CN114010619A - 一种功能性纳米平台的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能性纳米平台的构建及应用,属于生物医药技术领域。本发明构建的功能性纳米平台是以长余辉纳米粒子(PLNPs)为核心的核壳结构复合纳米材料。首先,通过介孔氧化硅纳米材料(MSN)包覆PLNPs形成多孔长余辉材料,以其为载体负载肉桂醛后,再将透明质酸(HA)包封在外层,最后通过配位原位生长一层MnO2壳,得到核壳结构复合纳米材料;该材料在细菌微环境下响应,集按需给药、化学动力学治疗及点亮无背景磷光成像功能于一体,可用于近红外荧光成像指引的联合治疗。在细菌感染时,包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)或耐药金黄色葡萄球菌(MRSA),实现细菌的高效灭杀。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能性纳米平台的构建及应用,属于生物医药技术领域。
背景技术
致病性细菌感染,特别是耐药细菌引起的感染,对人体健康危害极大。目前,治疗细菌感染最有效和常用方式是使用抗生素。然而,抗生素的过度使用会导致细菌耐药性的增加。例如,可引起皮肤和软组织顽固性感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)就是由于抗生素治疗不当而产生的。而且,在过去的几十年里,新抗生素的开发受到了限制,而新的耐药细菌的出现速度远远快于新抗生素。因此,迫切需要开发替代的治疗策略或低耐药性的有效抗菌药物来治疗耐药菌引起的感染。
植物精油作为“绿色”杀菌剂,具有良好的生物相容性和广谱抗菌活性。与传统合成抗生素相比,植物精油的抗菌机理复杂,不易引起细菌耐药性。而且在抗菌浓度范围内,植物精油对脊椎动物安全无毒,易于生物降解和代谢。此外。高效的治疗手段如光热治疗(PTT)、光动力治疗(PDT)、化学动力学治疗(CDT)等已经在抗感染治疗方面有所应用。CDT通过产生活性氧物种(ROS),与细菌作用,实现细菌的杀死。但是单一模式的治疗方式很难得到令人满意的治疗效果。因此构建响应型、高效的抗菌平台仍然是一个很大的挑战。
发明内容
基于以上问题,我们设计构建了一种功能性纳米平台,是以长余辉纳米粒子(PLNPs)为核心的核壳结构复合纳米材料。通过介孔氧化硅纳米材料(MSN)包覆长余辉纳米粒子(PLNPs)形成多孔长余辉材料,以其为载体负载肉桂醛后,再通过化学反应将透明质酸(HA)作为堵孔剂包覆在介孔硅外层,最后再通过配位原位生长一层MnO2壳,得到核壳结构复合纳米材料;复合纳米材料在细菌微环境下响应,集按需给药、化学动力学治疗以及点亮无背景磷光成像功能于一体,并将其用于近红外荧光成像指引的联合治疗(如图1所示),在细菌感染部位,实现细菌“点亮”成像以及高效灭杀。
本发明的技术方案:
本发明的第一个目的是,提供一种功能性纳米平台,是以长余辉纳米粒子PLNPs、介孔氧化硅MSN、肉桂醛、透明质酸以及二氧化锰组成的核壳结构纳米材料,其中,该结构中长余辉纳米粒子PLNPs是核,介孔氧化硅MSN包裹在长余辉纳米粒子外侧,肉桂醛负载在介孔氧化硅MSN的孔道内,透明质酸包裹在介孔氧化硅MSN外面,二氧化锰包裹在透明质酸外侧,形成外壳。
进一步地,所述长余辉纳米粒子PLNPs为近红外发射的镓锗酸锌基质长余辉纳米粒子。
本发明的第二个目的是,提供一种制备所述功能性纳米平台的方法,包括以下步骤:
(1)介孔纳米材料包裹长余辉纳米粒子PLNPs@MSN的制备:
采用水热法结合煅烧的方法制备了近红外发射的镓酸锌基质长余辉纳米粒子PLNPs;将所述PLNPs和十六烷基三甲基溴化铵超声分散于超纯水中,得到混合液;向所述混合液中加入NaOH水溶液,水浴条件下搅拌0.5h后,加入正硅酸乙酯以形成二氧化硅层MSN,搅拌反应1h后,再次加入等量正硅酸乙酯,搅拌反应1.5h后,离心,得到PLNPs@MSN纳米粒子;
