CN112870380B - Bpoz基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用。通过研究发现，BPOZ是E3泛素连接酶支架蛋白Cullin3的衔接蛋白，其可与Cullin3及caspase‑1p10/p20活性亚基结合形成复合体，由此BPOZ会招募E3泛素连接酶支架蛋白Cullin3到caspase‑1活性亚基p10/p20上，从而以泛素化修饰的方式造成caspase‑1p10/p20稳定性降低或降解，降低caspase‑1对pro‑IL‑1β的切割活性，减少促炎性细胞因子IL‑1β的成熟和分泌，缓解炎症应答强度。基于上述原理，通过过表达BPOZ或促进BPOZ高表达，可得到用于治疗过度炎症反应性疾病的药物。

Description

BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域，具体涉及BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用。
背景技术
为了防御病毒和细菌感染,固有免疫系统可通过模式识别受体(PatternRecognitionReceptors，PRRs)识别病原微生物中保守的病原相关分子模式(Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs)以及自身急性损伤过程中产生的损伤相关分子模式(Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs)，起始免疫应答。炎症小体是细胞内多蛋白信号复合物，主要存在于骨髓细胞中。当细胞膜上的PRR识别到PAMPs和DAMPs等危险信号后，便会通过同源域的相互作用形成这种多蛋白复合物，招募的聚集caspase-1前体蛋白，并使之通过自裂解的方式激活，切割pro-IL-1β和pro-IL-18，调控促炎性细胞因子 IL-1β和IL-18的释放，或导致细胞焦亡。炎症小体在机体防御过程中具有重要作用，其适度激活对清除病原微生物等损伤起到重要作用。然而过度炎症反应则会导致自身炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢类疾病及肿瘤等多种疾病，具体例如心血管疾病、肝炎、肾炎、创面愈合延迟等。如果能够通过一定手段抑制过度炎症反应性，则可以达到缓解或治疗这类因过度炎症反应所引发的疾病。已有报道表明BPOZ是E3泛素连接酶支架蛋白Cullin3的衔接蛋白，但BPOZ对炎症反应的影响及影响机制尚不清楚。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提出BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用，BPOZ基因被证实为炎症反应的一个负调控因子，通过过表达BPOZ基因可以调控减少促炎性细胞因子 IL-1β的分泌和释放，缓解炎症应答强度，从而缓解或治疗这类因过度炎症反应所引发的疾病。
BPOZ基因与驱动其表达的高活性启动子通过腺相关病毒或慢病毒等病毒载体，导入体细胞，在体细胞中过表达BPOZ蛋白，达到抑制过度炎症反应的目的。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
方案一：BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用。
优选地，所述过度炎症反应性疾病包括过度炎症反应导致的自身炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢类疾病或肿瘤。
方案二：一种炎性应答抑制剂，其包含所述BPOZ基因。
优选地，所述炎性应答抑制剂还包含驱动所述BPOZ基因过表达的高活性启动子。
优选地，所述炎性应答抑制剂为携带有所述BPOZ基因的腺相关病毒颗粒或慢病毒颗粒。
优选地，所述炎性包括由经典或非经典炎症小体诱导的炎性反应。
优选地，所述经典炎症小体为NLRP3或NLRP4；所述非经典炎症小体为V.Cholerae、E.Coli或CTB。
方案三：一种以促进BPOZ基因高表达为治疗靶点的炎症应答抑制剂。
方案四：过表达BPOZ基因的载体在制备用于治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用。
优选地，所述疾病为结肠炎。
(三)有益效果
通过研究发现，BPOZ是E3泛素连接酶(E3泛素连接酶是一个能够将泛素分子连接到目的蛋白质)支架蛋白Cullin3的衔接蛋白，BPOZ与 Cullin3及caspase-1p10/p20活性亚基结合形成复合体(BPOZ会招募E3 泛素连接酶支架蛋白Cullin3到caspase-1活性亚基p10/p20上)，导致以泛素化修饰的方式造成caspase-1p10/p20稳定性降低或降解，降低caspase-1对pro-IL-1β的切割活性，减少促炎性细胞因子IL-1β的成熟和分泌，缓解炎症应答强度，对炎症应答过程起到调控作用。
