KR20200010852A

KR20200010852A - 로듐 나노구조체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 구조 제어된 로듐 나노구조체

Info

Publication number: KR20200010852A
Application number: KR1020180085427A
Authority: KR
Inventors: 장홍제; 민달희; 강성훈; 신우준
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2020-01-31
Also published as: KR102084316B1

Abstract

본 발명은, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중, 특정 온도와 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해, 로듐 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 제조되는 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있는 로듐 나노구조체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 구조 제어된 로듐 나노구조체에 관한 것이다.

Description

로듐 나노구조체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 구조 제어된 로듐 나노구조체{MANUFACTURING METHOD OF RHODIUM NANOSTRUCTURES AND STRUCTURE-CONTROLLED RHODIUM NANOSTRUCTURES PREPARED THEREBY}

본 발명은 로듐 나노구조체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 구조 제어된 로듐 나노구조체에 관한 것이다.

로듐(Rhodium)은 전기화학적으로나 유기화학합성 분야에 응용이 기대되는 전이금속 촉매로서, 특히 로듐 나노입자는 19세기 초에 발견되었기는 하나 취급성과 희귀성 때문에 실질적으로 널리 활용되기엔 제한이 있었다. 오늘날에 이르러 금속 로듐 나노입자의 촉매 활성과 리사이클에 대한 연구가 활발히 진행되어 오고 있기는 하나, 현재까지 생물학적으로는 활용되지 않고 있으며, 로듐 나노입자의 세포독성에 대한 연구도 이루어지지 않고 있었다.

로듐 나노입자의 촉매적 활성의 주요 인자들은 크기와 모양이며, 일반적인 로듐 나노입자는 크기가 4 ㎚ 이하인 것들이 주로 활용되어 왔다. 한편, 로듐 나노입자를 수십 나노미터 범위의 다양한 크기와 형태를 가지게 하는 경우 다른 분야에 효과적으로 활용될 것으로 기대되고 있어, 이러한 차원의 합성방법 중 하나는 위치 특이적 침착을 위해 할라이드 이온으로 전위-선호 쌍(Cu(s)│Rh³⁺(aq))을 선택하는 것, 또 다른 합성방법 중 하나는 나노 큐브에 환원제를 가하는 것이다.

로듐 나노입자의 촉매 반응은 널리 알려져 있으나, 이를 생물학적 용도로 활용되고 있지는 않은 실정이며, 다양한 크기와 형태를 가진 로듐 나노입자를 제조하는 방법에 대한 연구 또한 계속되고 있다. 한편, 본 발명자들은 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해 사이즈 조절이 가능한 로듐 나노입자를 합성하고, 이를 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료 용도로 사용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중 특정 온도와 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해, 로듐 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 제조되는 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있는 로듐 나노구조체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체는 우수한 생체 적합성, 광열 전환 효과 및 표면 기능화를 나타내므로, 암세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지는 로듐 나노구조체를 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 명세서에서는, 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 질산은 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 제조된 은 나노플레이트 용액에 에틸렌글라이콜과 증류수를 혼합하고, 로듐(Rh³⁺) 이온을 투입하여 185 내지 195℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응을 수행시키는 단계를 포함하는 로듐 나노구조체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는 로듐(Rh)과 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과를 나타내는 로듐 나노구조체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중 특정 온도와 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해, 로듐 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 제조되는 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다.

또한, 상기 방법에 따라 제조된 로듐 나노구조체는, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 우수한 생체 적합성, 광열 전환 효과 및 표면 기능화를 나타내므로, 암세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가진다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 은(Ag) 나노플레이트 주형에 로듐 이온의비율을 달리하여 역방향성 갈바닉 치환반응을 수행함으로써 다양한 형상의 나노구조체를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 제어할 수 있음을 확인한 실험 데이터이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 제조되는 로듐 나노쉘, 로듐 나노프레임, 로듐 다공성 나노플레이트의 형성 과정과 구성 원소 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 제조되는 로듐 나노쉘, 로듐 나노프레임, 로듐 다공성 나노플레이트의 특성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 제조되는 로듐 나노쉘, 로듐 나노프레임, 로듐 다공성 나노플레이트의 암세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 제조되는 로듐 나노쉘, 로듐 나노프레임, 로듐 다공성 나노플레이트의 종양 보유 마우스에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 나타낸 것이다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 로듐 나노구조체 제조방법 및 이에 따라 제조된 구조 제어된 로듐 나노구조체에 대하여, 보다 상세하게 설명하기로 한다.