其中,PLNPs@MSN纳米粒子具有磷光发射和丰富的孔隙,是植物精油如肉桂醛(CA)理想的可视化纳米载体;
(2)PLNPs@MSN纳米粒子进一步氨基化PLNPs@MSN-NH2:
将上述步骤所得PLNPs@MSN纳米粒子分散在5mmol L-1NaOH水溶液中,搅拌12h,离心,得到羟基化的纳米粒子PLNPs@MSN-OH;将所述PLNPs@MSN-OH超声分散于乙醇中,搅拌下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷,混合物在70℃下反应12h,离心,洗涤,干燥,得到氨基化的纳米材料PLNPs@MSN-NH2;
(3)肉桂醛的负载和透明质酸的包封
将上述步骤所得PLNPs@MSN-NH2和肉桂醛分散于乙醇中,搅拌24h,离心分离得到负载了肉桂醛的纳米粒子PLNPs@MSN-NH2@CA;将透明质酸HA先溶解于超纯水中,然后加入pH 6.0的磷酸盐缓冲液,随后加入活化剂羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,反应1-2h后,用1mol L-1NaOH溶液将反应体系pH调至8.0,然后加入所述PLNPs@MSN-NH2@CA纳米粒子,再反应12h后,离心、洗涤,得到包封了HA的纳米材料PLNPs@MSN@CA-HA,简称PMC-HA;所述PMC-HA复溶于超纯水中,浓度为1mg mL-1,备用;
其中,HA层将负载了CA的介孔纳米材料包封起来,HA作为堵孔剂以防止肉桂醛在非细菌感染环境的泄露,当复合纳米材料抵达细菌感染部位时,HA可被感染部位细菌产生的过表达的透明质酸酶(Hyal)水解,因此负载在介孔硅里的CA就可以释放出来,从而达到在细菌感染部位“按需”释放的效果;
(4)功能性纳米平台PMC-HA-MnO2的制备
上述步骤所得PMC-HA溶液,加入37.5mg mL-1的聚烯丙胺盐酸盐溶液,搅拌4h后,离心洗去多余的聚烯丙胺盐酸盐,复溶于超纯水中,在搅拌下,缓慢滴加0.79mg mL-1的KMnO4水溶液,直至溶液变为棕色,8000rpm离心10分钟,洗涤,得到包裹了MnO2层的PMC-HA-MnO2纳米材料;将制备的PMC-HA-MnO2纳米材料分散在pH 5.5、10mmol L-1的磷酸盐缓冲液中,并置于4℃保存;
其中,MnO2作为磷光猝灭剂,使纳米平台在正常环境下保持光的猝灭状态,在细菌感染的微环境中,MnO2壳层分解,磷光恢复,并且释放出Mn2+可以介导化学动力学反应进行协同杀菌。
进一步地,步骤(1)中,所述采用水热法结合煅烧的方法为,将硝酸锌溶液、硝酸镓溶液、锗酸钠溶液以及硝酸铬溶液以摩尔比1.2∶1.6∶0.2∶0.0075混合,调pH至8-9,在220℃反应20-24h,离心,洗涤,干燥后将得到粉末材料,再在800℃下煅烧1h。
进一步地,步骤(1)中,所述PLNPs、十六烷基三甲基溴化铵重量比为1∶4,所述正硅酸乙酯的加入量为每100mg PLNPs加入800μL正硅酸乙酯。
进一步地,步骤(2)中,所述NaOH溶液的浓度为5mmol L-1,所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的添加量为每100mg PLNPs@MSN-OH加入400μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
进一步地,步骤(3)中,所述氨基化纳米粒子PLNPs@MSN-NH2与肉桂醛的质量比为1∶1~2;所述负载了肉桂醛的纳米粒子PLNPs@MSN-NH2@CA与透明质酸HA的质量比为1∶1.5~3;所述HA、羟基硫代琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1∶4∶2。
进一步地,步骤(4)中,所述PMC-HA溶液与KMnO4水溶液的体积比是1∶0.06.