基于上述原理，本发明通过设计过表达BPOZ的基因药物，可治疗过度炎症反应性疾病，包括自身炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢类疾病及肿瘤等。此外，一些基于促进BPOZ基因高/过表达为调控手段的炎症应答抑制剂都应当涵盖在本发明请求保护的范围内。
附图说明
图1中，(A)是以BPOZ+/+、BPOZ-/-及BPOZ+/-三种基因型的小鼠为研究对象(n＝10/每组)，以50mg/kg的剂量通过腹腔注射LPS，96h内观察并统计小鼠死亡率情况。*p<0.05，**p<0.001。(B)-(D)依次是以 BPOZ+/+、BPOZ-/-及BPOZ+/-这三种基因型的小鼠为研究对象(n＝6/每组)，以50mg/kg的剂量通过腹腔注射LPS，3.25h后，腹腔注射50μ L100mMATP,作用15min。利用ELISA检测试剂盒，检测小鼠血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α水平比较，**p<0.001。
图2中，(A)-(C)为野生型(BPOZ+/+，n＝8)和BPOZ缺失(BPOZ-/-， n＝8)小鼠喂食含有2％DSS的饮用水5天，接着喂食正常饮用水直到实验结束，在喂食2％DSS开始后每日检测小鼠体重变化(A)、粪便粘稠度情况比较(B)、小鼠直肠便血情况比较(C)。(D)-(E)为第10天，取小鼠盲肠、结肠、直肠和脾，比较结肠长度比较(D)及拍摄的照片(E)。(F)-(G)分别取小鼠第5天、第10天、第15天结肠进行 HE染色(G)显示的炎症面积及组织病理学的半定量评分(F)。
图3中，(A)-(C)为从BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠中分离并培养原代巨噬细胞(BMDMs)，用NLRP3刺激物(ATP、MSU、CPPD、Nigericin 和Poly(I:C))、NLRP4刺激物Flagellin、AIM2刺激物PolydA:dT、非经典信号通路刺激物(V.Cholerae、E.Coli和CTB)处理细胞后，检测细胞上清中IL-1β的水平比较。(D)为通过合成BPOZ特异性的siRNA oligos 敲低人源THP-1细胞中的BPOZ后，用BPOZ抗体检测BPOZ的敲低效率。(E)为采用基因工程手段敲低BPOZ的人源THP-1细胞后，利用经典和非经典刺激物进行处理细胞，分析细胞上清中IL-1β水平变化情况。
图4中，(A)为以HEK293T细胞为研究对象，向细胞内共转染 GFP-pro-caspase-1、Flag-BPOZ和Flag空载体，利用免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与pro-caspase-1和切割体的相互作用。(B)为以HEK293T 细胞为研究对象，向细胞内共转染HA-BPOZ、Flag-pro-caspase-1、 Flag-caspase-1 p10、Flag-caspase-1 p20和Flag空载体，利用免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与pro-caspase-1、caspase-1 p10、caspase-1 p20的相互作用。
图5中，(A)为以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内转染 Myc-Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5，共转Flag-BPOZ 或Flag空载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与CULs的相互作用。(B)为以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内转染Myc-Cullin1、 Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5，共转Flag-BPOZ或Flag 空载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与CULs的相互作用。(C) 为以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内转染 Flag-DN-Cullin3/Flag-DN-Cullin4A，同时分别共转染HA-BPOZ、V5-caspase-1 p20和Myc-Ub，利用泛素化实验和免疫印迹检测DN-Cullin3 和DN-Cullin4A对caspase-1 p20泛素化水平的影响。(D)为以HEK293T 细胞为研究对象，向细胞内共转染HA-BPOZ、Myc-Cullin3和 Flag-caspase-1 p20或Flag空载体，两步免疫共沉淀后利用免疫印迹检测HA-BPOZ、Myc-Cullin3和Flag-caspase-1 p20。(E)为以HEK293T细胞为研究对象，向细胞内共转染HA-BPOZ、Myc-Cullin3和Flag-caspase-1 p10或Flag空载体，两步免疫共沉淀后利用免疫印迹检测HA-BPOZ、 Myc-Cullin3和Flag-caspase-1 p10。