로듐 나노구조체의 제조방법

상술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따르면, 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 질산은 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 제조된 은 나노플레이트 용액에 에틸렌글라이콜과 증류수를 혼합하고, 로듐(Rh³⁺) 이온을 투입하여 185 내지 195℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응을 수행시키는 단계를 포함하는 로듐 나노구조체의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명자들은, 은(Ag) 나노플레이트 용액 제조 과정 중 특정 온도와 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해, 로듐 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 제조되는 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다는 점, 또한 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체는, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 우수한 생체 적합성, 광열 전환 효과 및 표면 기능화를 나타내므로, 암세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가진다는 점을 실험을 통하여 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 은 나노플레이트(용액)를 제조하는 과정은 당해 기술 분야에서 일반적인 방법에 의한 것일 수 있고, 구체적으로 질산은(AgNO₃) 용액에 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP), 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 과산화수소수소, 수소화붕소나트륨 등과 같은 첨가제를 가하여, 은 나노시드를 먼저 제조한 다음, 시드 기반 성장을 통해 크기 조절하여 은 나노플레이트 용액으로 제조하는 것일 수 있다. 일례로, 본 발명의 일실시예에 따르면 은 나노플레이트는 시드 기반 성장법으로 크기 조절된 것이 사용될 수 있으며, 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)이 근적외선 영역으로 적색 이동된 것일 수 있다.

한편, 제조된 은 나노플레이트 용액에 에틸렌글라이콜과 증류수를 혼합하고, 로듐(Rh³⁺) 이온을 투입하여 185 내지 195℃ 온도 조건, 상세하게는 190℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응을 수행시킨다. 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 은 나노플레이트 용액에 투입되는 로듐(Rh³⁺) 이온은 RhCl₃ 와 같은 형태로, 은 나노플레이트 용액에 첨가될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 185 내지 195℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응이 수행될 수 있으며, 상세하게는 190℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응이 최적화 되어 수행될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계에서는 환원제에 의한 과량의 갈바닉 치환 반응에 반응 온도와 로듐/은 원자 몰 분율을 달리하여 역방향 갈바닉 치환 반응(inverse-directional galvanic replacement, 이하 IGR)을 유도한다. 구체적으로 대기 조건에서 음의 셀 전압 때문에 자발적으로 발생하지 않는 Ag(s)와 Rh³⁺(aq) 사이의 산화 환원 반응은, 온도를 가함으로써 자발적으로 발생하게 된다. 특히, 상기 역방향성 갈바닉 치환 반응 내에서 갈바닉 치환과 이차 성장은 반응 혼합물 중의 금속 양이온 종의 농도에 따라 경쟁적으로 진행된다.

보다 상세하게 설명하면, 로듐의 경우 주형인 은(Ag) 나노플레이트(Ag|Ag⁺: 0.7996 V vs SHE)에 비해 0.0416 V 낮은 표준 환원 전위를 가지고 있기에 상온 조건에서 일반적인 갈바닉 치환 반응이 일어날 수 없다. 은(Ag)과 로듐 (Rh³⁺) 이온 간의 균형 산화환원 반응식과 전극 전위를 계산하기 위한 네른스트 방정식을 기반으로, 반응 온도를 증가시키고, 로듐 이온(Rh³⁺) 농도를 증가시킴으로써, 양의 전극 전위를 유도하여 역방향성 갈바닉 치환 반응이 자발적으로 일어나게 한다. 과량의 로듐 이온은 고온 조건에서 일시적으로 갈바닉 치환 반응을 진행시키며, 반응 평형은 점차적으로 2차 성장 단계로 이동하게 된다. 갈바닉 치환 이후 잔여 로듐 이온은 혼합물 내 환원제에 의해 환원된다. 결국, 반응 온도, 환원성 첨가제, 폴리올 용매는 로듐 농도에 따른 나노구조체 형성에 핵심적인 역할을 수행한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 제어할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따라, 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 0.82 초과 4.06 이하로 하는 경우, 제조되는 나노구조체의 형상을 나노쉘 형태로 제어할 수 있고, 본 발명의 또 다른 일실시예에 따라, 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 4.06 초과 6.50 이하로 하는 경우, 제조되는 나노구조체의 형상을 나노프레임 형태로 제어할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에 따라, 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 6.50 초과 8.13 미만으로 하는 경우, 제조되는 나노구조체의 형상을 다공성 나노플레이트 형태로 제어할 수 있다(도 2 참조).

관련하여 구체적으로 설명하면, 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율 4.06 이하의 범위, 특히 0.82의 경우에서는 부분적으로 깎여 나간 나노플레이트 구조가 관찰되는데, 반응 초기 단계에서 갈바닉 치환 반응이 용액 내 은 이온(Ag⁺) 부재 상황으로 진행이 되나, 치환 반응을 통해 녹아나온 은 이온의 증가와 환원을 통한 로듐 이온의 감소로부터 반응 자발성이 소실되어 반응이 종결된다. 한편, 이보다 더 높은 화학량론적 비율에서는 속이 빈 나노쉘 구조가 형성되며, 이는 기존 일반적인 갈바닉 치환 반응을 통해 형성되는 것으로 뒤따르는 씨앗 기반 표면 성장은 잔여 금속 양이온과 환원제에 의해 유발된다.

