CN112870221A - 一种壳聚糖纳米铑材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体公开了一种壳聚糖纳米铑,采用如下方法获得:S1、聚多巴胺包裹纳米铑:将纳米铑加入盐酸多巴胺碱性溶液,超声;S2、将步骤S1的聚多巴胺纳米铑加入含乙二醇壳聚糖溶液中,通过席夫碱反应使聚多巴胺纳米铑表面包覆一层壳聚糖,形成壳聚糖纳米铑。本发明制备的壳聚糖纳米铑合成简单,生物相容性高,具有很好的抗菌效果,能够应用于消毒,杀菌领域,因其pH响应功能对弱酸性环境(感染部位)下的细菌有高亲和性,能够抵御局部感染,在皮下脓肿,创伤后感染等感染性皮肤疾病中具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及一种新型纳米金属抗菌剂及其应用,更具体地,涉及一种壳聚糖纳米铑及其应用。
背景技术
致病性细菌感染为全球第二大死因,抗生素疗法是目前为止治疗细菌感染的最常规的方法,其原理是通过抗生素类药物对细菌的生长进行抑制或者是直接杀死细菌从而达到治疗细菌感染的目的。但在过去几十年中,由于抗生素的无节制的使用给细菌带来了进化的机会,各种新型的耐药性菌株不断的出现也使得常规的抗生素治疗出现失败。例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)、青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)等。如今耐药细菌己存在于世界每个地方,在欧洲每年有数万人死于耐药细菌的感染,而在美国,每年有大约350亿美元要用于耐药细菌感染的治疗。“控制抗菌素耐药性”被世界卫生组织选择为2011年世界卫生日的主题,一项研究表明,如果不控制耐药细菌感染,到2050年每年会导致超过1000万患者死亡,损失高达100万亿美元。如果不加以控制,细菌的耐药性将对全球公共卫生构成严重威胁。
抗生素耐药性机理主要分为以下几类:(1)灭活作用,也就是通过产生多种酶抑制抗菌药物的活性,常见的为细菌对β-内酰胺类、氯霉素、大环内酯类药物的耐药;(2)靶位改变导致结合位点改变从而产生耐药;(3)主动排外作用和膜通透性的改变降低胞内药物浓度从而达到耐药性;(4)存在抑制旁路使细菌改变代谢路径。在发生耐药细菌感染后,只能被迫选择二线或者三线的抗生素,通常,这些抗生素有着良好的治疗效果,但是有着更大的毒副作用,且更加昂贵,甚至有些超强的耐药菌是没有抗生素可以抵抗的,耐药细菌感染依然有着很高的死亡率,因此新型抗菌药物的研发迫在眉睫。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明的首要目的是提供一种壳聚糖纳米铑材料。
本发明的第二个目的是提供上述壳聚糖纳米铑材料的应用。
本发明上述技术目的通过以下技术方案实现:
一种壳聚糖纳米铑材料,采用如下方法获得:
S1、合成纳米银三角;
S2、将S1所得的纳米银三角通过反向置换反应得到纳米铑;
S3、将步骤S2中纳米铑加入盐酸多巴胺溶液,得到聚多巴胺纳米铑;纳米铑与盐酸多巴胺的摩尔比为1:4~16;
S4、将步骤S3所得的聚多巴胺纳米铑加入含乙二醇壳聚糖溶液中,通过席夫碱反应使聚多巴胺纳米铑表面包覆一层壳聚糖,形成壳聚糖纳米铑;聚多巴胺纳米铑与乙二醇壳聚糖的摩尔比为1:8~25;
其中,步骤S1合成纳米银三角包括如下步骤:
S11、将AgNO3、二水柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮加入水中,搅拌均匀后加入过氧化氢孵化2~5min;AgNO3、二水柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮的摩尔比依次为1:(3-5):(1.5-3.5); AgNO3的浓度为0.05-0.3mmol/L;
S12、在步骤S11溶液中加入硼氢化钠溶液后孵化2.5-4小时;
S13、在步骤S12孵化后的溶液中滴加生长溶液,待溶液变为深蓝色;生长溶液为20mL 1mM AgNO3、0.125mL 100mM柠檬酸、10μL 75mM二水柠檬酸钠;
步骤S2合成纳米铑包括如下步骤:
S21、将步骤S1的纳米银三角中加入乙二醇,使其混合均匀,纳米银三角和乙二醇的体积比为1:1.5~4;
S22、在步骤S21的溶液中加入4~5mM的氯化铑溶液,加热至160~200℃后蒸发水分;氯化铑与纳米银三角的摩尔比为1:0.4~0.6;
S23、在步骤S22溶液中加水,进行淬灭反应,离心,洗涤后得到纳米铑。
金属抗菌剂为目前最有效的非抗生素抗菌剂之一,如金属银,金,铜,锌等制得的纳米材料都被证明有杀菌效果,其中银纳米制剂已广泛的被应用于医药杀菌中。而由纳米银倒置置换反应所得的新型纳米金属——纳米铑,将有更优于纳米银的杀菌效果。另外,水溶性和生物相容性是纳米材料安全,方便,有效的应用于生物体内的前提,而常用的阳离子材料壳聚糖具有来源丰富,无毒,良好的生物相容性和生物降解性,以及免疫原性低和本身具有抗菌功能等优点。通过壳聚糖装载抗菌药物修饰纳米铑,将构建成具有双重杀菌功能的复合纳米铑抗菌制剂。
作为一种具体实施的技术方案,上述处理中,纳米铑的制备包括以下步骤:
(1)往25mL玻璃瓶,加入4mL纳米银三角合成液,边搅拌边缓慢注入10mL乙二醇使其均匀混合;
(2)往(1)中加入900μL 4.2mM氯化铑溶液;
(3)将(2)中混合液190℃加热4h无盖蒸发去离子水;
(4)4h后,停止加热,往(3)中直接加入10ml DI水,淬灭反应。
(5)合成的纳米铑经9000rpm离心10min,离心洗涤一次,定义为4个当量。
作为一种具体实施的技术方案,上述合成方法中,步骤(4)具体包括以下步骤:
(1)取合成的聚多巴胺包裹纳米铑,加入500μL 5mg/mL GCS溶液和10ml ddH2O,20mg NHS常温反应2h;
(2)往(1)中加入50mg EDC,反应过夜;
(3)9000rpm洗涤三遍,用1mL DI水重悬4℃保存。
本发明纳米铑具有杀菌功能,修饰壳聚糖之后,其表面的壳聚糖具有pH响应功能,能够在弱酸性环境下转变为正电位,对细菌有提升的杀菌效果。另外壳聚糖纳米铑和同等粒子浓度的纳米银相比,具有更好的抗菌效果。
因此,本发明还提供一种用于抗菌的新型纳米金属抗菌剂,包括所述壳聚糖纳米铑材料。
本发明上述纳米铑能够有效的抑制耐药的金黄色葡萄球菌生长,且在体外孵育直接杀死细菌,因此,本发明还提供上述纳米铑在抗菌中的应用。
本发明上述壳聚糖纳米铑具有pH响应功能,能够和带负电的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌结合,并在弱酸性环境下增加其杀菌效能,因此,本发明还提供上述壳聚糖纳米铑在弱酸性环境下(感染部位)抗菌应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种壳聚糖纳米铑颗粒材料,为新型金属抗菌剂,对于耐药菌有很好的抗菌效果,通过表面修饰的壳聚糖,一方面增加生物相容性,另一方面具有pH响应功能,能够针对弱酸性环境(局部感染部位)发挥杀菌作用,与壳聚糖纳米铑和纳米银相比有更好的抗菌效果。
本发明制备的壳聚糖纳米铑合成简单,生物相容性高,具有很好的抗菌效果,能够应用于消毒,杀菌领域。另外因其pH响应功能对弱酸性环境(感染部位)下的细菌有高亲和性,能够抵御局部感染,在皮下脓肿,创伤后感染等感染性皮肤疾病具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为纳米铑合成及抗菌作用原理图。
图2:(A)纳米铑的透射电镜图;(B)聚多巴胺包裹纳米铑的透射电镜图;(C)壳聚糖纳米铑的透射电镜图;
图3:纳米铑(RhNPs),聚多巴胺纳米铑(Rh@PDA),壳聚糖纳米铑(Rh@GCS)的水合粒径(A)和电位(B)图;
图4:(A)不同浓度纳米铑作用下,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长曲线;(B)经纳米铑作用的MRSA在琼脂平板上的生长情况;(C)经纳米铑作用的MRSA涂在平板上生长的菌落数;
图5:(A)大肠杆菌(E.Coli)和MRSA以及和壳聚糖纳米铑共孵育后的电位图;(B)壳聚糖纳米铑在不同pH下作用MRSA的效果;(C)对B图的菌落数定量结果;
图6:纳米银三角(tAgNPs),纳米银颗粒(AgNPs)和壳聚糖纳米铑的对比图;