图6中，(A)为以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内转染定量的Flag-pro-caspase-1、Flag-caspase-1 p10、Flag-caspase-1 p20，同时共转不同量的HA-BPOZ，利用免疫印迹检测BPOZ对Flag-pro-caspase-1、 Flag-caspase-1 p10和Flag-caspase-1 p20稳定性的影响。
(B)-(C)为以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内共转染 Flag–pro-caspase-1和pro-IL-1β，分别共转入HA-BPOZ和HA空载体利用免疫印迹检测BPOZ对pro-caspase-1、pro-IL-1β、caspase-1 p10、 caspase-1 p20和IL-1βp17稳定性的影响；利用ELISA检测细胞上清中 IL-1β的分泌。
(D)-(E)为用NLRP3刺激物MSU、CPPD、Nigericin和Poly(I:C)、 NLRP4刺激物Flagellin、AIM2刺激物PolydA:dT刺激BPOZ+/+和 BPOZ-/-BMDMs细胞或用LPS+ATP处理不同时间，利用免疫印迹的方法，检测细胞内caspase-1的切割水平。
图7为：对小鼠通过灌肠和尾静脉注射5×1010pAAV-空和 pAAV-BPOZ，每周一次、持续3周后，分别喂食含有4％DSS的饮用水7 天，接着喂食正常饮用水直到实验结束，15天内观察并统计小鼠死亡率情况，研究BPOZ在小鼠体内过表达对DSS诱导的结肠炎的抑制作用。*p<0.05。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明具体实施方式内容包括以下几个部分：
一、构建BPOZ+/+、BPOZ-/-小鼠的败血症模型，分析BPOZ缺失前后小鼠对炎症的敏感性变化，检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平。
二、构建BPOZ+/+、BPOZ-/-小鼠的结肠炎模型，分析BPOZ缺失前后小鼠对炎症的敏感性变化，包括小鼠体重、小鼠粪便黏度、便血情况、观察结肠长度、HE染色显示的溃疡面积、炎症程度半定量评分等。
三、分离培养BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠的原代巨噬细胞(BMDMs)进行体外分析研究，分析这些细胞在NLRP3刺激物(ATP、MSU、CPPD、 Nigericin和Poly(I:C))等经典刺激物和非经典刺激物作用下IL-1β的分泌情况。
四、在HEK293T细胞中过表达带GFP标签的pro-caspase-1和BPOZ，通过免疫共沉淀的方法分析BPOZ与caspase-1及其活性亚基 caspase-1 p20和caspase-1 p10间的相互作用，进一步确定BPOZ与炎症信号通路的连接机制。
五、构建小鼠的结肠炎致死模型，分析BPOZ过表达小鼠对炎症的敏感性影响。
按照上述顺序分别说明如下。
(一)、构建BPOZ+/+、BPOZ-/-小鼠的败血症模型，分析BPOZ(序列如SEQ ID NO：1)缺失前后小鼠对炎症的敏感性变化；检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。具体方法和试验结果如下：
以BPOZ+/+(野生型小鼠)、BPOZ-/-(缺失纯合小鼠)及BPOZ+/-(杂合小鼠)这三种基因型的小鼠为研究对象，以50mg/kg的剂量通过腹腔注射LPS(细菌内毒素，诱导小鼠败血症)，注射后8、24、48小时，利用ELISA检测试剂盒，检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；96小时内观察并计算小鼠的致死率。
参见图1的(A)，是以BPOZ+/+、BPOZ-/-及BPOZ+/-三种基因型的小鼠为研究对象(n＝10/每组)，以50mg/kg的剂量通过腹腔注射LPS，96h 以内观察并计数小鼠死亡率。*p<0.05，**p<0.001。
结果显示，BPOZ缺失纯合小鼠(BPOZ-/-)和杂合小鼠(BPOZ+/-) 小鼠的死亡率显著高于野生型小鼠(BPOZ+/+)(如图1A)。其中，BPOZ-/-与BPOZ+/+正常小鼠相比，死亡迅速，死亡率呈显著差异。LPS注射20h 后，野生型小鼠尚无小鼠死亡，而BPOZ缺失小鼠(BPOZ-/-)已经全部死亡，杂合小鼠死亡50％左右。