本发明的第三个目的是,提供上述方法制备的功能性纳米平台,在细菌感染方面的应用。
进一步地,所述功能性纳米平台,细菌感染方面的应用,可用于包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)或耐药金黄色葡萄球菌的灭杀。
有益效果
1、本发明构建的功能性纳米平台PMC-HA-MnO2,以长余辉纳米粒子PLNPs为核心形成核壳结构的复合纳米材料,具有磷光发射,正常环境下保持光的猝灭状态,细菌感染环境下MnO2壳层分解,磷光恢复,实现无背景磷光成像,便于监测细菌感染的治疗过程。
2、本发明构建的功能性纳米平台PMC-HA-MnO2,其核壳结构中的MnO2壳层和HA包封层,在细菌微环境中,细菌分泌的透明质酸酶分解HA层,使肉桂醛根据细菌感染情况“按需”释放,从而达到杀菌目的;酸性环境和过量H2O2使MnO2壳层分解,产生Mn2+,从而产生Mn2+介导的化学动力学,由于肉桂醛和化学动力学的协同作用,实现细菌的高效灭杀,且不易引起细菌耐药性。
附图说明
图1为本发明功能性纳米平台的构建及联合杀菌示意图;
图2为PLNPs@MSN的透射电镜图;
图3(A)PMC-HA-MnO2的透射电镜图;(B)PMC-HA-MnO2的磷光发射光谱图;
图4为PMC-HA-MnO2在不同浓度H2O2处理15min后的磷光发射光谱;
图5为不同缓冲体系中肉桂醛的释放曲线(PMC-HA-MnO2浓度1mg mL-1);
图6为MB在PMC-HA-MnO2(200μg mL-1)溶液中的紫外吸收光谱;
图7(A)PMC-HA-MnO2浓度对杀菌效果的影响;(B)不同复合材料与菌孵育后的菌悬液的OD 600nm;(C)PMC-HA-MnO2分别在pH 7.4和pH 5.5条件下与三种细菌孵育后的菌悬液的OD 600nm;
图8为不同复合材料与菌孵育后的菌悬液的菌落照片;
图9为在MRSA感染小鼠体内注射PLNPs@MSN或PMC-HA-MnO2后无背景磷光“开启”成像
图10(A)小鼠经不同治疗10天后的感染部位照片;(B)小鼠经不同治疗10天后的皮肤伤口组织切片的苏木精-伊红染色(比例尺:100μm)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图,对本发明的技术方案做进一步详细描述。
1、功能性纳米平台的制备
1.1介孔纳米材料包裹长余辉纳米粒子PLNPs@MSN的制备:
采用水热法结合煅烧的方法,将硝酸锌溶液、硝酸镓溶液、锗酸钠溶液以及硝酸铬溶液以摩尔比1.2∶1.6∶0.2∶0.0075混合,调pH至8-9,在220℃反应20-24h,离心,洗涤,干燥后得到粉末材料,再在800℃下煅烧1h,制备了近红外发射的Zn1.2Ga1.6Ge0.2O4∶Cr3+长余辉纳米粒子PLNPs。将所制得PLNPs(40mg)和十六烷基三甲基溴化铵(160mg)分散在超纯水(45mL)中并超声0.5h得到混合液,在70℃水浴下,加入NaOH水溶液(1mol L-1,650μL),继续搅拌0.5h,然后在反应体系中缓慢加入正硅酸乙酯(160μL)以形成二氧化硅层MSN,1h后,再缓慢加入正硅酸乙酯(160μL),继续搅拌反应1.5h。离心分离得到PLNPs@MSN纳米粒子。
如图2所示,合成的PLNPs@MSN纳米材料呈核壳结构,尺寸为100nm左右,具有大的比表面积和均匀的孔径,能够负载肉桂醛。
1.2 PLNPs@MSN的进一步氨基化
