CN112852408A - 一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂和标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明创造提供了一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂和标记方法，包括荧光标记混合物和仙人掌提取液，所述荧光标记混合物包括荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3，所述荧光标记混合物中荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3的质量比为1：(5‑10)：(1‑3)，所述仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加(30‑100)mL。本发明创造所述的标记试剂和标记方法对拉萨裸裂尻鱼的损伤小，无毒副作用；在拉萨裸裂尻鱼耳石上形成的标记稳定性好，不受外界影响，可以永久保存；一次标记能够实现大规模的放流标记活动，最大限度降低人工操作对鱼苗的影响。

Description

一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂和标记方法

技术领域

本发明属于放流标志技术领域，尤其是涉及一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂和标记方法。

背景技术

拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi Regan)属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprnidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)裸裂尻鱼属(Schizopygopsis)，分布在雅鲁藏布江中上游干支流水体中，为中国的特有高原性鱼类(西藏自治区水产局，1995)。目前对拉萨裸裂尻鱼研究主要集中在食性(杨学峰，2011)，早期发育(许静，2011)，个体生物学及种群动态(段友健，2015)等方面。近年来，由于过度捕捞，使得局部地区拉萨裸裂尻鱼资源受到很大的影响(段友健，2015)。此外不科学的放生习惯，导致外来物种入侵，致使拉萨裸裂尻鱼等高原鱼类生存压力发生变化。加之拉萨裸裂尻鱼生长速度缓慢，性成熟晚(杨学峰，2011)，该资源一旦受到破坏，将很难有效恢复。目前，拉萨河拉萨裸裂尻鱼正在小型化(陈锋等，2010；洛桑等，2011)，2016年拉萨裸裂尻鱼被列入到中国脊椎动物红色名录(蒋志刚等，2016)。为保护拉萨裸裂尻鱼的种群数量，人工繁育、苗种培育及增殖放流等技术将会成为一种强有力的保护措施和扩繁手段。农业农村部每年设置一定经费用于地方品种增殖放流活动，恢复国内水生生态环境。西藏自治区自2009年年底，在林芝地区首次增殖放流裂腹鱼类(异齿裂腹鱼)鱼苗13万尾以来，到目前西藏共增殖放流2200多万尾，为合理评估放流效果，完善放流结构与方式，需对放流苗种进行标记跟踪监测，而探寻合理的标记方法是目前追踪放流鱼类的一大难题(温静雅等，2019)。

近年来应用较多的标志放流方法有切鳍法、挂牌法、金属线码标记及分子标记等。但这些方法或对鱼体损伤较大或操作复杂等，存在一定的局限性，不适用于内陆水域中高数量、小个体的鱼种标记放流。荧光标记技术是用荧光染料浸泡鱼类使染料沉积在鱼类耳石、鳞片等钙化组织上，产生在显微镜下可识别的荧光标记或着色点标记(Walt 等，2003)。荧光染料标记方法简单、适用范围广，对标记对象损伤较小，可大规模操作(耿倩等，2016)，在渔业研究中受到越来越多的关注(王臣等，2014)，已在日本银鱼Argyrosomus japonicus(Taylor 等，2005)、许氏平鲉Sebastes schlegelii(Lu等，2014)、1龄虹鳟 Oncorhynchusmykiss幼鱼(Close等，2002)、中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis(吴金明等，2016)、滇池金线鲃Sinocyclocheilus grahami (赵亚鹏等，2013)、长臀鮠Cranoglanis bouderius(赵萍等，2014)和珊瑚鱼(Jones等，1999)等多种鱼类中研究应用，取得了一定成效。目前拉萨裸裂尻鱼荧光标记研究还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂和标记方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂，包括荧光标记混合物和仙人掌提取液，所述荧光标记混合物包括荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3，所述荧光标记混合物中荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3的质量比为1：(5-10)：(1-3)，所述仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加(30-100)mL。

优选的，所述荧光标记混合物中荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K的质量比为1：5：1，所述仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加100mL。

优选的，所述荧光标记物为茜素红-S。

优选的，所述仙人掌提取液的制备工艺为：

将鲜仙人掌用去离子水冲洗，鲜仙人掌与水的质量比为1：10 混合后超声提取，提取温度为50-80℃，提取时间为60-150分钟；提取频率60-80KHz，超声输出功率50-100W；冷却后过滤后 3000-5000r/min离心取上清液即得。

应用上述标记试剂对拉萨裸裂尻鱼进行的标记方法，包括如下步骤：

(1)准备体长为(2.01±0.13)cm，体重为(0.0392±0.0096)g 的待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼若干，提前24h停止喂食；