参见图1的(B)、(C)、(D)分别是以BPOZ+/+、BPOZ-/-及BPOZ+/-这三种基因型的小鼠为研究对象(n＝6/每组)，以50mg/kg的剂量通过腹腔注射LPS，3.25h后，腹腔注射50μL100mMATP,作用15min。利用ELISA 检测试剂盒，检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，**p<0.001。
上述实验结果与图1A的结果相一致，BPOZ-/-和BPOZ+/-小鼠血清中 IL-1β的水平显著高于BPOZ+/+小鼠(如图1的B)。相比之下，依赖于 Toll样受体信号途径的IL-6(如图1的C)和TNF-α(如图1的D)则没有明显变化。该研究结果说明BPOZ缺失促使小鼠对LPS诱导的败血症更加敏感，且影响着依赖于NLRP3受体途径的IL-1β的分泌水平。
(二)、构建BPOZ+/+、BPOZ-/-小鼠的结肠炎模型，分析BPOZ缺失前后小鼠对炎症的敏感性变化，包括小鼠体重、小鼠粪便黏度、便血情况、观察结肠长度、HE染色显示的溃疡面积、炎症程度半定量评分等。
具体方法和试验结果如下：
以BPOZ+/+、BPOZ-/-及BPOZ+/-这三种基因型的小鼠为研究对象，在其饮用水中连续5天加入3％DSS(葡聚糖硫酸钠，诱导小鼠溃疡性结肠炎)，撤药后连续9天观察小鼠计算死亡率；在其饮用水中连续5天加入3％DSS，之后改喝普通水15天，记录每天的体重变化、粪便粘性及出血等情况；在第5天、9天和20天后将小鼠处死，取结肠观察其形态变化、HE染色观察其显微变化、比较结肠长度、溃疡面积等。
参见图2(A)-(C)所示，野生型(BPOZ+/+，n＝8)和BPOZ缺失 (BPOZ-/-，n＝8)小鼠喂食含有2％DSS的饮用水5天，接着喂食正常饮用水直到实验结束，在喂食2％DSS开始后每日检测小鼠体重(见图2的A)、粪便粘稠度(见图2的B)、小鼠直肠便血情况(见图2的C)。
上述实验结果显示，相比于野生型，BPOZ缺失后小鼠的体重降低的更加明显(图2的A)；粪便黏度及便血情况的打分结果显示，BPOZ缺失后小鼠粪便的黏度更低(图2的B)，便血更严重(图2的C)，且更难恢复。
参见图2(D)-(E)，在第10天，取小鼠盲肠、结肠、直肠和脾，比较结肠长度(图2的D)并拍照(图2的E)。实验结果显示，BPOZ-/-小鼠的结肠更短(图2的D-E)，说明其受损严重。
参见图2(F)-(G)，分别取小鼠第5天、第10天、第15天结肠进行HE染色(图2的G)及组织病理学的半定量评分(图2的F)。结果显示，BPOZ+/+小鼠的结肠仅有少量的溃疡(图2的F的HE染色显示炎症面积)；半定量打分的结果也表明BPOZ-/-小鼠的结肠炎较BPOZ+/+小鼠更加严重(图2的G)。
上述结果均表明：BPOZ对于DSS诱导的结肠炎具有保护作用。
(三)培养BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠的原代巨噬细胞(BMDMs)和敲低了BPOZ的人源THP-1细胞，并进行体外分析研究，分析这些细胞在 NLRP3刺激物(ATP、MSU、CPPD、Nigericin和Poly(I:C))等经典刺激物和非经典刺激物作用下IL-1β的分泌情况。具体方法和试验结果如下：
(1)从BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠中分离并培养原代巨噬细胞 (BMDMs)，分析细胞在经典和非经典刺激物作用下IL-1β的分泌情况
从BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠中分离并培养原代巨噬细胞(BMDMs)，用NLRP3刺激物(ATP、MSU、CPPD、Nigericin和Poly(I:C))、NLRP4 刺激物Flagellin、AIM2刺激物PolydA:dT、非经典信号通路刺激物 (V.Cholerae、E.Coli和CTB)处理细胞后，检测细胞上清中IL-1β的水平。
参见图3(A)-(C)所示为：从BPOZ+/+、BPOZ-/-小鼠中分离并培养原代巨噬细胞(BMDMs)，用NLRP3刺激物ATP(5mM，4h)、MSU (200μg/mL，6h)、CPPD(100μg/mL，2h)、Nigericin(15μM，45min) 和Poly(I:C)(2μg/mL，6h)(图3的A)、NLRP4刺激物Flagellin(1 μg/mL，2h)和AIM2刺激物PolydA:dT(2μg/mL，6h)(图3的B) 以及非经典刺激物V.cholerae、E.coli、CTB(图3的C)处理细胞后，采用ELISA方法，检测细胞上清中IL-1β的水平比较。
上述实验结果表明：在这些NLRP3刺激物的作用下，小鼠原代巨噬细胞(BMDMs)因BPOZ缺失会增强IL-1β的成熟分泌(见图3的A)。此外，NLRC4的刺激物Flagellin、AIM2的刺激物polydA:dT(图3的B)、非经典信号通路刺激物(V.cholerae、E.coli和CTB)(图3的C)也均能促使BPOZ-/-BMDMs(BPOZ缺失纯合小鼠的原代巨噬细胞)分泌更多的IL-1β。实验表明，BMDMs中BPOZ的缺失，会促进各种经典和非经典炎症小体介导的IL-1β分泌。由此说明，BPOZ在经典和非经典炎症小体激活过程中具有负调控作用。
