CN111165417A - 一种鲻鱼幼鱼染色剂、染色方法及茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鲻鱼幼鱼染色剂、染色方法及茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用，属于增殖放流跟踪监测技术领域。茜素红溶解度高、标记效果好；浸染后的鲻鱼幼鱼，在鳞片、鳍棘上均获得良好标记，全样品荧光检测的总标记率达到100％；经40d暂养试验，标记保持率为100％，标记保持效果良好。另外，采用茜素红对鲻鱼幼鱼进行染色标记，操作简单，能获得高质量的标记效果，并且能够保证标记过程中的鲻鱼幼鱼成活率。
Description
技术领域
本发明涉及增殖放流跟踪监测技术领域，尤其涉及一种鲻鱼幼鱼染色剂、染色方法及茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用。
背景技术
鲻鱼(Mugil cephalus)隶属鲻形目，鲻科，鲻属，是我国东南沿海常见广温、广盐性鱼类，可在淡水、咸淡水和咸水中生活，喜欢栖息在沿海近岸、海湾和江河入海口处，生长迅速、体大肉厚、味道鲜美，是我国南方沿海咸淡水养殖主要经济鱼类之一，也是历来渔业生产中的重要种类。
增殖放流是国内外公认的养护水生生物资源较为直接、有效的手段之一，其在促进渔业种群资源恢复、改善水域生态环境、促进濒危物种与生物多样性保护、促进渔民增收与渔业增效方面有着较好成效。标志/标记技术作为增殖放流效果评价的重要基础技术手段，也是提高评价增殖放流效果评价准确性、促进增殖放流工作进步的关键技术。
外部标志(各种类型的标志牌)与外部标记(鳍条切除、烙印)等传统的标志/标记技术对标志对象的损伤较大，死亡率高，并且挂牌标志存在脱标问题，而剪除鳍条则可能会由于标志鱼较强的恢复能力再生后难以辨识。微型线码标志、被动式雷达整合标志、植入式荧光标志等内部标志，对标志对象影响较小、适用范围广、群体区分度高，但设备昂贵。荧光浸染标记作为一种潜在有效且成本低廉的标记方法，其利用荧光染料在标记对象硬骨组织上形成标记效果明显，已在黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)、褐牙鲆 (Paralichthysolivaceus)、中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)、金乌贼(Sepia esculenta)等多种放流种类的标记技术中得以试验成功。
对于标记材料与标记方法的选择，通常需要从其标记效率、安全性、标记效果保持率等多方面进行比较筛选，同时还应综合考虑操作的普及性和标记成本等因素。
由于不同标记对象的对染料的敏感程度不同，浸染标记的方法、染料的种类与浓度选择也不尽相同。目前国内外尚无对鲻鱼进行荧光浸染标记的专利报告。因此，急需提供一种适宜于放流种类鲻鱼的荧光浸染标记材料和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲻鱼幼鱼染色剂、染色方法及茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用，茜素红用于鲻鱼幼鱼染色标记能达到良好的标记效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了如式I所示茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用；
本发明提供了一种鲻鱼幼鱼的染色剂，所述染色剂包括茜素红水溶液和海盐水溶液；所述茜素红水溶液中茜素红的质量浓度为150～450mg/L；所述海盐水溶液中海盐的质量百分含量为30％～40％；所述茜素红水溶液和海盐水溶液独立分装。
优选的，所述茜素红水溶液的pH值为7.0～8.0。
本发明提供了一种基于上述方案所述染色剂的鲻鱼幼鱼的染色方法，包括以下步骤：
1)染色前10～15d开始，逐步降低鲻鱼幼鱼养殖水的盐度至盐度为0，每天盐度下降的质量分数为2‰～3‰；
2)鲻鱼幼鱼停食1天后将鲻鱼幼鱼以4～6尾/L的密度放入海盐水溶液中浸泡8～12min；
