CN112870446A - 一种构建体外组织工程软骨的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种构建体外组织工程软骨的方法，将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。本发明结合适当天然蛋白软骨仿生支架的构建及一种阶梯状循环动态静水压刺激培养来构建软骨表型维持良好的体外组织工程软骨，支架材料的力学性能、孔隙率等特征均适合软骨细胞的黏附生长与表型维持，阶梯状循环动态静水压刺激体现出了优秀的促软骨细胞生长与表型维持能力。

Description

一种构建体外组织工程软骨的方法
技术领域
本发明属于仿生支架技术领域，涉及一种构建体外组织工程软骨的方法，更具体是涉及一种基于软骨仿生支架协同动态静水压培养构建体外组织工程软骨的方法。
背景技术
软骨中因为缺少血管、淋巴和神经，一旦受损很难自行修复，随着时间的推移，将继发骨性关节炎等疾病。目前临床尚缺乏一种有效的策略来修复或逆转损伤的软骨。近年来，组织工程技术成为了软骨修复的重要发展方向。在软骨组织工程的众多种子细胞中，自体软骨细胞在临床及学术界的应用和研究最为广泛。联合种子细胞、支架材料和细胞因子构建组织工程软骨，为软骨的修复与再生带来了新的希望。然而，软骨细胞来源受限，传统的培养方法导致体外的软骨扩增极易发生去分化而失去软骨表型，最终新生组织以纤维软骨为主，其组织学与生物力学特性明显降低，导致修复失败。因此，如何选择合适的支架材料、恰当的培养条件等来协同构建适宜的细胞生长微环境，最终实现软骨细胞的正常生长与表型维持变得异常重要。
从支架材料来看：支架材料作为种子细胞的载体和软骨细胞外基质的临时替代物，理想的状态是能够促进软骨细胞的黏附、增殖和细胞外基质的分泌，进而维持软骨的表型特征，并能随着软骨组织的重建(植入体内后)逐渐降解。当前的支架材料主要包括合成生物材料和天然生物材料，合成材料便于大量生产、力学性能强，但生物相容性相对较差；天然材料总体来讲生物相容性优，但其力学性能相对较弱。丝素蛋白等天然蛋白作为一类特殊的天然材料，既具有来源广泛、便于大量生产的优势，也具有优异的生物相容性、可控的降解性、无免疫源性、优良的加工性等，因而成为了软骨组织工程支架的理想材料之一。然而，纯蛋白软骨支架的孔径小、力学强度低，不利于软骨的长入和生长。研究表明(ACSSustainable Chem Eng,2020,8,2375-2389)，纯丝素蛋白支架的力学性能可以通过与部分细菌纤维素纤维的复合得到一定程度的改善。
从培养条件来看：传统的培养方式一般是在静态培养条件下添加一定量的化学因子，以促进软骨细胞的增殖和表型维持。然而，此类条件诱导或培养获得的软骨细胞易发生肥大或钙化，也较易发生去分化而失去软骨表型，甚至出现大量纤维化软骨。近年来，基底材料的物理特征，如材料的软硬度等也被发现能在一定程度上影响细胞的功能或表型维持。此外，一些动态培养刺激对细胞功能或表型维持的影响也逐渐被揭示。例如，传统培养体系中软骨细胞极易发生去分化，文献报道表明静态静水压培养(Materials Lett.,2019,246:71-75)和一种正弦波状静水压刺激培养(Tissue Eng.PT.A,2012,18:1979-1991)均可在一定程度上提升软骨细胞的表型维持，进而部分改善静态培养中遇到的难题。
截至目前，体外组织工程软骨制备领域中的支架材料构建及培养条件的优化方面仍有较大提升空间，以最终实现软骨细胞的正常生长与表型维持。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于软骨仿生支架协同动态静水压培养构建体外组织工程软骨的方法；本发明结合一种天然蛋白力学仿生支架的构建，同时协同一种新颖的阶梯状循环动态静水压刺激培养，可以构建出一种综合性能优异的体外组织工程软骨，有望用于体内软骨缺损修复。
本发明的一种构建体外组织工程软骨的方法，结合适当天然蛋白软骨仿生支架的构建及一种新颖的阶梯状循环动态静水压刺激培养来构建软骨表型维持良好的体外组织工程软骨。支架材料的力学性能、孔隙率等特征均适合软骨细胞的黏附生长与表型维持，阶梯状循环动态静水压刺激由于兼具软骨仿生刺激特性和较佳的动态变化特性而体现出了优秀的促软骨生长与表型维持能力。利用此复合手段进行体外构建的组织工程软骨在软骨修复领域具有良好的应用前景。
为达到上述目的，本发明采用的方案如下：
一种构建体外组织工程软骨的方法，将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；
软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；
阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，按支架体积计算，软骨细胞的接种密度为6×106cells/立方厘米以上。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，刺激培养的总时间为1～8个周期。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激0.5h～2h，持续刺激5天后休息2天。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，软骨仿生支架的制备过程为：先将纳米纤维束与天然蛋白水溶液混合均匀得到混合液，再向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；然后将交联体系置于模具中交联形成水凝胶；最后将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架。