(2)对敲低了BPOZ的人源THP-1细胞，分析细胞在经典和非经典刺激物作用下IL-1β的分泌情况
参见图3(D)所示：通过合成BPOZ特异性的siRNA oligos(小段 RNA序列，可特异性抑制BPOZ基因表达)，利用Lipofectamine 2000 (多功能转染试剂)转染THP-1细胞24小时，用于敲低人源THP-1细胞中的BPOZ(如SEQ ID NO:2所示序列)，收集细胞裂解液，用BPOZ 抗体检测BPOZ的敲低效率，并以α-Tubulin(α微管蛋白)为等负荷的对照。
对敲低了BPOZ的人源THP-1细胞，再利用上述NLRP3刺激物(ATP、 MSU、CPPD、Nigericin)、AIM2的刺激物polydA:dT及非经典刺激物 (CTB)进行处理，采用ELISA方法细胞上清中IL-1β的分泌水平变化。结果如图3(E)所示，敲低BPOZ的细胞上清中IL-1β的水平也都会增加。
以上结果均表明，人源THP-1细胞中BPOZ缺失会促进经典、非经典炎症小体介导的IL-1β的分泌。由此说明，BPOZ在经典和非经典炎症小体激活过程中具有负调控作用。
根据以上(1)-(2)可证明，在小鼠和人源细胞缺失BPOZ或过低表达均可能导致过度炎症反应性疾病。
(四)在HEK293T细胞中过表达了带GFP标签的pro-caspase-1和 BPOZ，通过免疫共沉淀的方法分析BPOZ与caspase-1及其活性亚基 caspase-1p20和caspase-1p10之间的相互作用，并进一步分析确定BPOZ 与炎症信号通路的连接机制。具体方法和试验结果包括以下内容：
(1)免疫共沉淀法分析BPOZ是否可与caspase-1活性亚基caspase-1 p10/p20之间发生相互作用
以HEK293T细胞为研究对象，向细胞内共转染GFP-pro-caspase-1(带 GFP标签的pro-Caspase-1质粒)、Flag-BPOZ和Flag空载体，利用免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与pro-caspase-1和切割体的相互作用。结果如图4(A)所示。实验结果表明：BPOZ可与caspase-1 p10发生相互作用，说明BPOZ与caspase-1活性亚基存在相互作用。
为了进一步明确这种相互作用关系，再次构建了带Flag标签的 caspase-1 p10和caspase-1 p20的表达载体，以HEK293T细胞为研究对象，向细胞内共转染HA-BPOZ、Flag-pro-caspase-1、Flag-caspase-1 p10、 Flag-caspase-1 p20和Flag空载体，采用MG132(Proteasome抑制剂)处理 8h后收集细胞，利用免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与pro-caspase-1、 caspase-1 p10、caspase-1 p20的相互作用。结果如图4(B)所示。
免疫共沉淀的结果显示，caspase-1p20和caspase-1p10这两个 caspase-1的活性亚基均可与BPOZ相互作用。
(2)分析BPOZ-Cullin3是否可与caspase-1 p10/p20亚基结合成复合体并影响caspase-1 p10、p20的稳定性
以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内分别转染Myc-Cullin1、 Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5，同时共转Flag-BPOZ/Flag 空载体(共12组)，通过免疫共沉淀和免疫印迹检测BPOZ与CULs的相互作用。检测结果如图5(A)所示，BPOZ可与Cullin3相互作用，这与已报道的结果一致，与此同时还发现BPOZ也可与Cullin4A相互作用。
为确认Cullin3或Cullin4A在BPOZ与caspase-1活性亚基相互作用过程中的功能，利用显性负效应(dominant negative effect)原理，以HEK 293T细胞为研究对象，分别将Cullin3和Cullin4A的显性失活(dominant negative，DN)突变质粒Flag-DN-Cullin3/Flag-DN-Cullin4A与HA-BPOZ、 V5-caspase-1 p20及Myc-Ub共转入HEK293T细胞(共2组)，利用免疫印迹检测DN-cullin3和DN-cullin4A对caspase-1 p20稳定性的影响。