3)在海盐水溶液中浸泡后，将浸泡后的鲻鱼幼鱼以3.5～4尾/L的密度放入茜素红水溶液中浸染10～14h，得到标记鲻鱼幼鱼。
优选的，所述染色方法还包括染色前10～15d开始，投喂鲻鱼幼鱼饲料，每天投喂的次数为2次，每次饲料的投喂量占鲻鱼幼鱼体重的质量分数为 3％～5％。
优选的，所述鲻鱼幼鱼的初始体长为2～4cm。
优选的，步骤2)中所述浸泡过程中保持海盐水溶液中溶氧量>5.00 mg/L。
优选的，步骤3)中所述浸染过程中保持茜素红水溶液中溶氧量>5.00 mg/L。
优选的，在步骤3)浸染后，还包括将标记鲻鱼幼鱼放入水中1～3h。
本发明的有益效果：本发明提供了茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用。茜素红溶解度高、标记效果好；浸染后的鲻鱼幼鱼，在鳞片、鳍棘上均获得良好标记，全样品荧光检测的总标记率达到100％；经40d暂养试验，标记保持率为100％，标记保持效果良好。另外，采用茜素红对鲻鱼幼鱼进行染色标记，操作简单，能获得高质量的标记效果，并且能够保证标记过程中的鲻鱼幼鱼成活率。
附图说明
图1为鲻鱼幼鱼经ARS荧光染料标记后并养殖0～40d的体长测定结果；
图2为鲻鱼幼鱼经ARS荧光染料标记后并养殖0～40d的体重测定结果；
图3为ARS染色鲻鱼幼鱼不同染料浓度鳍条、鳍棘、鳞片和耳石的标记效果；
图4为鲻鱼鳞片荧光标志效果观察图；
图5为鳍棘荧光标志效果观察图；
图6为鳍条荧光标志效果观察图。
具体实施方式
本发明提供了如式I所示茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用；所述应用过程中，茜素红作为荧光标记染料使用；所述茜素红(ARS)为橙黄色或黄棕色粉末，易溶于水，分子式为：C14H7NaO7S·H2O；茜素红溶解度高、标记效果好；
本发明提供了一种鲻鱼幼鱼的染色剂，所述染色剂包括独立分装的茜素红水溶液和海盐水溶液；所述茜素红水溶液中茜素红的质量浓度为150～450 mg/L，优选为200～400mg/L，更优选为250～350mg/L；所述海盐水溶液中海盐的质量百分含量为30％～40％，优选为35％，35％的盐度在保证渗透诱导效果的同时，不会给标志对象带来额外的应激伤害，从而避免因此产生的安全风险；所述茜素红水溶液和海盐水溶液独立分装。本发明中，所述茜素红水溶液的pH值优选为7.0～8.0，更优选为7.5～7.8，上述pH值范围适宜于鲻鱼幼鱼生存。
本发明具体实施过程中，所述茜素红水溶液优选的由茜素红母液稀释获得；所述茜素红母液包括水和茜素红；所述茜素红母液中茜素红的质量浓度优选为1800～2200mg/L，更优选为2000mg/L；所述茜素红母液的pH值优选为7.0～8.0，更优选为7.5～7.8；用于调节茜素红母液pH值的试剂优选为碳酸氢钠；本发明对所述茜素红母液中的水没有特殊限制，采用鲻鱼幼鱼的养殖水或淡水或蒸馏水均可；所述稀释过程中，是通过在茜素红母液中添加水实现。
本发明提供了一种基于上述方案所述染色剂的鲻鱼幼鱼的染色方法，包括以下步骤：
1)染色前10～15d开始，逐步降低鲻鱼幼鱼养殖水的盐度至盐度为0，每天盐度下降的质量分数为2‰～3‰；
2)鲻鱼幼鱼停食1天后将鲻鱼幼鱼以4～6尾/L的密度放入海盐水溶液中浸泡8～12min；
3)在海盐水溶液中浸泡后，将浸泡后的鲻鱼幼鱼以3.5～4尾/L的密度放入茜素红水溶液中浸染10～14h，得到标记鲻鱼幼鱼。
本发明首先在染色前10～15d开始，逐步降低鲻鱼幼鱼养殖水的盐度至盐度为0，每天盐度下降的质量分数为2‰～3‰，优选为2.5‰；优选的还包括染色前10～15d开始，投喂鲻鱼幼鱼饲料，投喂的次数为1天两次，优选为早晚各一次，每次饲料的投喂量占鲻鱼幼鱼体重的质量分数为3％～5％；所述鲻鱼幼鱼在处理前的体长(初始体长)优选为2～4cm，更优选为3cm。
本发明对鲻鱼幼鱼停食，停食1天后将鲻鱼幼鱼以4～6尾/L的密度放入海盐水溶液中浸泡8～12min，优选为10min，停食的作用是减少应激与代谢，从而避免因此而产生的鱼类死亡；所述浸泡过程中保持海盐水溶液中溶氧量优选的>5.00mg/L；所述鲻鱼幼鱼的密度优选为5尾/L。