한편, 화학량론적 비율이 4.06을 초과하는 경우, 예를 들어 4.48 내지 6.50의 비율에서는 나노 골격 구조 형성과 내부 빈 공간으로의 2차 성장을 나타낸다. 상대적으로 많은 양의 로듐 이온에 의해 갈바닉 치환 반응이 빠르게 진행되어 나노 골격 구조를 형성한다. 전지 전압이 중성화되어 산화환원 반응이 종결된 이후, 잔여 금속 양이온들은 나노프레임 표면에서 씨앗 기반 성장 기작을 통해 2차 성장하게 되는데, 나노입자 표면의 이중 전기막 우세도에 따라 나노프레임 내부로 성장하게 된다. 이는 내부 Stern 막과 외부 확산층으로 구성된 Gouy-Chapman 모델로 설명된다. 나노프레임 내부 곡면 구조에 따른 보다 밀도 높은 전기 이중 막과 반데르발스 상호작용으로 인해, 금속 양이온이 보다 쉽게 내부에 위치할 수 있게 된다. 그리고 높은 충돌 빈도는 2차 성장이 나노프레임 내부 빈 공간에 우세하게 발생할 수 있도록 한다.

한편, 6.05를 초과하는 경우 주형인 은 나노플레이트 전 면적에서의 격렬한 갈바닉 치환 반응을 일으키게 되며, 뒤이은 씨앗 기반 성장은 다공성 나노플레이트 구조 형성을 유도한다. 화학량론적 비율이 8.13인 경우 다공성 나노구조체의 기공 충진과 나노플레이트 두께 성장만을 유도했다.

이상과 같은 실험결과를 통해 첨가되는 로듐의 농도를 기반으로 나노쉘, 나노프레임 및 다공성 나노플레이트의 3종류의 나노구조체를 높은 재현성으로 형성할 수 있다는 점을 확인할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 첨가제로서 사용되는 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제는 환원과 안정화에 기여하여 정돈된 나노구조체 형성을 돕게 된다.

특히, 종래 기술에 따라 금 나노구조체 등을 제조할 때, 먼저 은 나노플레이트를 제조하게 되는데, 상기 은 나노플레이트가 제조된 다음 사용하였던 첨가제 성분들을 불순물로 상정하여 이를 제거 또는 정제한다. 다음으로, 은 나노플레이트를 금 나노플레이트로 이행시킬 때, 추가적인 성분들을 가하여 반응을 진행시키게 되는데, 본 발명은, 은 나노플레이트를 제조한 후, 별도의 정제 혹은 첨가제 성분 제거 과정 없이 로듐 이온을 첨가하여 원팟(one-pot) 반응으로 로듐 나노구조체를 제조한다는 점에서 종래 기술 대비 차별화되며, 따라서 종래 기술 대비 경제성 및 공정 간편성 측면에서도 유리한 효과가 있고, 나아가 특정 온도 및 특정 첨가제 조합 하에서 반응을 수행함으로써 제조되는 로듐 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있게 된다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit)은 표면-캡핑 안정제 역할을 수행하는 것으로서, 나노 물질의 분산에 기여할 수 있다. 시트르산 삼나트륨의 부재 시, 갈바닉 치환 반응의 부산물로 형성된 염화은(AgCl)이 생성된 작은 나노입자 조각 표면에 밀집하여 응집되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 시트르산 삼나트륨을 첨가제로서 포함하는 경우 나노 물질 표면에서 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit)의 흡착 거동에 의해 야기된 추가적인 안정화 효과에 의해 위와 같은 문제를 효과적으로 방지할 수 있게 된다.

본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP)은 과량적 갈바닉 치환 반응에서 나노구조체의 파편화(fragmentation)를 방지하기 위한 것으로서, 폴리(바이닐피롤리돈)부재 시, 나노플레이트의 초기 구조가 유지되지 않고, 작은 파편(debris)으로 파편화되는 문제점이 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 L-아스코르브산(L-AA)은 2차 환원제로서, 갈바닉 치환 반응에 있어 파편화를 방지하고, 나노구조체를 2차 성장시키는 역할을 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 첨가제로서 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산이 모두 포함된 조건 하에서 상기 단계가 수행될 수 있고, 일례로 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산은 은(Ag) 나노플레이트 전체 용액 40 ㎖ 를 기준으로, 각각 0.15 mM, 30 mM, 1 mM 의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 농도로 포함되는 경우 제조되는 나노구조체는 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지도록 할 수 있다.