图7:壳聚糖纳米铑和纳米铑抗菌对比图;
图8:(A)壳聚糖纳米铑对MRSA,E.coli,PA抑菌曲线;(B)壳聚糖纳米铑对MRSA,E.coli,PA杀菌效果图;
图9:(A)小鼠皮肤脓肿经壳聚糖纳米铑处理后的脓肿细菌涂板;(B)对A图的菌落数定量结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1壳聚糖纳米铑的制备,包括以下步骤:
一、纳米银三角的合成
(1)往50mL玻璃瓶中分别加入250μL 10mM AgNO3,300μL 30mM二水柠檬酸钠(枸橼酸钠),1.5mL 3.5mM PVP,24.75mL去离子水并搅拌均匀;
(2)300rpm磁力搅拌下往(1)中加入60μL过氧化氢(30%)孵化3min;
(3)往(2)中加入250μL的100mM硼氢化钠溶液后孵化3h,颜色变化从透明到淡黄色、深黄色,橙色,最后蓝色;
(4)配制生长溶液:于25mL圆底烧瓶中加入20mL 1mM AgNO3;0.125mL 100mM柠檬酸10μL 75mM二水柠檬酸钠;
(5)往(3)中以0.2mL/s添加13mL生长溶液,溶液颜色变为深蓝色。反应10min后,测紫外表征。
二、纳米铑的合成
(1)往25mL玻璃瓶,加入步骤一中的4mL纳米银三角合成液,边搅拌边缓慢注入10mL乙二醇使其均匀混合;
(2)往(1)中加入900μL 4.2mM氯化铑溶液;
(3)将(2)中混合液190℃加热4h无盖蒸发去离子水;
(4)4h后,停止加热,往(3)中直接加入10ml DI水,淬灭反应。
(5)合成的纳米铑经9000rpm离心10min,离心洗涤一次,定义为4个当量。
三、聚多巴胺包裹纳米铑的合成
自然界中的海洋贻贝通过分泌足丝蛋白,可以将自己牢固地固定在岩石(主要成分含各种无机矿物质)或船舶(主要成分为金属材料)上,即使遇到大风大浪也不会掉下去。研究表明多巴胺具有模仿海洋贻贝足丝蛋白的粘附功能,它可以通过多巴胺的自聚合紧紧的粘附在多种有机和无机基体表面形成均匀的包覆层。一方面聚多巴胺具有很好的亲水性,能有效改善疏水基体在水溶液中的分散性,另一方面多巴胺作为中间连接层具有二次反应性,可以在缓和的条件下将具有巯基或氨基的功能分子固定在材料表面。
(1)取步骤二中合成的纳米铑中加入20ml 0.2mg/mL盐酸多巴胺Ttis.HCl(pH 10)溶液,超声1h;
(2)离心洗涤2遍,待用。
纳米铑在水溶性中不稳定,易聚集,通过多巴胺修饰,一方面改善水溶性,另外可在纳米铑表面提供活性基团供纳米铑进一步修饰。
四、壳聚糖纳米铑的合成
PDA修饰在纳米铑表面带负电位,不利于作用带负电的细菌。另外细菌感染部位由于细菌的代谢导致pH会下降,且文献中显示乙二醇壳聚糖(GCS)有pH响应功能,能够在细菌感染部位增加对细菌的亲和力,因此在PDA表面修饰上GCS,可增加纳米铑生物功能。
(1)取步骤三中的聚多巴胺包裹纳米铑,加入500μL 5mg/mL GCS溶液和10mlddH2O,20mg NHS常温反应2h;
(2)往(1)中加入50mg EDC,反应过夜;
(3)9000rpm洗涤三遍,用1mL DI水重悬4℃保存。
在电镜下,合成的纳米铑呈片状(图2A),大小较为均一,粒径约为100nm左右。经PDA修饰后(图2B),纳米铑片呈偏圆形,粒径100nm左右,进一步,加上GCS后(图 2C),表面明显变粗糙,且粒径增大至150-200nm。单独的壳聚糖纳米颗粒水合粒径约为100 nm,电位为-30mV,聚多巴胺包裹纳米铑后水合粒径增至200nm左右,电位负增长为﹣45 mV。进一步修饰上GCS,壳聚糖纳米铑水合粒径升高至250nm,电位逆转为正电位为15mV 左右,侧面证明壳聚糖修饰在聚多巴胺纳米铑表面(图3A,B)。
实施例2纳米铑的抗菌功能
抗菌实验中所用的细菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA),实验过程如下:
(1)纳米铑抑菌实验:
①将1.6当量的纳米铑梯度稀释分别和MRSA的LB溶液(原始OD600=0.5)1:1混合;
②每隔一小时检测OD600数值,记录12个小时。