本发明将鲻鱼幼鱼浸泡于海盐水溶液中，作用是在浸染标记操作前进行渗透诱导，通过在短时间内高强度的改变鲻鱼幼鱼所处水体盐度的方式，使标记对象表层细胞迅速脱水，而后实施浸染，能够加强鲻鱼幼鱼对染料的吸收，从而增强标记效果。
在海盐水溶液中浸泡后，将浸泡后的鲻鱼幼鱼以3.5～4尾/L的密度放入茜素红水溶液中浸染10～14h，优选为12h，得到标记鲻鱼幼鱼；所述浸染过程中保持茜素红水溶液中溶氧量优选的>5.00mg/L；所述鲻鱼幼鱼的密度优选为3.7尾/L。
浸染后，本发明优选的还包括将标记鲻鱼幼鱼放入水中1～3h，优选为2 h，以除去残余染料(茜素红)。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供的试验用鲻鱼实验鱼初始体长3.08±0.07cm，暂养在500L 的养殖桶10d，暂养密度为1.4尾/L。整个实验过程在车间进行，海水取自外海，通过砂滤池粗滤后进入车间；淡水取自山泉水，通过网袋过滤后进入车间，以去除水中较大的颗粒杂质。共500尾鲻鱼幼鱼(0.2尾/L)转入育苗车间5m3的方形养殖池中(250×250cm，水深80cm)暂养10d。暂养期间，投喂颗粒商品饵料，每天投喂两次至饱食。
暂养期初期，盐度15.0±2.0‰，每日不断冲入淡水降低养殖池盐度，每日下降盐以2‰～3‰，直至全部替换为淡水。养殖过程中水温21.7～23.2℃，溶氧5.16～5.42mg/L，pH7.5～8.3，光照周期14L/10D，养殖期间每日换水，换水量50％。
将茜素红用过滤后的养殖用水(淡水)，溶解制成2000mg/L的母液待用；在母液制备过程中，通过添加碳酸氢钠(分子式：NaHCO3)调节溶液 pH值，使其保持在6.5～8.0。
母液遮光曝气12h，再次使用碳酸氢钠调节溶液pH，最终使得溶液pH 值稳定在7.5～7.8。
浸染容器A使用容量30L的暂养桶，加入由清洁养殖用水与海盐配备而成的35‰盐溶液22L；随机放入110尾已停食一天的鲻鱼幼鱼，浸泡10 min，进行渗透诱导，期间保持充气状态。
浸染容器B使用容量60L的暂养桶，加入过滤后养殖用水，以母液配成150mg/L的浸染标记液30L，将pH调节至7.6，自然水温(23±2.3℃)。每个浸染桶随机放入110尾鲻鱼幼鱼，利用气泵连续充气，浸染时间12h。
浸染结束后，将标记鱼放入新鲜养殖用水2h以除去残余染料，完成标记操作。
实施例2
本实施例提供的鲻鱼幼鱼暂养、渗透诱导与茜素红染液母液制作见所述实施例1。
浸染容器B使用容量60L的暂养桶，加入过滤后养殖用水，以母液配成300mg/L的浸染标记液30L，将pH调节至7.6，自然水温(23±2.3℃)。每个浸染桶随机放入110尾鲻鱼幼鱼，利用气泵连续充气，浸染时间12h。
实施例3
本实施例提供的鲻鱼幼鱼暂养、渗透诱导与茜素红染液母液制作见所述实施例1。
浸染容器B使用容量60L的暂养桶，加入过滤后养殖用水，以母液配成450mg/L的浸染标记液30L，将pH调节至7.6，自然水温(23±2.3℃)。每个浸染桶随机放入110尾鲻鱼幼鱼，利用气泵连续充气，浸染时间12h。
对比例1
本实施例提供的鲻鱼幼鱼暂养、渗透诱导见所述实施例1。
浸染容器B使用容量60L的暂养桶，加入过滤后养殖用水30L，将pH 调节至7.6，自然水温(23±2.3℃)。每个浸染桶随机放入110尾鲻鱼幼鱼，利用气泵连续充气，浸染时间12h。
浸染试验结束后，取上述3例(实施例1～3)标记试验鲻鱼幼鱼对照同批次(对比例1)鲻鱼幼鱼，开展生长试验。从每组不同浓度、规格、染料浸染标记过的幼鱼(110尾)中随机挑选90尾的养殖实验用。每个浓度梯度组设三个平行处理(n＝30)，并分别于三个网箱(140×70×120cm；其中网箱内水深为80cm，实验鱼密度为0.038尾/L)。整个养殖实验过程中连续充气，养殖过程中水温21.7～23.2℃，溶氧5.16～5.42mg/L，pH7.5～8.3，光照周期 14L/10D)，养殖期间每日换水率占养殖水体的25％。
测量全部实验鲻鱼幼鱼全长和体重，数据分别精确到0.1mm和0.1g，养殖实验持续40d。并在养殖第20d、40d，测定各组实验鱼的体长和体重。