한편, 이상과 설명한 바와 같은 로듐 나노구조체의 역방향 갈바닉 치환 합성은 자외선-가시광선 스펙트럼을 통해 뒷받침된다. 화학량론적 비율 4.06 이하에서는 자외선-가시광선-적외선 파장 영역에서 확연한 변화를 보이는데, 나노쉘 구조와 나노이슬 성장은 340㎚(은 나노플레이트의 out-of-plane 4중 극자 모멘트)의 감쇠와 256㎚(로듐 나노입자의 자외선 파장 국부 표면 플라즈몬 공명)의 생성으로부터 각각 확인할 수 있다. 속이 빈 나노쉘 형성은 최대 LSPR 파장의 754 부터 907㎚로의 적색 편이를 통해 확인할 수 있다. 마지막에 관찰되는 896㎚ 로의 청색 편이는 나노쉘 껍질 두께 증가로 인한 나노쉘 외부 표면과 내부 빈 공간 사이의 플라즈몬 혼성으로 인한 반대칭 반결합 공명 모드와 대칭 결합 공명 모드로부터 기인한다. 나노프레임 형성에 따라 최대 흡광 파장은 지속적으로 청색 편이하여 658㎚로 이동한다. 나노프레임 내부 성장은 거시적으로 밀집된 구형 나노구조로의 점차적인 변화를 의미한다. 다공성 나노플레이트 구조 형성 기준점으로부터 376㎚ 흡광이 관찰되며, 이는 335㎚까지 청색 편이되는데, 이는 로듐 나노입자 미세구조의 형성으로 인한 자외선 LSPR 특성으로부터 유래한다.

한편, 반응 시간에 따른 나노구조체 형성에 대한 추가적인 확인을 위해, 속이 빈 나노쉘(화학량론적 비율: 4.07), 나노프레임(화학량론적 비율: 4.88), 다공성 나노플레이트(화학량론적 비율: 7.32)가 형성되도록 하여, 반응 1, 2, 4 시간 경과 시점에서 냉각을 통해 반응을 정지시켰다. 도 3의 (a)를 참조하면, 모서리와 면에 집중된 반응속도적 조절된 갈바닉 치환 반응을 통해 나노쉘 형상이 만들어 지는 것을 확인할 수 있다. 속이 빈 나노쉘 구조는 추가적으로 다크필드 STEM과 에너지 분산 분광기법을 통한 선형 프로파일링을 통해 분석되었다. 나노프레임 형성 조건 하에서는, 1 시간 경과 시 모서리에서만 치환 반응이 작용하고, 2시간 및 4시간 경과 시점에서 관찰 시 이를 바탕으로 점차적으로 내부 방향으로 두께 향상과 함께 성장하는 것을 확인할 수 있었다(도 3, (b) 참조). 다공성 나노플레이트 형성의 경우에는, 큰 기공을 갖는 나노클러스터가 1 시간 경과 시점에서 형성되며, 이들의 전체적인 영역에서의 이차 성장이 일어나는 것을 도 3 (c)에서 확인할 수 있었다. HAADF-STEM/EDS 선형 프로파일을 통해 나노쉘, 나노프레임, 다공성 나노플레이트 순으로 로듐 첨가량이 증가함에 따라 은 함유량이 감소하는 것으ㄹ 확인할 수 있었고, 이는 네른스트 방정식에 따라 어느 시점에서 갈바닉 치환 반응이 종결되느냐에 따라 좌우된다.

한편, 갈바닉 치환 반응과 뒤이은 이차 성장 반응에 따라 각 나노구조의 조성에 차이점이 있을것이라 예측하고, 이에 대한 분석을 수행하였다. X선 산란과 X선 양전자 분광법을 실리콘 웨이퍼 위에 필름 형태로 각 나노구조체 입자를 도포하여 분석을 수행하였다. 산란 패턴과 결합 에너지 스펙트럼은 결정 상태의 은과 염화은, 그리고 치환된 로듐이 존재함을 확인할 수 있게 하였다. 고해상도 투과전자현미경 이미지에 따르면, 세 종류의 로듐 나노구조체 모두 면심입방 결정구조의 산란 패턴을 명확히 보였다. 조성에 대한 보다 명확한 분석을 위해 HAADF-STEM/EDS 원소 맵핑을 하나의 각 나노입자에 초점을 맞추어 수행하였다. 종합적으로 속이 빈 나노쉘 구조, 나노프레임의 내부 방향 성장, 그리고 다공성 나노플레이트의 합성이 재현성 있게 특정 농도에 기반한 역방향성 환원제 보조 갈바닉 치환 반응을 통해 이루어진다는 점을 확인할 수 있었다.

로듐 나노구조체

한편, 상술한 방법에 따라 제조된 본 발명의 일실시예에 따른 로듐 나노구조체는, 로듐(Rh)과 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900 ㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과를 나타낸다.