(2)将待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼放入暂养容器中暂养0.5-1h，暂养过程中向水体增氧，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5；

(2)将标记试剂碾成细粉，用过滤后的养殖用水，经仔细搅拌，全部溶解，制成2000mg/L(以荧光标记物计)的母液待用；

(3)根据待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼数量准备大小合适的浸染容器若干；

(6)浸染容器中加入过滤后养殖用水，以母液配成100-300mg/L (以荧光标记物计)的浸染标记液；

(7)将拉萨裸裂尻鱼幼鱼以0.5尾/L的密度放入浸染标记液中，遮光环境浸染，每天投喂两次，浸染过程中水交换量为0.5h/次，水温12-13℃，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5；

(8)浸染结束后，使用清洁水拉萨裸裂尻鱼幼鱼周身染液。

优选的，所述浸染标记液的浓度为250-300mg/L(以荧光标记物计)，浸泡时间为24h。

优选的，所述浸染标记液的浓度为200mg/L(以荧光标记物计)，浸泡时间为48-84h。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

本发明创造所述的标记试剂和标记方法对拉萨裸裂尻鱼的损伤小，无毒副作用；在拉萨裸裂尻鱼耳石上形成的标记稳定性好，不受外界影响，可以永久保存；一次标记能够实现大规模的放流标记活动，最大限度降低人工操作对鱼苗的影响。

附图说明

图1为茜素红S对拉萨裸裂尻鱼幼鱼急性毒性试验结果；

图2为不同取样时间拉萨裸裂尻鱼幼鱼耳石标记效果图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例

制备仙人掌提取液：将鲜仙人掌用去离子水冲洗，鲜仙人掌与水的质量比为1：10混合后超声提取，提取温度为50℃，提取时间为 60分钟；提取频率75KHz，超声输出功率100W；冷却后过滤后 5000r/min离心取上清液即得。

制备拉萨裸裂尻鱼的标记试剂：将茜素红-S、正丁基苯并异噻唑酮质量比为1：5：1，仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加100mL,混合制备而得标记试剂。

试验例

1、材料和方法

1.1试验材料

试验拉萨裸裂尻鱼幼鱼为2020年3月在西藏自治区农牧科学院水产科学研究所雅鲁藏布江鱼类繁育基地繁殖的同一批鱼苗。试验鱼苗 43日龄，体长(2.01±0.13)cm，体重(0.0392±0.0096)g。茜素红-S 分子式C₁₄H₇NaO₇S，有效含量99.9％，购自福晨(天津)化学试剂有限公司，正丁基苯并异噻唑酮，购自上海朗旭生物科技有限公司，维生素K3，购自山东安百利生物科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1拉萨裸裂尻鱼幼鱼性毒性试验设计

进行预实验，得到标记试剂(均以茜素红-S浓度计，下同)的 24h全致死浓度和96h无死亡浓度，两个浓度之间为药物的浓度区间。在预实验基础上按等对数间距设计5个浓度梯度，每组30尾，组内 2个平行，一个对照组(无任何处理)。实验前24h停止喂食。实验采用半静态方式水生生物急性毒性实验法(GB/T 27861-2011)，记录 24、48、72和96h死亡数据。死亡个体以试验对象失去活力、用玻璃棒触碰刺激无反应为死亡标准。试验在长40cm×宽25cm×高15cm 的白色塑料盆中进行，浸泡过程中向水体增氧，因曝气、药物降解及实验鱼排泄等易使水质发生变化，试验期间每24h换药液1次，试验期间水温12-13℃，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5。试验期间不喂食并及时捞出死亡个体。

1.2.2不同标记试剂浓度和浸泡时间标记效果试验设计

根据急性毒性试验结果，设计一系列标记试剂浸泡液浓度和浸泡时间实验组和一个空白对照组，每组3个重复，每个重复150尾鱼。试验在长40cm×宽25cm×高15cm的白色塑料盆中进行，浸泡过程中向水体增氧，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5。浸泡结束后捞出在清水中暂养0.5h；暂养后移入长2.8m×宽0.5m×高 0.25cm的平列槽中长期养殖，平列槽从一端进水，一端排水，水交换量为0.5h/次。试验及养殖用水为曝气后的井水，水温12-13℃，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5。每天投喂两次，饵料为冰冻水蚯蚓，每天清理平列槽1次，统计各组死鱼数量1次并记录。

前3个月每月取样1次，每次各试验组鱼各取3尾，于50mg/L MS-222麻醉剂中麻醉后，测量体长，体重；奥林巴斯显微拍照系统拍摄鳃盖骨，鳍条；解剖镜下取出耳石，蒸馏水洗净，奥林巴斯显微拍照系统拍照。按照无(-)、可见(+)、明显(++)、强烈(+++)记录耳石染色效果。

