病的药物中的用途；
所述的疾病选自动脉粥样硬化、胆汁酸紊乱、原发性硬化性胆管炎、胆固醇结石、纤维化相关疾病、脂肪肝、肝硬化、肝炎、肝脏衰竭、胆汁郁积、胆结石病、心肌梗塞、中风、血栓、I型或II型糖尿病的临床并发症、过度增殖性疾病和炎性肠道疾病。
14.权利要求1-11任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐或它们的立体异构体在制备预防和/或治疗由FXR介导的疾病的药物中的用途，其中，所述疾病选自酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管性肝硬化、慢性肝炎、非病毒性肝炎、酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝炎、良性肝内胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积、药物诱导的胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积、与肠胃营养相关的胆汁淤积、肝外胆汁郁积病症、高胆固醇血症、新生儿黄疸、核黄疸、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病及其临床显性长期糖尿病的其他观察到的结果、肝细胞癌、结肠腺瘤、息肉病、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌和其他形式的胃肠道和肝脏肿瘤性疾病。
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