상기 로듐 나노구조체는 다공성 구조를 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 로듐 나노구조체는 나노쉘(Nano Shell), 나노프레임(Nano Frame) 및 다공성 나노플레이트(Nano Plate)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형상을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로 반응 온도와 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 제어할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 로듐 나노구조체의 광열 전환 효과는 전자-포논 상호 작용을 통한 운동 에너지 전달에 대한 입사광 흡수 및 전자 진동에기인하는 것으로 보인다. 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 로듐 나노구조체의 주된 흡수 파장은 UV-Vis-NIR 전영역이고, 800-900㎚ 영역에서도 우수한 흡광도를 가지므로, 특히 800-900㎚ 파장을 주로 활용하는 의약학적 활용에 적합하며, 이는 종래의 구형 금 나노입자와 비교하여 우수한 광열 전환 효과를 나타낸다.

한편, 상기와 같은 형상을 가지는 경우, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체의 적재가 용이하다. 이에 따라, 본 발명의 일실시예에 따른 로듐 나노구조체는 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체가 적재될 수 있다. 이와 같이 로듐 나노구조체의 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상이 적재되는 경우, 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가질 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 SEM/EDS 분석을 통해 분석한 결과, 상기 로듐 나노구조체에 포함된 로듐(Rh) 및 은(Ag)의 합금(alloy)은 로듐/은의 비율이 약 5.3 (나노쉘), 23 (나노프레임) 및 6.6 (다공성 나노플레이트)에 해당하는 것을 확인할 수 있었다.

다공성 로듐 나노구조체에 대한 전달체 적재

한편, 본 발명의 일실시예에 따른 로듐 나노구조체 제조방법는, 상술한 단계에 의해 제조된 로듐 나노구조체에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체를 적재하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 로듐 나노구조체는 약물 전달 및 치료 분야에서 일반적으로 사용되는 종래의 구형 금 나노입자와 비교할 때, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지므로, 약물 전달 및 치료 분야에서 더욱 효과적으로 활용될 수 있다.

이상으로 설명한 바와 같이, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중 특정 온도와 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환반응을 통해, 로듐 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 제조되는 나노구조체의 사이즈 조절이 용이하고, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체는 우수한 생체 적합성, 광열 전환 효과 및 표면 기능화를 나타내므로, 암세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지므로, 약물 전달 및 치료 분야에서 더욱 효과적으로 활용될 것으로 기대된다.

실시예

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

<실시예 1: 로듐 나노구조체의 제조>

은(Ag) 나노시드의 준비

10mM의 질산은(AgNO₃) 250㎕, 30mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 300㎕, 3.5mM의 폴리(바이닐피롤리돈)(Mw=29kDa) 1.5㎖ 및 24.75㎖의 탈이온수를 유리 바이알(vial)에 넣고, 30% 과산화수소 60㎕를 첨가한 다음, 균일한 혼합을 위해 부드럽게 교반하였다. 상기 혼합물에 100mM의 수소화붕소나트륨을 첨가하여 옅은 노란색으로 변색시켰다. 그런 다음, 3시간의 반응 시간 동안 투명, 짙은 노란색, 오렌지색, 그리고 최종적으로 보라색으로 변화가 일어난 후 추가적인 색상 변화가 진행되지 않는 것을 확인하고 별도의 정제 과정 없이 다음 성장 반응 단계로 이행하였다.

시드 성장법에 의한 은(Ag) 나노플레이트의 합성

상기 시드 용액 10㎖에 75mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 0.125㎖ 및 100mM의 L-아스코르브산 0.375㎖를 첨가하였다. 다음으로, 성장 용액은 1mM의 질산은(AgNO₃) 20㎖, 100mM의 시트르산 0.125㎖, 75mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 10㎕와 함께 준비되었다. 상기 시드 용액 혼합물에 5㎖의 성장 용액을 5초당 1㎖의 속도로 첨가하여 은 나노플레이트를 제조하였다. 추가적인 성장을 위해 5㎖의 성장 용액을 위와 같은 방식으로 첨가되었다. 역방향성 환원제 보조 갈바닉 치환을 통해 로듐 나노구조체를 제조하기 위해 별도의 정제 과정 없이 다음 변형 반응 단계로 이행하였다.

역방향 갈바닉 치환에 의한 로듐 나노구조체의 합성

역방향성 환원제 보조 갈바닉 치환을 위해, 30 mL 유리 바이알에 첨가제를 상술한 바와 같이 포함하는 은(Ag) 나노플레이트 용액 4 ㎖와 에틸렌글라이콜 10 ㎖를 첨가하였다. 한편, 로듐 나노쉘, 로듐 나노프레임, 로듐 다공성 나노플레이트를 제조하기 위해 각각 4.2 mM의 RhCl₃ 수용액 500, 620, 900 ㎕를 첨가하고, 190℃ 온도 조건 하에서 4 시간 동안 반응시켰다. 이를 통해 얻어진 최종 생성물은 8,000rpm에서 15분간 원심분리를 통해 정제되고, 탈이온수로 3회 세척되었다.