1.3计算公式

采用寇式法(Karber)估算半致死浓度(LC₅₀)、安全浓度(SC)和半致死浓度的95％信区间，并做试验浓度对数与死亡率的回归方程，相关计算公式如下:

LogLC₅₀＝X_m－d(∑_p－0.5)

SC＝48LC₅₀×0./(24hLC₅₀/48hLC₅₀)₂

LogLC₅₀的95％置信限＝LogLC₅₀±1.96×d[∑(pg/n)]_0.5

式中:X_m为最大剂量的对数，d为相邻剂量组比值的对数，p为死亡率，∑_p为各组死亡率之和，g为存活率，n为每组受试鱼数。

1.4统计方法

实验结果采用Excel2010进行初步统计和作图；采用Spss 19.0 统计软件中one-way ANOVA进行单因子方差分析，若差异显著，则采用Duncan's进行多重比较，差异显著水平为P＜0.05。

2结果

2.1拉萨裸裂尻鱼幼鱼标记试剂急性毒性试验

急性毒性实验预实验结果表明，24h全死亡浓度为550.00mg/L， 96h无死亡浓度为200mg/L。在200-550.00mg/L区间按等比设置 200.00、257.55、331.66、427.10、550.00mg/L五个浓度梯度。急性毒性试验结果见图1；通过曲线回归，24、48、72、96h半致死浓度分别为451.25、317.07、308.62、303.69mg/L，安全浓度为60.78mg/L (表1)。

表1 标记试剂浓度对拉萨裸裂尻鱼幼鱼死亡率回归方程、半致死浓度及安全浓度

2.2不同标记试剂浓度浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼24h标记效果

不同标记试剂浓度浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼24h标记效果见表2。设置0、50、100、150、200、250、300mg/L 7个标记试剂浓度浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼24h，各农组死亡率均较低，且从差异不显著(p ＞0.05)。浓度为0-100mg/L浓度组耳石无标记效果，150mg/L浓度组耳石标记可见，200mg/L浓度组耳石标记明显，250-300mg/L浓度组耳石标记显著。

表2 不同标记试剂浓度浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼24h标记效果

注：同行相同小写字母上标表示差异不显著(p＞0.05)，不同小写字母或无上标表示差异显著(p＜0.05)，下表同。

2.3不同标记试剂浓度浸泡24h对拉萨裸裂尻鱼幼鱼养殖3月生长和死亡率的影响

不同标记试剂浓度浸泡24h对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长影响表3-4。各标记试剂浓度浸泡组在不同时间节点体重和全长差异不显著(p＞0.05)，说明标记试剂不同浓度浸泡对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长没有影响。各标记试剂浓度浸泡组在不同时间节点死亡率差异不显著(p ＞0.05)，说明标记试剂不同浓度浸泡对拉萨裸裂尻鱼幼鱼存活没有影响(表5)。

表3 不同标记试剂浓度浸泡24h对拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点体重(g)

表4 不同标记试剂浓度浸泡24h对拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点全长(cm)

表5 不同标记试剂浓度浸泡24h对拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点死亡率(％)

2.4 200mg/L标记试剂浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同时间标记效果

200mg/L标记试剂浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同时间标记效果见表6。200mg/L标记试剂浓度下，设置12、24、36、48、60、72、84、 96h 8个浸泡时间梯度浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼，12-84h组死亡率均较低，且差异不显著(p＞0.05)，显著低于96h组(p＜0.05)；96h组死亡率最高，显著高于其余实验组(p＜0.05)。12h组拉萨裸裂尻鱼幼鱼耳石；24h组耳石标记效果明显；36-96h组标记效果显著。

表6 200mg/L标记试剂浸泡拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同时间标记效果

2.5 200mg/L标记试剂浸泡不同时间对拉萨裸裂尻鱼幼鱼养殖3月生长和存活的影响

200mg/L标记试剂浓度下不同浸泡时间对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长影响表7-8。各浸泡实践组在不同时间节点体重和全长差异不显著(p＞0.05)，说明标记试剂不同时间浸泡对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长没有影响(表9)。各浸泡实践组在不同时间节点死亡率差异不显著(p ＞0.05)；标记试剂不同时间浸泡对拉萨裸裂尻鱼幼鱼存活没有影响(表9)。

表7 200mg/L标记试剂浓度下不同浸泡时间下拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点体重(g)

表8 200mg/L标记试剂浓度下不同浸泡时间下拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点全长(cm)