为解决现有软骨组织培养构建技术中软骨细胞生长不佳、容易丧失软骨表型维持的问题，本发明以具有良好生物相容性的天然蛋白为基体，以纳米纤维束为增强改性体，随后通过化学交联、冷冻干燥工艺的结合制备软骨力学仿生支架。其具体形成和调控机理如下：当将一定浓度配比的天然蛋白水溶液、无毒交联引发剂、纳米纤维束通过外界机械力作用均匀混合处理一段时间，然后将混合物倒入模具中交联成型。交联条件为37℃交联，较为温和，此方案可用于前期在体系中加入具有较高生物活性的生长因子等活性蛋白材料而不破坏其生物活性。交联过程将形成具有良好互通网络的水凝胶体系。由于纳米纤维束在水凝胶体系中的穿插、一方面将提升支架的孔径、另一方面还将提升支架材料的宏观力学强度。高的孔径和孔隙率有利于细胞向支架内部生长及营养物质、代谢废物的交换，进而更适宜于细胞的生长、长入和软骨表型维持。体系交联后将样品放置到低温下冻实，最后将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，使体系中冰晶升华便得到所需的多孔支架。同时，支架构筑所用的丝素蛋白等天然材料具有良好且可调的降解性能，且降解产物无毒、在体内易于代谢排除，因而也满足植入体内修复过程中的降解需求。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，软骨仿生支架的孔隙率为85％～95％，平均孔径为100～200μm，压缩强度为0.7～1.7MPa，弹性模量为0.4～1.4MPa。本发明的软骨仿生支架与天然软骨组织具有良好的力学匹配性，可达到较好的力学性能仿生。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，天然蛋白水溶液的浓度为3～12wt％；混合液中，天然蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；所述天然蛋白为丝素蛋白(SF)、弹性蛋白、明胶和纤维蛋白中的一种以上；H2O2水溶液的浓度为490mM；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％；HRP溶液是将HRP(辣根过氧化物酶)溶于PBS缓冲液中得到，HRP溶液的浓度为1000U/mL；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，纳米纤维束的平均直径为30～500nm；纳米纤维束的材质为细菌纤维素、聚乙烯醇、聚乳酸、聚己内酯或者丝素；
模具为圆柱形模具，直径为5～15mm，高度为1～10mm的；交联时间为0.5～4h；交联温度为37℃。
如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-60～-120℃，冷冻时间为6～24h，冷冻干燥时间为12～48h。
本发明的一种构建体外组织工程软骨的方法，与对照组(静态培养组)对比，软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调(即数据之间具有统计学差异)。构建体大体观更为丰满厚实；构建体细胞数量更多，内部也有明显的细胞生长与分布。
本发明的原理是：
本发明的一种构建体外组织工程软骨的方法，引入阶梯状循环动态静水压刺激培养条件。阶梯状循环动态静水压提供周期性的静水压力刺激和压力突变刺激，将明显加快内部细胞代谢废物的排除与营养物质的交换，可同时为支架表面和内部的细胞提供良好的生长环境。由于兼具软骨仿生刺激特性和较佳的动态变化特性，与静态培养和静态静水压刺激培养相比可明显提升软骨基质的表达与软骨细胞的表型维持。另外，对比发现，已报道的正弦波状静水压刺激与静态培养相比，显示软骨特征性基因Aggrecan下调，ColⅡ和SOX9上调(Correia C,et al.Tissue Eng.PT.A,2012,18:1979-1991)，本发明中的阶梯状循环动态静水压培养与静态培养相比，Aggrecan、ColⅡ和SOX9的表达均有明显上调，效果同样显著优于已报道的正弦波状静水压刺激培养。正弦波状静水压刺激中静水压力的大小变化是相对连续的，无明显的突变节点；而阶梯状循环动态静水压刺激中静水压力的大小变化存在明显的突变进程，进而提供了较多的静水压力突变节点。在静水压由大到小的突变节点，整个构建体(含多孔结构)将会有一个体积由小到大的快速变化，构建体外部的新鲜培养液将会快速进入支架内部；而在静水压由小到大的突变节点，整个构建体将会有一个体积由大到小的快速变化，构建体内部含细胞代谢废物的培养液将会被快速排出。阶梯状动态静水压刺激会如此循环进行，这些循环的静水压力突变节点将会明显加快支架内部细胞代谢废物的排除与营养物质的交换，并使得整个交换过程更为彻底、有效。进一步地，本发明中，每个阶梯的静水压力在0.1MPa～10MPa之间选择，与生理状态下的软骨组织受力范围相匹配。相邻阶梯中静水压力的大小相差1.5倍及以上，以满足较好的突变特性。
本发明将适宜浓度的纳米纤维束和交联引发剂(即HRP/H2O2)复合到天然蛋白溶液中，再通过化学交联—冷冻处理—冷冻干燥等工序制备获得具有较高孔径与孔隙率、适宜力学性能的软骨支架。适宜浓度纳米纤维束的复合可同时达到增大支架孔隙结构和提升支架材料力学性能的目的。具有较高孔径、孔隙率与仿生力学性能的支架材料结合新颖的仿生阶梯状循环动态静水压刺激培养在促进软骨细胞生长和表型维持方面起着至关重要的作用。如果支架的孔径过小，细胞不能长入到支架内部，即使后续有阶梯状循环动态静水压刺激培养促进物质交换，细胞仍难以长入支架内部，因而难以形成综合性能优异的体外组织工程软骨。此外，若支架的力学性能过低，其将在后续静水压刺激下发生严重坍塌变形而难以维持形状，亦难以形成综合性能优异的体外组织工程软骨。另外，具有力学仿生性能的支架也可以更好地维持软骨表型特征，如后续将构建体植入体内，由于其具有较佳的力学匹配性能，软骨修复效果也会更好。
有益效果
(1)本发明的一种构建体外组织工程软骨的方法，结合适当天然蛋白软骨仿生支架的构建及一种新颖的阶梯状循环动态静水压刺激培养，可以构建出一种综合性能优异的体外组织工程软骨，有望用于体内软骨缺损的修复；
(2)传统静态培养体系中软骨细胞极易发生去分化，静态静水压刺激培养可在一定程度上改善上述情况，而本发明所引入的阶梯状循环动态静水压刺激培养，较静态静水压刺激培养及正弦波状静水压刺激培养在促进软骨细胞生长和表型维持方面均更具明显优势。
附图说明
图1为纯SF(丝素蛋白)和SF/BCNR(细菌纤维素纳米纤维束)复合支架的电镜照片；
图2为软骨细胞-支架复合体在不同培养方式下培养7天后的电镜照片；