<실시예 2: TAT 펩티드, FAM-Dz 적재된 로듐 나노구조체의 제조>

보다 효율적인 세포 내재화를 위해, 우리는 실시예 1에 따라 합성된 로듐 나노 구조체와 잠재적 인 금속-싸이올 친화성 및 정전기 상호 작용에 기초한 인간 면역 결핍 바이러스 CGGYGRKKRRQRRR (밑줄 친 문자는 TAT 펩티드의 필수 서열을 나타내고 굵은 글자는 접합을위한 티올 함유 서열을 나타낸다)의 세포 투과성 TAT (Transactator of Transcription)를 혼합했다. 현재 단계에서 TAT 펩타이드 적재 효율이 다른지에 대해 정확한 설명을 하는 것은 불가능하지만, 각 나노구조들의 표면의 차이와 형태적 요소 때문이라고 예측할 수 있다. TAT 펩타이드 접합에 대한 나노 입자의 세포 흡수는 추가로 형광 표지된 올리고 뉴클레오티드가 로딩 된 나노 입자를 형광 현미경을 이용해 추가로 확인했다.

<실험 1: 세포 독성 실험>

세포 기반 치료 응용이 가능한지 여부를 살펴보기 위해, 실시예 1에 따라 제조된 로듐 나노구조체를 이용하여 인간의 자궁 경부암 세포 라인 (HeLa 세포)에 대한 로듐 나노쉘, 나노프레임 및 다공성 나노 플레이트의 세포 독성을 검사했다.

구체적으로 로듐 나노구조체의 반 희석 처리 후 24 시간 인큐베이션 한 MTT (3-(4,5-다이메틸싸이아졸-2-yl)-2,5-다이페닐테트라졸리움브로마이드) 분석의 결과에 따르면, 로듐 기반의 나노구조체 들은 1 당량 이상의 농도에서 세포 독성을 보이는 것을 볼 수 있었다. 이를 우리는 우리가 이전에 암 치료로써의 효용을 보인 다공성 금 나노플레이트와 비교를 하는 경우, 어느 것도 0.5 당량 이하의 농도에서는 세포 독성을 나타내지 않았다. 생체 적합성의 감소하는 순서는 0.5 당량 이상의 농도에서 로듐 나노프레임> 로듐 다공성 나노 플레이트> 로듐 나노쉘> 다공성 금 나노 플레이트였다.

즉, 이러한 결과는 로듐 나노구조체가 높은 생체 적합성 때문에 다양한 생물학적 응용에 사용되어 왔던 금 나노구조체와 유사하다는 것을 시사한다(도 4 (a) 참조).

<실험 2: 광열 전환 특성>

실시예 1에 따라 각각 제조된 나노쉘, 나노프레임, 다공성 나노플레이트 형상의 로듐 나노구조체를 준비하고, 이들의 광학적 특성을 보기 위해 UV-Vis 분광 광도계를 사용하였다. 정량적 비교를 위해, 모든 나노입자의 농도는 모든 템플릿이 손실이 없다는 가정하에 같은 양의 은 나노 플레이트를 넣었고 이를 1당량이라고 농도를 정하였다.

나노쉘, 나노프레임 및 다공성 나노 플레이트는 각각 최대 흡수가 896, 792 및 367 ㎚ 인 가시광 영역에서 LSPR 피크를 보였다. 특성 LSPR 피크 위치를 제외하고, 전체 파장 영역에서의 소멸은 다공성 나노 플레이트, 나노프레임 및 나노쉘 순서로 측정되었다.

한편, 광열 변환 효과는 다른 파장대의 빛에 대해 비교 되어야 하므로, 피부 투과를 고려할 때 가장 널리 사용되는 808 ㎚ NIR 다이오드 레이저로 조사했을 때의 광열 변환 효율을 보았다. 근적외선 (NIR) 조사 (808 ㎚, 4 W/cm²) 하에서, 3 개의 나노구조체 입자 모두는 분명히 큐벳 내의 온도 상승을 나타냈다.

1x PBS (T_f = 20.8℃, ΔT = 0.2℃)에서의 무시할수있는 온도 변화와 비교했을 때, 0.4 당량에서 12초간 조사를 통해 나노쉘(T_f = 52.8℃, ΔT = 32.2℃), 나노프레임 (T_f = 60.7℃, ΔT = 40.1℃), 다공성 나노플레이트 (T_f = 61.9℃, ΔT = 41.3℃) 와 같은 중요한 광열 변환효과가 관찰되었다.

암세포 고열 제거 (> 42℃)에 필요한 온도를 기준으로 하면, 이 온도 상승은 충분한 수준으로 간주되었고, 가장 높은 광열 변환 효율을 보인 다공성 나노플레이트의 경우 광열 전환 효과 및 이를 통한 암세포의 선택적 치료 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.