结果如图5(B)所示：发现当Cullin3失活后，caspase-1 p20的泛素化水平减弱甚至消失；相反的当Cullin4A失活后，caspase-1 p20仍具有泛素化。由此说明，BPOZ是通过与Cullin3相互作用来影响caspase-1 p20 的泛素化水平的。
继续以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内分别转染 Flag-DN-Cullin3/Flag-DN-Cullin4A与HA-BPOZ、V5-caspase-1 p20及 Myc-Ub(共2组)，利用泛素化实验和免疫印迹检测DN-Cullin3和 DN-Cullin4A对caspase-1 p20泛素化水平的影响。
结果如图5(C)所示，检测发现当过转BPOZ时，caspase-1 p20的稳定性受到影响，表达量下降；当Cullin3失活后，caspase-1 p20的稳定性不受影响，表达量变化不明显。相反，当Cullin4A失活后，caspase-1 p20 的稳定性仍然受到影响，表达量仍然下降(图5的C)。
以上结果说明，BPOZ对caspase-1 p20的稳定性的影响与Cullin3是否失活直接相关，而与Cullin4A无关。说明BPOZ是E3泛素连接酶支架蛋白Cullin3的衔接蛋白，与Cullin3共同发挥E3泛素连接酶的作用，影响caspase-1 p20的泛素化修饰极稳定性。
最后以HEK293T细胞为研究对象，向细胞内共转染HA-BPOZ、Myc-Cullin3和Flag-caspase-1 p10/Flag-caspase-1p20或Flag空载体(共3 组，Flag空载体为对照)，两步免疫共沉淀后利用免疫印迹检测HA-BPOZ、Myc-Cullin3和Flag-caspase-1 p10/Flag-caspase-1 p20，确认BPOZ、Culllin3 与caspase-1 p10(或caspase-1 p20)三者间能否形成复合体。
实验结果如图5(D)-5(E)所示：在caspase-1 p20(图5的D)和 caspase-1 p10(图5的E)的细胞免疫沉淀复合体(沉淀物)中，均能够检测到BPOZ。综上所述，细胞内BPOZ可与Culllin3、caspase-1 p10(或 caspase-1 p20)结合成复合物。由于CULs家族(包括Cullin3)蛋白与含有BTB结构域的蛋白相互作用，BTB结构域作为衔接蛋白可介导支架蛋白CULs对目的蛋白的泛素化，因此当BPOZ与Culllin3、caspase-1 p10 (或caspase-1 p20)结合成复合物时，则实现了泛素化修饰的方式影响 caspase-1活性亚基(caspase-1 p10/p20)的稳定性。
(3)确定BPOZ是通过降低caspase-1活性亚基caspase-1 p10、 caspase-1 p20的稳定性减少IL-1β的成熟和分泌
通过向HEK293T细胞转染定量Flag-pro-caspase-1、Flag-caspase-1 p10、Flag-caspase-1 p20和不同剂量(0、0.3μg、0.6μg、0.9μg)Flag-BPOZ (共12组)，利用免疫印迹检测BPOZ对pro-caspase-1、caspase-1 p10 和caspase-1 p20三者稳定性的影响。
实验结果如图6(A)所示，实验表明，BPOZ影响caspase-1 p10和 caspase-1 p20的稳定性，而对pro-caspase-1的稳定性没有影响。
同样地，以HEK 293T细胞为研究对象，向细胞内共转染 Flag–pro-caspase-1和pro-IL-1β，分别共转入HA-BPOZ和HA空载体，利用免疫印迹检测BPOZ对pro-caspase-1、pro-IL-1β、caspase-1 p10、 caspase-1 p20和IL-1βp17稳定性的影响，并利用ELISA检测细胞上清中 IL-1β的分泌水平。
实验结果如图6(B)所示，通过在HEK293T细胞中重建NLRP3炎症通路下游信号分子IL-1β的成熟释放，利用免疫印迹检测结果发现，当过转BPOZ时，pro-caspase-1的表达不受影响，而caspase-1 p10和caspase-1 p20的表达量明显减少；同样pro-IL-1β的表达也不受影响，而成熟体IL-1β-p17的表达量明显下降。再如图6(C)所示，再利用ELISA检测细胞上清中成熟的IL-1β的分泌发现，过转BPOZ后上清中IL-1β的含量下降。
以上结果进一步证明了，BPOZ通过靶向组成caspase-1活性亚基 caspase-1 p10或caspase-1 p20，促进caspase-1活性亚基的降解从而抑制其对IL-1β前体的切割作用，进而抑制IL-1β的成熟分泌。
当使用NLRP3刺激物(MSU、CPPD、Nigericin和Poly(I:C))、NLRP4 刺激物Flagellin、AIM2刺激物PolydA:dT分别刺激BPOZ+/+和BPOZ-/- BMDMs细胞(或用LPS+ATP处理不同时间)，利用免疫印迹的方法检测细胞内caspase-1的切割水平。