表9 200mg/L标记试剂浓度下不同浸泡时间下拉萨裸裂尻鱼幼鱼不同养殖时间节点死亡率(％)

2.6标记试剂对拉萨裸裂尻鱼幼鱼耳石染色的有效保存时间

不同标记试剂浓度浸泡24h耳石染色有效保存时间见表10。 1-100mg/L标记试剂浓度组，各采样时间拉萨裸裂尻鱼幼鱼耳石均无染色；150mg/L标记试剂浓度组在开始养殖耳石标记可见，养殖1月及之后无染色；200mg/L标记试剂浓度组在开始养殖标记明显，养殖1月和养殖2月耳石染色可见，养殖4月无染色效果。200-300mg/L 标记试剂浓度组在开始养殖和养殖1月耳石标记显著，养殖2月标记明显，养殖4月标记可见。200mg/L标记试剂浸泡不同时间耳石染色有效保存时间见表11。12h浸泡组，各采样时间拉萨裸裂尻鱼幼鱼耳石均无染色；24h浸泡组在开始养殖标记明显，养殖1月和养殖2月耳石染色可见，养殖4月无染色效果。36h浸泡组开始养殖耳石标记显著，养殖1月和2月耳石标记明显，养殖4月耳石标记可见；48-96h 浸泡组在开始养殖、养殖1月和2月，耳石标记显著，养殖4月耳石标记明显。

表10 不同标记试剂浓度浸泡24h耳石染色有效保存时间

表11 200mg/L标记试剂浸泡不同时间耳石染色有效保存时间

对比选择性试验

同样采用200mg/L标记试剂浓度和同样的浸泡方法对嘉陵江裸裂尻鱼和黄河裸裂尻鱼进行标记，并记录耳石标记效果，结果见表12和13。

表12 200mg/L标记试剂浸泡嘉陵江裸裂尻鱼耳石染色有效保存时间

表13 200mg/L标记试剂浸泡嘉陵江裸裂尻鱼耳石染色有效保存时间

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种拉萨裸裂尻鱼的标记试剂，其特征在于：包括荧光标记混合物和仙人掌提取液，所述荧光标记混合物包括荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3，所述荧光标记混合物中荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K3的质量比为1：(5-10)：(1-3)，所述仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加(30-100)mL。

2.根据权利要求1所述的拉萨裸裂尻鱼的标记试剂，其特征在于：所述荧光标记混合物中荧光标记物、正丁基苯并异噻唑酮、维生素K的质量比为1：5：1，所述仙人掌提取液的添加量为每克荧光标记混合物添加100mL。

3.根据权利要求1所述的拉萨裸裂尻鱼的标记试剂，其特征在于：所述荧光标记物为茜素红-S。

4.根据权利要求1所述的拉萨裸裂尻鱼的标记试剂，其特征在于：所述仙人掌提取液的制备工艺为：

将鲜仙人掌用去离子水冲洗，鲜仙人掌与水的质量比为1：10混合后超声提取，提取温度为50-80℃，提取时间为60-150分钟；提取频率60-80KHz，超声输出功率50-100W；冷却后过滤后3000-5000r/min离心取上清液即得。

5.权利要求1-4任一所述的标记试剂对拉萨裸裂尻鱼进行的标记方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)准备体长为(2.01±0.13)cm，体重为(0.0392±0.0096)g的待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼若干，提前24h停止喂食；

(2)将待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼放入暂养容器中暂养0.5-1h，暂养过程中向水体增氧，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5；

(2)将标记试剂碾成细粉，用过滤后的养殖用水，经仔细搅拌，全部溶解，制成2000mg/L(以荧光标记物计)的母液待用；

(3)根据待标记拉萨裸裂尻鱼幼鱼数量准备大小合适的浸染容器若干；

(6)浸染容器中加入过滤后养殖用水，以母液配成100-300mg/L(以荧光标记物计)的浸染标记液；

(7)将拉萨裸裂尻鱼幼鱼以0.5尾/L的密度放入浸染标记液中，遮光环境浸染，每天投喂两次，浸染过程中水交换量为0.5h/次，水温12-13℃，溶解氧≥6mg/L，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，pH8.5；

(8)浸染结束后，使用清洁水拉萨裸裂尻鱼幼鱼周身染液。

6.根据权利要求5所述的标记试剂对拉萨裸裂尻鱼进行的标记方法，其特征在于：所述浸染标记液的浓度为250-300mg/L(以荧光标记物计)，浸泡时间为24h。

7.根据权利要求5所述的标记试剂对拉萨裸裂尻鱼进行的标记方法，其特征在于：其特征在于：所述浸染标记液的浓度为200mg/L(以荧光标记物计)，浸泡时间为48-84h。

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