<실험 3: 종양 세포 제거 특성>

0.4 당량의 가장 높은 농도를 기준으로 실시예 2에 따른 로듐 나노 구조체의 광열 전환 효과에 의한 고열 암 세포 절제 특성을 확인하였다.

생물학적 적용에 대한 요구 사항을 확인하기 위해, 우리는 완전한 세포 배지를 포함하는 10% 태아 소 혈청 (FBS)에 대한 나노 입자의 콜로이드 안정성 평가를 수행했다. UV-Vis 분광 광도계와 최대 24 시간 동안 배양 한 디지털 사진 이미지 관찰에 따르면 나노 입자의 콜로이드 안정성이 비교적 잘 유지되었다.

이러한 관찰로부터, 나노 프레임의 세포 내재화는 표면 개질의 어려움 때문에 비효율적이었다고 생각되었다. 또한, NIR 조사에 의한 고열 세포 사멸은 나노 프레임의 광열 변환 효율이 큐벳 규모에서 우수하더라도 관찰하기가 어려웠다. 시험 관내 고온 열 제거와 후속 칼세인 AM/에티디움 호모 다이머 -1 살아있거나/죽어있는 염색 형광은 결과적으로 현재의 가설과 일치한다. 광열 요법 처리된 세포의 아넥신 V-FITC/프로피디움 아이오다이드 염색 및 활성 산소 종 (ROS) 지시약 carboxy-H2DFFDA 염색은 광열 치료 도중 ROS 생성과 상승 효과에 의해 세포 자멸 경로 매개 암세포 제거와 화학적으로 유도된 세포 사멸의 사실을 추가로 증명했다(도 4 (d) 참조).

특이적으로 구조화된 3가지 로듐 나노구조체와 다공성 금 나노 플레이트를 양성 대조군으로 사용하여 시험관 내 정량적 광열 치료 효과를 MTT 분석을 통해 HeLa 세포에 대해 적용하였다(도 5 참조). 처리되지 않은 제어 조건의 세포 생존력과 비교했을때 로듐 나노쉘 (98.1 %), 로듐 나노프레임 (101.7 %), 로듐 다공성 나노 플레이트 (102.1 %), 다공성 금 나노 플레이트 (98.6 %) 등의 간단한 치료는 유의한 독성을 나타내지 않았다. TAT 펩타이드의 표면 개질을 통해 향상된 세포 투과성을 가짐에도 불구하고, 모든 로듐 나노파티클(나노쉘(100.5%), 나노프레임 (101.0%) 그리고 다공성 나노플레이트(101.2%))은 생물학적 응용분야에서 쓰이는 금(101.1%)과 비교했을 때도 훌륭한 생체적합성을 보인다는 것을 알 수 있었다. PTT(Photothermail theraphy) 테스트 (4 W/cm², 5 분)에서 사용된 808 ㎚ 근적외선 레이저 조사의 수용 가능성은 세포가 NIR 치료 조건 (100.1 % 생존 가능)으로 치료되었을 때 증명된 세포 생존률로부터 확인될 수 있다. 마지막으로, 각 나노 입자의 도입 후, 샘플을 NIR로 조사하고 광열 치료 효율을 비교하였다 나노 입자를 염기로 처리한 경우 로듐 나노 프레임(103.0 %)을 제외한 로듐 나노쉘 (97.8 %), 로듐 다공성 나노플레이트 (95.3 %) 및 다공성 금 나노플레이트 (96 %)에서 PTT 효율이 약간 향상되었다. PTT 효율은 로듐 나노쉘 (26.9 %), 로듐 다공성 나노플레이트 (8.46 %) 및 다공성 금 나노플레이트 (9.1 %)에서 근적외선 조사 후 TAT 펩타이드 변형으로 확연히 향상되었지만 로듐 나노프레임 (101.0 %)에선 다시금 효율을 보이지 못했다. 로듐 나노 프레임에서 PTT 특성이 없는 것은 면적 제한적 근적외선 조사 시험에 따른 세포 제거 시험에서 관찰된 것과 동일하였고 세포 투과성이 광열 전환과 비교할 때, 이 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 나노 입자와 표면 변형에 대해 몇 가지 비교를 수행함으로써, 로듐 다공성 나노플레이트가 최상의 PTT 가능성을 나타냈다는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 살아있는 세포와 죽어 있는 세포의 염색을 통해 형광 현미경에 이용하여 광열 치료학적 특징을 알아냈다.

종양을 보유한 쥐는 BALB/c 누드 수컷 쥐 (생후 5주)에 1 x PBS 100 ㎕에 HeLa 세포 (6 Х 106 세포)를 피하 주사하여 제조하였다. 종양의 크기가 100㎜³가 되었을때, TAT 펩타이드를 결합한 로듐다공성 나노플레이트 (0.5 equiv., 100 ㎕)와 1 x PBS (100 ㎕)를 정맥 주사하였다. 12시간 후에 종양에 808㎚ 다이오드 레이저(3 W/cm²) 를 3분 조사한 후, 각 군의 종양 크기의 변화를 2일 간격으로 24일 동안 측정하였다.