将PLNPs@MSN(100mg)分散在NaOH溶液(5mmol L-1,100mL)中,搅拌过夜,得到羟基化的纳米材料PLNPs@MSN-OH;将PLNPs@MSN-OH(100mg)经超声分散于乙醇(100mL)中,搅拌下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷(400μL),反应混合物在70℃下反应12h,离心,乙醇洗涤,真空干燥,得到氨基化的纳米材料PLNPs@MSN-NH2。
1.3肉桂醛的负载和透明质酸的包封
将PLNPs@MSN-NH2(20mg)和肉桂醛CA(20mg)分散于乙醇(10mL)中,搅拌24h。通过离心分离得到负载了肉桂醛的纳米颗粒PLNPs@MSN-NH2@CA,并进一步用透明质酸(HA)包封;首先将HA(30mg)溶解在5mL超纯水中,然后用羟基硫代琥珀酰亚胺(120mg)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(60mg)在磷酸盐缓冲液(pH 6.0,30mL)中活化,1-2h后,用NaOH溶液(1mol L-1)将溶液pH调至8.0,然后加入制备的PLNPs@MSN-NH2@CA纳米材料(20mg)。反应12h后,离心,用超纯水洗涤,得到包封了HA的纳米材料PLNPs@MSN@CA-HA,简称PMC-HA。
1.4功能性纳米平台PMC-HA-MnO2的制备
将聚烯丙胺盐酸盐(37.5mg mL-1)加入到5mL的PMC-HA溶液(1mg mL-1)中,搅拌4h后,离心获得纳米颗粒,再在纯水中分散,然后在磁搅拌下,滴加KMnO4水溶液(0.79mg mL-1,300μL)到悬浮液中,直至溶液变为棕色。棕色溶液在8000rpm离心10分钟,用纯水洗涤3次,得到包裹了MnO2层的PMC-HA-MnO2纳米材料。将制备的PMC-HA-MnO2纳米材料分散在磷酸盐缓冲液(pH 5.5,10mmol L-1)中,并置于4℃保存。
如图3(A)所示,合成的PMC-HA-MnO2功能性纳米材料呈核壳结构,由于MnO2的包被,表面从图1的平滑变成粗糙。如图3(B)所示,包被MnO2后的PMC-HA-MnO2的磷光几乎被猝灭,因此在正常的生理环境中,PMC-HA-MnO2的磷光信号保持“关闭”状态,只有MnO2被激发分解后,磷光恢复。
2、功能性纳米平台PMC-HA-MnO2的性能评价及其应用
2.1PMC-HA-MnO2对H2O2的响应曲线
PMC-HA-MnO2(400μg mL-1)与H2O2混合(0,0.0125,0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.2和0.4mmol L-1)在pH值5.5的磷酸缓冲液中反应15分钟。在磷光模式下测定反应溶液的磷光(PL)光谱。
由于MnO2的猝灭效应,PMC-HA-MnO2本身没有磷光发射。如图4所示,酸性环境下,过量的H2O2存在,使MnO2的壳层被还原成Mn2+,从而使PMC-HA-MnO2的磷光恢复,并且与随着H2O2浓度增加,磷光恢复程度增加。这个结果证明PMC-HA-MnO2可以在酸性环境中被H2O2快速触发,实现无背景磷光成像的“开启”。
2.2肉桂醛释放实验
透明质酸酶能够将透明质酸分解成小分子,从而使包封在里面的肉桂醛释放出来,进行杀菌。研究表明细菌能分泌产生大量的透明质酸酶,因此在细菌感染部位存在的透明质酸酶可以起到开关的作用,使肉桂醛根据感染情况“按需”释放,从而达到杀菌目的。因此以透明质酸酶为激活剂,研究PMC-HA-MnO2对透明质酸酶的响应释放肉桂醛的性能。
实验组:将PMC-HA-MnO2(1mg mL-1)和透明质酸酶(150U mL-1)分散在pH 5.0的醋酸缓冲液中(缓冲液中添加了0.5mmol L-1过氧化氢和1.5‰吐温-20),在37℃反应24h。分别在第1,2,3,4,6,8,10,12,16,20,24h时,取出100μL的混合液,并加入同等体积的新鲜的pH5.0的醋酸缓冲液。在285nm处通过CA特征吸收峰的变化测定CA的释放量。