结果如图6(D)所示，与前述结论一致，当用NLRP3刺激物MSU、 CPPD、Nigericin和Poly(I:C)、NLRP4刺激物Flagellin、AIM2刺激物 PolydA:dT处理BPOZ+/+及BPOZ-/-小鼠来源的BMDMs细胞时，BPOZ-/-细胞内caspase-1 p10水平显著升高，IL-1β的成熟分泌增多。使用LPS+ATP处理上述细胞不同时间，也可得到同样的结果(如图6的E)。
实验结论表明，BPOZ可通过降低caspase-1活性亚基caspase-1 p10 或caspase-1p20的稳定性，进而减少IL-1β的成熟和分泌。
(五)构建小鼠的结肠炎致死模型，分析BPOZ过表达小鼠对炎症的敏感性影响。具体方法和试验结果如下：
(1)构建pAAV-BPOZ：
小鼠肠道过表达BPOZ实验选取5型腺相关病毒(AAV5)， pAAV-BPOZ病毒包装委托汉恒生物科技(上海)有限公司。
构建步骤包括：
①质粒构建：将小鼠BPOZ基因构建至5型AAV表达质粒 (pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen)。
②包装质粒：将表达质粒pHBAAV-BPOZ 10μg，包装载体pHelper 20 μg、pAAV-RC10μg转染至293细胞。
③AAV收集和纯化：转染72小时后，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用Benonase酶消化，所得上清用纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80℃保存。
④AAV滴度测定：通过荧光定量PCR方法对AAV病毒进行绝对定量。
(2)将小鼠禁食过夜并用20mM N-乙酰基-1-半胱氨酸(NAC)预处理，通过直肠内注射100μL20 mM NAC清洗结肠，并排干15分钟，重复此步骤两次。接下来，将小鼠复麻醉，并通过灌肠和尾静脉分别注射5×1010pAAV-空和pAAV-BPOZ，每周一次，持续3周。
(3)对分别注射了pAAV-空或pAAV-BPOZ的小鼠，在其饮用水中连续7天加入4％DSS(葡聚糖硫酸钠，4％浓度可诱导小鼠溃疡性结肠炎并致死)，撤药后喂食正常饮用水直到实验结束，15天内观察并统计小鼠死亡率情况。
统计结果显示如图7所示：注射pAAV-BPOZ的小鼠的死亡率显著低于注射pAAV-空的小鼠。撤药12天后，注射pAAV-空的小鼠已经全部死亡，注射pAAV-BPOZ的小鼠死亡率不足50％。上述结果均表明：过表达BPOZ对于DSS诱导的结肠炎具有抑制作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> BPOZ基因在制备治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用
<141> 2021-02-04
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 1
atggatacca gcgacttgtt tgccagctgc aggaaagggg acgtgggccg tgtgcggtac 60
ctgctggagc agcgagacgt ggaggtgaac gtgcgggata agtgggacag cacccctttg 120
tactatgcct gcctctgtgg gcatgaggag ttggtgcgct acctgttggc taatggagcc 180
cgctgtgagg ccaacacctt tgatggagag cggtgtctct acggagcgct aagcgaccct 240
attcgccgtg cactgagaga ctacaaacag gtcactgcgt cctgcaggag gcgggattac 300
tatgacgatt tcctgcagcg gcttctggaa cagggcatcc acagcgatgt ggtctttgtg 360
gtacacggaa agccgttccg ggcccatcgc tgtatcctcg gtgctcgcag tacctacttc 420
gccaacatgc tggacaccaa gtggaagggc aagagcgtcg tggttctcag gcaccccctg 480
atcaacccgg tggcctttgg ggctctactg cagtacctgt atacaggccg cttggacatc 540
ggtgtagaac acgtgagtga ctgtgagcgc ctggccaagc agtgccagct gtgggacctg 600
ctggatgacc tggaggctaa gtgcgagaag gtgtctgaat ttgtggcttc caagcctggc 660
acgtgtgtga aggtgctgac tattgaacct cctccagcag atccccggtt acgggcagat 720