图3为不同培养方式下培养21天后获得的组织工程软骨样品中软骨特异性基因Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)和软骨特异性转录因子(SOX9)的相对表达量。“*”：p＜0.05，具有显著性差异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为130nm且材质为细菌纤维素的纳米纤维束；浓度为6wt％的丝素蛋白水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与丝素蛋白水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，丝素蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的5vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的5vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联0.5h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为8mm，高度为2mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架(即SF/BCNR复合支架)；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-80℃，冷冻时间为12h，冷冻干燥时间为12h。
如图1所示，图中分别为纯SF(丝素蛋白)支架(直接由6wt％的丝素蛋白水溶液制得)和上述制得的SF/BCNR(细菌纤维素纳米纤维束)复合支架的电镜照片；其中，SF/BCNR(细菌纤维素纳米纤维束)复合支架的孔隙率为95％，平均孔径为170μm，压缩强度为1.4MPa，弹性模量为1.2MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为6×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为3个周期，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激1h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：1MPa(30s)-3MPa(30s)-5MPa(30s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间，“-”为区分相邻阶梯而设，无实际含义。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调，具体为：Ⅱ型胶原(ColⅡ)为静态培养的3.1倍(上调)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)为静态培养的1.8倍(上调)、软骨特异性转录因子(SOX9)为静态培养的1.6倍(上调)。
本发明相较于现有技术中采用的正弦波状静水压刺激培养(文献为：Correia C,et al.Tissue Eng.PT.A,2012,18:1979-1991)，其特征基因相对表达情况分别为：Ⅱ型胶原(ColⅡ)为静态培养的2.9倍(上调)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)为静态培养的0.1倍(下调)、软骨特异性转录因子(SOX9)为静态培养的2.1倍(上调)。
通过对比，可以发现：
本发明显示软骨特征基因ColⅡ、Aggrecan和SOX9的表达均有明显上调，这是因为当组织具有一定的厚度时，会阻碍内部营养物质的运输和代谢废物的排放。传统的静态培养不利于构建体内部的物质交换，内部细胞难以生长和存活。阶梯状动态静水压刺激可提供周期性的静水压力刺激和压力突变刺激，将明显加快内部细胞代谢废物的排除与营养物质的交换，促进细胞向支架内部的渗透生长，同时为支架表面和内部的细胞提供良好的生长环境，促使软骨细胞持续增殖，并促进软骨细胞分泌特征性细胞外基质。
将采用的正弦波状静水压刺激培养的样品与采用静态培养的样品进行比较，正弦波状静水压刺激培养的样品显示软骨特征性基因ColⅡ和SOX9上调，Aggrecan下调，这是因为正弦波状静水压刺激培养也提供了一种动态静水压刺激，与传统的静态培养相比，正弦波状静水压刺激在一定程度上也促进了营养物质和代谢废物的传输，因而在一定程度上改善了静态培养中遇到的问题。
综合三种培养方式来看，本发明的方法明显优于其他两种，具体表现为本发明的样品中，构建体内部的软骨细胞数量更多，软骨细胞外基质沉积也更多，见图2。此外，本发明中软骨特征性基因ColⅡ、Aggrecan和SOX9的表达均明显更高，见图3，其主要原因在于传统的静态培养不利于细胞的长入和构建体内部的物质交换；而正弦波状静水压刺激中静水压力的大小变化是相对连续的，无明显的突变节点；而阶梯状循环动态静水压刺激中静水压力的大小变化存在明显的突变进程，进而提供了较多的静水压力突变节点。在静水压由大到小的突变节点，整个构建体(含多孔结构)将会有一个体积由小到大的快速变化，构建体外部的新鲜培养液将会快速进入支架内部；而在静水压由小到大的突变节点，整个构建体将会有一个体积由大到小的快速变化，构建体内部含细胞代谢废物的培养液将会被快速排出。阶梯状动态静水压刺激会如此循环进行，这些循环的静水压力突变节点将会明显加快支架内部细胞代谢废物的排除与营养物质的交换，并使得整个交换过程更为彻底、有效，进而最利于软骨细胞的长入、增殖及软骨相关特征基因和蛋白的表达。
实施例2
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为30nm且材质为聚乙烯醇的纳米纤维束；浓度为5wt％的弹性蛋白水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与弹性蛋白水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，弹性蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的3vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的4vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联2h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为7mm，高度为4mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-100℃，冷冻时间为14h，冷冻干燥时间为32h。