对照组:
(1)将PMC-HA-MnO2(1mg mL-1)分散在pH 5.0的醋酸缓冲液中(缓冲液中添加了0.5mmol L-1过氧化氢和1.5‰吐温-20),其他条件同实验组。
(2)将PMC-HA-MnO2(1mg mL-1)和变性的透明质酸酶分散在pH 5.0的醋酸缓冲液中(缓冲液中添加了0.5mmol L-1过氧化氢和1.5‰吐温-20),其他条件同实验组。
(3)将PMC-HA-MnO2(1mg mL-1)和透明质酸酶分散在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中(缓冲液中添加了0.5mmol L-1过氧化氢和1.5‰吐温-20),其他条件同实验组。
结果如图5(A)所示,在含透明质酸酶的pH 5.0醋酸缓冲液中,释放的肉桂醛达到最大(约42%),但在图5(B)对照组,即没有添加透明质酸酶的pH 5.0醋酸缓冲液、添加变性的透明质酸酶的pH 5.0醋酸缓冲液、以及添加了透明质酸酶的pH 7.4磷酸盐缓冲液中,释放的肉桂醛仅约10%。实验组肉桂醛释放量比对照组高三倍,由此可以说明,只有在酸性环境和透明质酸酶同时存在的情况下,才能实现肉桂醛的释放。细菌微环境的酸性环境以及过表达的透明质酸酶正好满足了这个要求,说明肉桂醛“按需”释放的可行性。
2.3 Mn2+产生·OH测定
研究表明Mn2+具有类芬顿反应,能将H2O2转化成活性氧·OH,产生化学动力学作用,对细菌有一定的杀灭作用。PMC-HA-MnO2纳米材料在细菌感染的环境中,MnO2会分解产生Mn2+,产生化学动力学的协同杀菌作用。通过监测·OH诱导的亚甲基蓝(MB)的降解,验证Mn2 +介导的化学动力学作用。
分别在含有NaHCO3(25mmol L-1)、MB(10μg mL-1)和H2O2(8mmol L-1)的缓冲液中加入PMC-HA-MnO2。混合物在摇床上反应30分钟。通过在665nm处的吸光度变化监测·OH诱导的亚甲基蓝MB的降解。如图6所示,加入PMC-HA-MnO2后,MB的特征吸收峰消失。说明PMC-HA-MnO2中二氧化锰壳层的分解能够产生Mn2+,Mn2+介导化学动力学作用,产生·OH,从而使MB降解,引起特征峰的消失。
2.4细菌培养及抗菌实验
(一)、将金黄色葡萄球菌(S.aureus),大肠杆菌(E.coli)和耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)置于5mL液体肉汤培养基中反应12h(37℃,200rpm)。将2mL增殖后的菌液(~109CFUmL-1)与PMC-HA-MnO2溶液(30,60,100,200,300,400,500μg mL-1)在pH 5.5的培养基(含0.2mmol L-1H2O2)中反应12h,用多功能酶标仪记录菌悬液的浊度(OD,600nm)。
如图7(A)所示,为pH 5.5、0.2mmol L-1H2O2存在下PMC-HA-MnO2浓度的抑菌效果测试。显然,PMC-HA-MnO2具有浓度依赖性的杀菌效果。在300μg mL-1PMC-HA-MnO2存在下,细菌微环境中的透明质酸酶分解透明质酸,使肉桂醛“按需”释放,酸性环境和过量H2O2使MnO2壳层分解,产生Mn2+,从而产生Mn2+介导的化学动力学,由于肉桂醛和化学动力学的协同作用,90%以上的细菌被杀灭。