atggccctgc tagctgactg tgccctgcca tctgagctgc ggggtgacct tggagagctg 780
cccttcccat gtcccgatgg cttcagcagc tgccccgata tctgcttccg agtggctgac 840
tccagcttcc tctgctacaa ggctttcttc tgtggccgca gtgactactt ccgggccctt 900
ctggatgacc actttcaaga gagtgaggag cctgcagcct ctggagatcc cccagttgtc 960
accctgcatg acatctcccc ggacatcttc attcacgtgt tgtactacgt atatagtgac 1020
cataccgagc tgcctcctga gttggcctac gatgttctga gtgtggctga catgtacctt 1080
ctgcctggcc tgaagcggct gtgtggccgc agcctggccc agctgctgga ggaggacagt 1140
gtggtgggtg tttggcgcat agccaagatg ttccggctgg cccggctgga ggaccagtgt 1200
accgagtata tggccaaagt catagagaag ctggtagagc gggaggattt cgtggaggcc 1260
gtgcgggaag aggcggcagc tgtagcggcc cggcaggaga cagactccat cccgctcgtc 1320
gatgacatcc gcttccatgt ggccagcacg gtccagacat acagtgccat tgaagaggca 1380
cagcagcgac tgcgggcact cgaggacctg ctcgtgtcca ttggcttgga ctgctaa 1437
<210> 2
<211> 1437
<212> DNA
<213> Human
<400> 2
atggacacca gcgacctgtt cgccagctgc aggaaggggg atgtgggccg agtgcggtac 60
ctgctggagc agcgagacgt ggaggtgaat gtgcgggaca agtgggacag cacccccttg 120
tactatgcct gcttgtgtgg gcacgaggag ctggtactct accttctggc caatggagcc 180
cgctgcgagg ccaacacctt cgatggtgag cgctgcctct atggggcact gagtgacccc 240
atccgccggg ctctacgcga ttacaagcag gtcacggctt cctgcaggag gcgggattac 300
tatgacgact tcttgcagcg gcttctagag cagggcatcc acagtgacgt ggtctttgta 360
gtacacggga agccattccg ggtgcatcgc tgcgtcctgg gtgcacgtag tgcctacttt 420
gccaacatgc tggacaccaa atggaagggc aagagtgtcg tggttctcag gcacccactg 480
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cagcagcgtc tgcgggcact cgaggacctg ctcgtgtcca tcggtctgga ctgttga 1437

Claims (1)

1.过表达BPOZ基因的载体在制备用于治疗过度炎症反应性疾病的药物中的应用，所述疾病为结肠炎，所述BPOZ基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
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Guillamot, M.等.The E3 ubiquitin ligase SPOP controls resolution of systemic inflammation by triggering MYD88 degradation.《NATURE IMMUNOLOGY》.2019,第20卷(第9期),第1196-1207页. *
The E3 ubiquitin ligase SPOP controls resolution of systemic inflammation by triggering MYD88 degradation;Guillamot, M.等;《NATURE IMMUNOLOGY》;20190812;第20卷(第9期);第1196-1207页 *

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