도 6 (a)에서 도시된 바와 같이, 808 ㎚ 레이저로 처리되고 조사된 로듐 다공성 나노플레이트 군은 감소된 크기의 종양을 통해 유의적인 억제를 나타낸다고 볼 수 있었다. 그러나 레이저 조사가 있거나 없는 다른 그룹, 즉 1x PBS 및 레이저 조사가 없는 로듐 다공성 나노플레이트에서는 종양 성장 억제가 관찰되지 않았다. 이는 로듐 다공성 나노플레이트가 PTT를 통한 생체 내에서 암 세포 사멸 및 종양 성장 억제에 탁월한 효과가 있음을 입증했다.

이러한 종양 성장 억제 결과를 바탕으로, 808 ㎚ 레이저 조사 후 수크로오스 침윤 종양 절편화 및 H & E 염색을 24 일 동안 수행하여 808 ㎚ 조사 및 다른 그룹으로 처리 한 다공성 로듐 나노 플레이트의 종양 괴사를 비교하였다. 자료에서 보는것과 같이 808 ㎚ 레이저 조사로 처리된 다공성 로듐 나노 플레이트 군은 심각한 종양 세포 사멸을 보였다. 이와는 대조적으로 레이저 조사가 없는 다공성 로듐 나노 플레이트와 레이저 조사 그룹이 있거나 없는 1x PBS는 세포 사멸 경향을 나타내지 않았다.

이는 808 ㎚ 레이저를 조사했을 때만 다공성 로듐 나노 플레이트가 PTT를 통해 선택적으로 세포 사멸이 유도되었음을 보여주었다. 또한 다공성 로듐 나노 플레이트는 낮은 세포 독성을 나타내었고, 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장)의 조직 절편 이미지를 통해 다공성 로듐 나노 플레이트로 치료할 때 특징적인 독성이 없음을 보여주었다. 잘 알려진 향상된 투자율 및 보존 (EPR) 효과는 나노 입자가 생체 내에서 정맥 내로 종양까지 전달될 때 종양 주변의 혈관 상피 세포 사이의 갭 접합을 통해 나노 입자가 종양으로 전달되는 수동적 표적 현상이다.

체내 혈관 체계를 순환하는 나노 입자는 간이나 폐에 존재하는 면역세포에 의해소모 되어 종양에 효율적으로 전달되지 않는다. 우리가 사용한 로듐 다공성 나노플레이트는 우수한 생체 적합성으로 인해 EPR 효과를 통해 PTT를 통해 종양 성장 억제 및 암세포 세포 사멸을 유도하기에 충분한 양의 혈액 순환을 통해 체계적인 독성을 나타내지 않았다(도 6 (b) 내지 (d) 참조). 요약하면, 로듐 다공성 나노플레이트는 EPR 효과를 통해 종양으로 전달되어 생체 내에서 808 ㎚ 레이저 조사 하에 PTT를 통해 종양 성장 억제 및 암 세포 사멸을 효과적으로 유도하였다.

앞에서, 본 발명의 특정한 실시예가 설명되고 도시되었지만 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 따라서, 그러한 수정예 또는 변형예들은 본 발명의 기술적 사상이나 관점으로부터 개별적으로 이해되어서는 안되며, 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.

Claims

시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 질산은 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 제조된 은 나노플레이트 용액에 에틸렌글라이콜과 증류수를 혼합하고, 로듐(Rh³⁺) 이온을 투입하여 185 내지 195℃ 온도 조건 하에서 역방향성 갈바닉 치환 반응을 수행시키는 단계를 포함하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 제조된 로듐 나노구조체에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체를 적재하는 단계;를 더 포함하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 제어하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 0.82 초과 4.06 이하로 하여 나노구조체의 형상을 나노쉘 형태로 제어하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 4.06 초과 6.50 이하로 하여 나노구조체의 형상을 나노프레임 형태로 제어하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 로듐(Rh)/은(Ag)의 화학량론적 비율을 6.50 초과 8.13 미만으로 하여 나노구조체의 형상을 다공성 나노플레이트 형태로 제어하는 로듐 나노구조체의 제조방법.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는 로듐 나노구조체로서,
로듐(Rh)과 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과를 나타내는 로듐 나노구조체.
제 7 항에 있어서,
상기 로듐 나노구조체는 나노쉘(Nano Shell), 나노프레임(Nano Frame) 및 다공성 나노플레이트(Nano Plate)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형상을 가지는 로듐 나노구조체.
제 7 항에 있어서,
상기 로듐 나노구조체의 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에, DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체가 적재된 로듐 나노구조체.
제 7 항에 있어서,
상기 로듐 나노구조체는 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지는 로듐 나노구조체.