(二)、为进一步证明PMC-HA-MnO2的杀菌效果,分别将2mL菌液(S.aureus,E.Coli,MRSA,~109CFU mL-1)与100μL 6组不同溶液(PBS磷酸缓冲盐溶液,PBS磷酸缓冲盐溶液+H2O2,没有负载CA的PLNPs@MSN-MnO2,没有负载CA的PLNPs@MSN-MnO2+H2O2,没有MnO2壳层包覆的PMC-HA,PMC-HA-MnO2+H2O2)一起孵育。其中PLNPs@MSN-MnO2、PMC-HA以及PMC-HA-MnO2的终浓度均为300μg mL-1,pH 5.5;H2O2浓度为0.2mmol L-1。孵育12h后,在多功能酶标仪上记录菌悬液浊度(OD,600nm)。
如图7(B)所示,为六个不同的实验组细菌孵育后的菌悬液的光密度值(OD,600nm),以证明联合抗菌效果。在纯PBS和含H2O2的PBS中,细菌的死亡可以忽略不计;在没有负载肉桂醛的PLNPs@MSN-MnO2(300μg mL-1)中,只具有Mn2+的化学动力学作用,细菌存活率有一定的下降;而没有二氧化锰壳层的PMC-HA(300μg mL-1)只能释放肉桂醛,可杀灭70%的细菌;而同时负载肉桂醛及二氧化锰壳层的PMC-HA-MnO2(300μg mL-1)则通过Mn2+介导的化学动力学与肉桂醛的释放杀菌,二者联合杀菌作用,使细菌的存活率降低到10%以下。
(三)、为了证明PMC-HA-MnO2只能在细菌感染环境响应杀菌,而在正常的生理环境下不会响应,不会对正常的细胞产生伤害,设置了六组实验,分别将2mL菌液(S.aureus,E.Coli,MRSA,~109CFU mL-1)与100μL六组不同溶液(pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液,pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液+H2O2,pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液+H2O2+PMC-HA-MnO2,pH 5.5的磷酸盐缓冲溶液,pH 5.5的磷酸盐缓冲溶液+H2O2,pH 5.5的磷酸盐缓冲溶液+H2O2+PMC-HA-MnO2)一起孵育,其中,PMC-HA-MnO2终浓度为300μg mL-1,H2O2浓度为0.2mmol L-1。孵育12h后,在多功能酶标仪上记录菌悬液浊度(OD,600nm)。
如图7C所示,在pH 7.4的环境中,PMC-HA-MnO2即使在有过氧化氢存在下,因为MnO2壳层不会分解,CA也不会释放,细菌存活率超过90%,因此不具有杀菌作用。只有在pH 5.5环境中PMC-HA-MnO2才具有显著的杀菌效果。说明PMC-HA-MnO2只有在细菌感染环境下才能响应杀菌,而在生理环境下对正常细胞无害。
(四)、取实验(二)中六个不同的实验组(PBS,PBS+H2O2,PLNPs@MSN-MnO2,PLNPs@MSN-MnO2+H2O2,PMC-HA,PMC-HA-MnO2+H2O2)细菌孵育后的菌悬液(100μL)涂布于固体琼脂平板上,37℃培养24h。培养后得到的菌落照片。
如图8,从图中明显看出,因为联合杀菌作用,PMC-HA-MnO2+H2O2组的菌落数相对于对照组(PBS,PBS+H2O2)以及单一杀菌的材料(PLNPs@MSN-MnO2,PLNPs@MSN-MnO2+H2O2,PMC-HA)极大的减少。
2.5PMC-HA-MnO2在小鼠体内的无背景成像应用