生长实验养殖结束后，每个平行处理取10尾(每个染色浓度共30尾) 解剖取出矢耳石、鳞片(每尾背部、腹部、尾部各取5片，共15片鳞片)、各鳍鳍棘及鳍条。所取样本清洗干净后遮光保存。1个月之内完成检测分析。
荧光显微镜(Olympus BX51)装配数码照相机(Olympus DP70)，观察荧光标记。标记质量评价分级量化，分级标准参照下表(表1)。观察全部样品的荧光标记，记录评价荧光标记染色质量。样品由两位试验人员单独标记质量评价记录，如果有偏差则由第三位试验人员确定。该试验中，如果标记质量≥2，认为标记质量良好。
表1标记清晰度等级及划分标准
统计分析：使用SPSS、Excel处理相关数据，单因素方差分析显著性差异水平，数据用“平均数±标准差”表示。
鲻鱼幼鱼经ARS荧光染料标记后并养殖0～40d的体长测定结果参见图1；鲻鱼幼鱼经ARS荧光染料标记后并养殖0～40d的体重测定结果参见图2。由图1和图2可以看出，实施例1～3与对照组(对比例1)相比，鲻鱼幼鱼在0、20、40d养殖过程中体长、体重无显著差异(p>0.05)。
ARS染色鲻鱼幼鱼不同染料浓度鳍条、鳍棘、鳞片和耳石的标记效果参见图3；鲻鱼鳞片荧光标志效果观察图参见图4；鳍棘荧光标志效果观察图参见图5；鳍条荧光标志效果观察图参见图6。
比较实施例1～3的标记质量，300mg/L浓度组与450mg/L浓度组(标记质量较好)，与150mg/L浓度组存在极显著差异(p<0.01)，300mg/L浓度组与450mg/L浓度组间无显著性差异(p>0.05)。标记效果整体鳍棘>鳍条> 鳞片>耳石，当ARS浓度达300mg/L及以上水平时，鳞片、鳍条、鳍棘荧光染色标记可达肉眼可见水平，耳石染色效果在三个处理组条件下标记质量均≤3。
由上述内容可知，使用本发明公开的标记染料和标记方法，40d后鲻鱼幼鱼体长、体重与对照组无显著性差异(p>0.05)。ARS浸染标记鲻鱼幼鱼能取得较好的效果，是鲻鱼荧光标记的良好选择对象，其中ARS在鳍棘形成自然光下肉眼看见标记为野外条件下的直接观测提供了便利，可大幅提高检测效率。以浸染浓度最低、效果最佳、规避浸染风险为原则，综合以上，推荐荧光标记染料ARS 350mg/L为标记浓度为最适宜标记条件。同时该标记所用的原料来源稳定，容易获得，标记简单、方便，成功率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.如式I所示茜素红在鲻鱼幼鱼染色标记中的应用；
2.一种鲻鱼幼鱼的染色剂，所述染色剂包括茜素红水溶液和海盐水溶液；所述茜素红水溶液中茜素红的质量浓度为150～450mg/L；所述海盐水溶液中海盐的质量百分含量为30％～40％；所述茜素红水溶液和海盐水溶液独立分装。
3.根据权利要求2所述染色剂，其特征在于，所述茜素红水溶液的pH值为7.0～8.0。
4.一种基于权利要求2或3所述染色剂的鲻鱼幼鱼染色方法，包括以下步骤：
1)染色前10～15d开始，逐步降低鲻鱼幼鱼养殖水的盐度至盐度为0，每天盐度下降的质量分数为2‰～3‰；
2)鲻鱼幼鱼停食1天后将鲻鱼幼鱼以4～6尾/L的密度放入海盐水溶液中浸泡8～12min；
3)在海盐水溶液中浸泡后，将浸泡后的鲻鱼幼鱼以3.5～4尾/L的密度放入茜素红水溶液中浸染10～14h，得到标记鲻鱼幼鱼。
5.根据权利要求4所述的染色方法，其特征在于，所述染色方法还包括染色前10～15d开始，投喂鲻鱼幼鱼饲料，每天投喂的次数为2次，每次饲料的投喂量占鲻鱼幼鱼体重的质量分数为3％～5％。
6.根据权利要求4或5所述的染色方法，其特征在于，所述鲻鱼幼鱼的初始体长为2～4cm。
7.根据权利要求4所述的染色方法，其特征在于，步骤2)中所述浸泡过程中保持海盐水溶液中溶氧量>5.00mg/L。
8.根据权利要求4所述的染色方法，其特征在于，步骤3)中所述浸染过程中保持茜素红水溶液中溶氧量>5.00mg/L。
9.根据权利要求4所述的染色方法，其特征在于，在步骤3)浸染后，还包括将标记鲻鱼幼鱼放入水中1～3h。
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