制得的软骨仿生支架的孔隙率为94％，平均孔径为140μm，压缩强度为1.2MPa，弹性模量为0.7MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为7×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为7天，具体是每天刺激2h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：0.5MPa(10s)-7.5MPa(50s)-2.5MPa(100s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调。
实施例3
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为100nm且材质为聚乳酸的纳米纤维束；浓度为12wt％的明胶水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与明胶水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，明胶和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的6vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的5vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联0.6h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为10mm，高度为1mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-60℃，冷冻时间为24h，冷冻干燥时间为12h。
制得的软骨仿生支架的孔隙率为85％，平均孔径为100μm，压缩强度为1.7MPa，弹性模量为1.4MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为8×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为5个周期，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激1.5h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：0.1MPa(30s)-0.5MPa(10s)-2MPa(30s)-6MPa(80s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调。
实施例4
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为200nm且材质为聚己内酯的纳米纤维束；浓度为9wt％的纤维蛋白水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与纤维蛋白水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，纤维蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的2vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的2vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联4h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为12mm，高度为10mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-120℃，冷冻时间为6h，冷冻干燥时间为48h。
制得的软骨仿生支架的孔隙率为88％，平均孔径为120μm，压缩强度为1.5MPa，弹性模量为1.1MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为9×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为2个周期，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激1.25h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：0.5MPa(40s)-1.6MPa(40s)-9MPa(60s)-3.75MPa(60s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调。
实施例5
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为350nm且材质为丝素的纳米纤维束；浓度为7wt％的明胶水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与明胶水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，明胶和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的3vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的3vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联1.5h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为15mm，高度为7mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-105℃，冷冻时间为18h，冷冻干燥时间为40h。
制得的软骨仿生支架的孔隙率为91％，平均孔径为200μm，压缩强度为0.7MPa，弹性模量为0.4MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为8×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为6个周期，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激1.2h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：0.1MPa(10s)-1.2MPa(10s)-0.4MPa(90s)-10MPa(10s)-3.6MPa(50s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调。