为研究PMC-HA-MnO2在MRSA感染小鼠的体内成像性能。将MRSA(108CFU mL-1)通过皮下注射到小鼠左、右后背,使其长出皮下脓肿。长出脓肿的小鼠分成两组(n=3),将PLNPs@MSN、PMC-HA-MnO2(200μL,2mg mL-1)通过尾静脉分别注射到麻醉后的小鼠体内。在指定的时间点(5分钟,4小时,6小时,12小时,第二天,第四天,第六天,第八天和第十天),用小动物成像仪上监测每组小鼠脓肿处的磷光变化情况。每次拍照前,用LED(650nm)光照2分钟后,并在指定时间点获得小鼠近红外余辉图像。
如图9所示,可以看出,注射PLNPs@MSN的小鼠,其伤口部位在所有时间点均未观察到明显的磷光恢复信号,而注射PMC-HA-MnO2的小鼠伤口处在4小时时,能观察到明显的磷光恢复信号,而且从6小时至6天的时间内,脓肿部位的磷光信号越来越明显,说明细菌感染的小鼠伤口处积累了一定量的PMC-HA-MnO2,并且在细菌感染环境下触发了PMC-HA-MnO2,使得MnO2壳层分解,磷光恢复。
2.6 PMC-HA-MnO2在MRSA感染小鼠体内的应用
将有皮下脓肿的小鼠随机分为3组(n=5)分别为:(1)PBS组;(2)PMC-HA,(3)PMC-HA-MnO2组。其中,PMC-HA和PMC-HA-MnO2(200μL,2mg mL-1)分别通过尾静脉注射到小鼠体内。每天对3组小鼠进行拍照和称重,并记录小鼠脓肿体积,直到组(3)的小鼠伤口完全愈合。从图10(A)可以看出,在同一时间点,PMC-HA-MnO2处理组的皮肤脓肿愈合速度明显快于其他组,治疗10天后脓肿消失,瘢痕脱落,而PMC-HA和PBS组小鼠仍有明显结痂。从图10(B)的皮肤组织苏木精-伊红染色中可以看出,PMC-HA-MnO2处理组经10天治疗后,伤口皮肤的毛囊组织恢复,显示出均匀的上皮细胞层;相反,PBS组中显示出大量聚集的炎症细胞。表明PMC-HA-MnO2治疗后,小鼠的恢复良好,PMC-HA-MnO2可应用于细菌感染方面,具有优异的杀菌效果。
Claims (10)
1.一种功能性纳米平台,其特征在于,是以长余辉纳米粒子PLNPs、介孔氧化硅MSN、肉桂醛、透明质酸以及二氧化锰组成的核壳结构纳米材料,其中,该结构中长余辉纳米粒子是核;介孔氧化硅MSN包裹在长余辉纳米粒子外侧,肉桂醛负载在介孔氧化硅MSN的孔道内,透明质酸包覆在介孔氧化硅MSN外侧,二氧化锰包裹在透明质酸外侧,形成外壳。
2.根据权利要求1所述的功能性纳米平台,其特征在于,所述长余辉纳米粒子PLNPs为近红外发射的镓锗酸锌基质长余辉纳米粒子。
3.一种制备如权利要求1所述的功能性纳米平台的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)介孔纳米材料包裹长余辉纳米粒子PLNPs@MSN的制备:
采用水热法结合煅烧的方法制备了近红外发射的镓酸锌基质长余辉纳米粒子PLNPs;将所述PLNPs和十六烷基三甲基溴化铵超声分散于超纯水中,得到混合液;向所述混合液中加入NaOH水溶液,水浴条件下搅拌0.5h后,加入正硅酸乙酯以形成二氧化硅层MSN,搅拌反应1h后,再次加入等量正硅酸乙酯,搅拌反应1.5h后,离心,得到PLNPs@MSN纳米粒子;
(2)PLNPs@MSN纳米粒子进一步氨基化PLNPs@MSN-NH2:
将上述步骤所得PLNPs@MSN纳米粒子分散在5mmol L-1NaOH水溶液中,搅拌12h,离心,得到羟基化的纳米粒子PLNPs@MSN-OH;将所述PLNPs@MSN-OH超声分散于乙醇中,搅拌下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷,混合物在70℃下反应12h,离心,洗涤,干燥,得到氨基化的纳米材料PLNPs@MSN-NH2;
(3)肉桂醛的负载和透明质酸的包封