如图4A所示,当纳米铑浓度为大于等于0.4当量时,有较好的抑菌效果;
(2)纳米铑杀菌实验
①将0.4当量的纳米铑和MRSA(1×107CFU)体外37℃共孵育2h;
②将①孵育液梯度稀释104倍,在每个数量级稀释液取100微升中涂板,37℃培养24 h;
③取各稀释板观察,计数。
如图4B所示,MRSA经纳米铑处理后,其菌落数量显著降低(Control组平均菌量是107066CFU/mL,经纳米铑作用后,其平均菌量降低到167CFU/mL),说明纳米铑对于耐药菌具有很好的杀菌效果。
实施例3壳聚糖纳米铑在不同pH下对细菌亲和性
细菌感染部位受细菌的代谢产物影响,其微环境pH值略有下降(pH 6.3)。
GCS是一种具有pH响应电荷的水溶性生物聚合物,壳聚糖纳米铑的正电荷值随pH的降低而增加,这意味着壳聚糖纳米铑在略酸性环境下可以通过增加其正电荷提高带负电荷细菌亲和性。当在pH 6.3的条件下,MRSA(耐药革兰氏阳性细菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)与壳聚糖纳米铑孵育后,其细菌表面负电荷转换为正电荷(图5A),表明壳聚糖纳米铑能够很好的粘附在细菌表面,具有很高的亲和性。进一步,细菌涂板实验证实了壳聚糖纳米铑在pH 6.3环境下比pH 7.4环境中有更好的杀菌能力(图5B,C),暗示其在细菌感染部位对细菌的有很高的亲和性,对于细菌感染具有很大治疗潜力。
实施例4比较壳聚糖纳米铑,纳米银三角及纳米银颗粒的抗菌效能
目前最被认可的纳米金属抗菌剂为纳米银颗粒,而纳米铑由纳米银三角反向置换反应置换所得,发明人通过比较纳米铑,纳米银三角及纳米银颗粒的抗菌性能,以确定纳米铑的抗菌潜能。
实验过程如下:
(1)使用NTA分别测定壳聚糖纳米铑,纳米银三角及纳米颗粒的数量浓度;
(2)分别将同等纳米颗粒浓度的纳米铑,纳米银三角片,纳米银颗粒和1×107CFU大肠杆菌孵育后,分别梯度稀释后在每个稀释度取100微升涂于LB琼脂糖培养基;
(3)培养1天后,拍照记录同一稀释度各组的细菌生长情况。
如图6和图7所示,同等浓度下,壳聚糖纳米铑对比纳米银三角、纳米银和纳米铑具有更强的抗菌功能,由此说明壳聚糖纳米铑在抗菌中具有更高的应用潜能。
实施例5壳聚糖纳米铑体外广谱抗菌效能
体外广谱抗菌实验选取的细菌为生活中常见的致病菌包括革兰阳性耐药菌MRSA,革兰阴性菌大肠杆菌E.coli,革兰阴性菌绿脓杆菌PA,实验过程如下所示:
(1)壳聚糖纳米铑体外抑菌实验:
①将4mg/mL纳米铑梯度稀释分别和MRSA,E.coli,PA的LB溶液(原始OD600=0.5)1:1混合;
②每隔一小时检测OD600数值,记录12个小时。
如图8A所示,壳聚糖纳米铑对MRSA,E.coli,PA均具有很好的抑菌效果。
(2)壳聚糖纳米铑体外杀菌实验
①将2mg/mL的壳聚糖纳米铑分别和MRSA,E.coli,PA(1×107CFU)体外37℃共孵育2h;
②将①孵育液梯度稀释104倍,在每个数量级稀释液取100微升中涂板,37℃培养24 h;
③取各稀释板观察,计数。
如图8B所示,MRSA,E.coli,PA经壳聚糖纳米铑处理后,其菌落数量显著降低,其中,MRSA组中,对照组平均菌量是197738CFU/mL,经壳聚糖纳米铑处理后,其平均菌量降低为4CFU/mL;E.coli组中,对照组平均菌量是483003,经壳聚糖纳米铑处理后,其平均菌量降低为8951CFU/mL;PA组中,对照组平均菌量4622959CFU/mL,经壳聚糖纳米铑处理后,其平均菌量降低为17CFU/mL,说明壳聚糖纳米铑对革兰阴性菌,革兰阳性菌等多种细菌有广谱杀菌效果。
实施例6比较壳聚糖纳米铑体内抗菌效能
急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)是各种医疗机构中常见的感染。在过去的20 年中,与社区相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)成为化脓性皮肤感染的最常见原因,如果没有及时得到抗菌治疗,感染病灶持续存在严重者将导致全身性脓毒症,甚至死亡。发明人通过构建MRSA感染的小鼠皮肤脓肿,验证壳聚糖纳米铑在体内的抗菌性能.