实施例6
一种体外组织工程软骨的构建方法，具体步骤为：
(1)软骨仿生支架的制备；
(1.1)原料的准备；
平均直径为500nm且材质为丝素的纳米纤维束；浓度为3wt％的纤维蛋白水溶液；浓度为490mM的H2O2水溶液；浓度为1000U/ml的HRP溶液(HRP溶于PBS缓冲液中得到)；
(1.2)将纳米纤维束与纤维蛋白水溶液混合均匀得到混合液；混合液中，纤维蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；
(1.3)向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的5vol％；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的6vol％；
(1.4)将交联体系置于圆柱形模具中，在37℃下交联0.5h，形成水凝胶；其中圆柱形模具的直径为9mm，高度为8mm；
(1.5)将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架；
其中冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-90℃，冷冻时间为20h，冷冻干燥时间为36h。
制得的软骨仿生支架的孔隙率为92％，平均孔径为150μm，压缩强度为1MPa，弹性模量为0.9MPa；
(2)将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，接种密度为6×106cells/立方厘米，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养，刺激培养的总时间为8个周期，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激0.5h，持续刺激5天后休息2天；其中，阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，具体为：2MPa(40s)-3.5MPa(80s)，重复循环进行相应刺激培养。其中，括号外的数据表示每个阶梯对应的静水压力，括号内的数据表示每个阶梯对应的静水压力的持续时间。
将培养之后的样品记为“阶梯状动态静水压刺激培养”；
(3)将软骨细胞接种到步骤(1)制得的软骨仿生支架上，基本同步骤(2)，不同之处仅在于采用的是静态培养，不施加任何静水压刺激，将培养之后的样品记为“静态培养”。
将上述样品进行特征基因相对表达情况测试，结果发现，相对于静态培养，阶梯状动态静水压刺激培养得到的样品，其软骨特征基因聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和软骨特异性转录因子(SOX9)的表达量均更高(即上调)，且明显上调。

Claims (9)

1.一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征是：将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；
软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；
阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。
2.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，按支架体积计算，软骨细胞的接种密度为6×106cells/立方厘米以上。
3.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，刺激培养的总时间为1～8个周期。
4.根据权利要求3所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激0.5h～2h，持续刺激5天后休息2天。
5.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，软骨仿生支架的制备过程为：先将纳米纤维束与天然蛋白水溶液混合均匀得到混合液，再向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP(辣根过氧化物酶)溶液，形成交联体系；然后将交联体系置于模具中交联形成水凝胶；最后将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架。
6.根据权利要求5所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，软骨仿生支架的孔隙率为85％～95％，平均孔径为100～200μm，压缩强度为0.7～1.7MPa，弹性模量为0.4～1.4MPa。
7.根据权利要求5所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，天然蛋白水溶液的浓度为3～12wt％；混合液中，天然蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；所述天然蛋白为丝素蛋白、弹性蛋白、明胶和纤维蛋白中的一种以上；H2O2水溶液的浓度为490mM；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％；HRP溶液是将HRP溶于PBS缓冲液中得到，HRP溶液的浓度为1000U/mL；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％。
8.根据权利要求5所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，纳米纤维束的平均直径为30～500nm；纳米纤维束的材质为细菌纤维素、聚乙烯醇、聚乳酸、聚己内酯或者丝素；
模具为圆柱形模具，直径为5～15mm，高度为1～10mm的；交联时间为0.5～4h；交联温度为37℃。
9.根据权利要求5所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，冷冻干燥工艺中的冷冻温度为-60～-120℃，冷冻时间为6～24h，冷冻干燥时间为12～48h。
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