将上述步骤所得PLNPs@MSN-NH2和肉桂醛分散于乙醇中,搅拌24h,离心分离得到负载了肉桂醛的纳米粒子PLNPs@MSN-NH2@CA;将透明质酸HA先溶解于超纯水中,然后加入pH 6.0的磷酸盐缓冲液,随后加入活化剂羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,反应1-2h后,用1mol L-1NaOH溶液将反应体系pH调至8.0,然后加入所述PLNPs@MSN-NH2@CA纳米粒子,再反应12h后,离心、洗涤,得到包封了HA的纳米材料PLNPs@MSN@CA-HA,简称PMC-HA;所述PMC-HA复溶于超纯水中,浓度为1mg mL-1,备用;
(4)功能性纳米平台PMC-HA-MnO2的制备
上述步骤所得PMC-HA溶液,加入37.5mg mL-1的聚烯丙胺盐酸盐溶液,搅拌4h后,离心洗去多余的聚烯丙胺盐酸盐,复溶于超纯水中,在搅拌下,缓慢滴加0.79mg mL-1的KMnO4水溶液,直至溶液变为棕色,8000rpm离心10分钟,洗涤,得到包裹了MnO2层的PMC-HA-MnO2纳米材料;将制备的PMC-HA-MnO2纳米材料分散在pH 5.5、10mmol L-1的磷酸盐缓冲液中,并置于4℃保存。
4.如权利要求3所述制备功能性纳米平台的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述采用水热法结合煅烧的方法为,将硝酸锌溶液、硝酸镓溶液、锗酸钠溶液以及硝酸铬溶液以摩尔比1.2:1.6:0.2:0.0075混合,调pH至8-9,在220℃反应20-24h,离心,洗涤,干燥后将得到粉末材料,再在800℃下煅烧1h。
5.如权利要求3所述制备功能性纳米平台的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述PLNPs与十六烷基三甲基溴化铵重量比为1∶4,所述正硅酸乙酯的加入量为每100mg PLNPs加入800μL正硅酸乙酯。
6.如权利要求3所述制备功能性纳米平台的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的滴加量为每100mg羟基化的纳米粒子PLNPs@MSN-OH加入400μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
7.如权利要求3所述制备功能性纳米平台的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述氨基化纳米粒子PLNPs@MSN-NH2与肉桂醛的质量比为1∶1~2;所述负载了肉桂醛的纳米粒子PLNPs@MSN-NH2@CA与透明质酸HA的质量比为1∶1.5~3;所述HA、羟基硫代琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1∶4∶2。
8.如权利要求3所述制备功能性纳米平台的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述PMC-HA溶液与KMnO4水溶液的体积比是1∶0.06。
9.权利要求1或2所述的一种功能性纳米平台或如权利要求3~8任一方法制备的功能性纳米平台,在细菌感染方面的应用。
10.如权利要求9所述的功能性纳米平台,在细菌感染方面的应用,其特征在于,用于包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)或耐药金黄色葡萄球菌的灭杀。
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