实验过程如下:
(1)构建皮肤脓肿模型,取4周大的Balb/c小鼠,麻醉后皮下注射100微1×108CFU/mL MRSA细菌;
(2)两天后,往皮肤脓肿内注射100微2mg/mL壳聚糖纳米铑药物处理;
(3)皮下脓肿菌量测定:药物处理两天后,取皮肤脓肿组织,用生理盐水研磨;
(4)将(3)中组织液梯度稀释103倍,在每个数量级稀释液取100微升中涂板,37℃培养24h;
(5)取各稀释板观察,计数。
如图9所示,经壳聚糖纳米铑处理后,其皮肤脓肿菌落数量显著降低(对照组平均菌量是2361000CFU,经壳聚糖纳米铑处理两天后,对照组平均菌量下降为112500 CFU),说明壳聚糖纳米铑在体内具有很好的抗菌效果,对于皮肤感染具有很大的治疗潜力。
Claims (7)
1.一种壳聚糖纳米铑材料,其特征在于,采用如下方法获得:
S1、合成纳米银三角;
S2、将S1所得的纳米银三角通过反向置换反应得到纳米铑;
S3、将步骤S2中纳米铑加入盐酸多巴胺溶液,得到聚多巴胺纳米铑;纳米铑与盐酸多巴胺的摩尔比为1:4~16;
S4、将步骤S3所得的聚多巴胺纳米铑加入含乙二醇壳聚糖溶液中,通过席夫碱反应使聚多巴胺纳米铑表面包覆一层壳聚糖,形成壳聚糖纳米铑;聚多巴胺纳米铑与乙二醇壳聚糖的摩尔比为1:8~25;
其中,步骤S1合成纳米银三角包括如下步骤:
S11、将AgNO3、二水柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮加入水中,搅拌均匀后加入过氧化氢孵化2~5min;AgNO3、二水柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮的摩尔比依次为1:(3-5):(1.5-3.5);AgNO3的浓度为0.05-0.3mmol/L;
S12、在步骤S11溶液中加入硼氢化钠溶液后孵化2.5-4小时;
S13、在步骤S12孵化后的溶液中滴加生长溶液,待溶液变为深蓝色;生长溶液为20mL1mM AgNO3、0.125mL 100mM柠檬酸、10μL 75mM二水柠檬酸钠;
步骤S2合成纳米铑包括如下步骤:
S21、将步骤S1的纳米银三角中加入乙二醇,使其混合均匀,纳米银三角和乙二醇的体积比为1:1.5~4;
S22、在步骤S21的溶液中加入4~5mM的氯化铑溶液,加热至160~200℃后蒸发水分;氯化铑与纳米银三角的摩尔比为1:0.4~0.6;
S23、在步骤S22溶液中加水,进行淬灭反应,离心,洗涤后得到纳米铑。
2.一种杀菌剂,其特征在于,包括权利要求1所述壳聚糖纳米铑材料。
3.权利要求1所述壳聚糖纳米铑材料在制备抗细菌感染制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,抗细菌感染为抗革兰阴性菌或革兰阳性菌感染。
5.根据权利要求3所述应用,其特征在于,抗细菌感染为抗耐药的细菌感染。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,抗细菌感染为抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染。
7.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述壳聚糖纳米铑材料应用于弱酸性环境,具有pH响应功能。
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