CN112841222B - 一种抗菌杀毒材料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗菌材料领域，具体涉及一种抗菌杀毒材料及应用。具体技术方案为：以纳米碳基材料为载体，固定纳米级金属后制成；主要由纳米钻石和纳米银复合而成。本发明提供的材料克服了普通纳米银在盐水溶液中易聚集、易流失的缺陷，可稳定持久地在盐水溶液中保持悬浮状态，并具有优异的抗菌抗病毒能力。本发明还将该材料应用到医疗设备上，例如应用到口罩上。将该材料应用到口罩上后，口罩除本身具有的物理防护外，还增加了纳米材料做防护，可长效抗菌抗病毒，且避免了废弃口罩可能带来的感染风险；从而提供了无细胞毒性、具有持久抗菌抗病毒能力的口罩。

Description

一种抗菌杀毒材料及应用
技术领域
本发明属于抗菌材料领域，具体涉及一种抗菌杀毒材料及应用。
背景技术
高效、安全、持久的抗菌杀毒材料成为必需品。常用的抗菌杀毒材料主要包括酒精和84消毒液，但均存在一定的缺陷。酒精需浓度达75％才具有良好的抑菌效果，对酒精需求量大，且闪点低、易燃易爆，存在较大的安全隐患。而且目前有一些研究表明，使用酒精消毒口罩等常用卫生用品，容易降低口罩的使用寿命和效果。84消毒液中的有效成分主要为次氯酸钠，具有一定的腐蚀性和漂白作用，无法直接用于人体消毒，也无法用于口罩等直接与人体呼吸系统接触的卫生用品的消毒；同时，84消毒液如果与普通的家用洗涤剂或其它消毒液混合，极易加大空气中氯气浓度，从而引发氯气中毒。因此，84消毒液的使用受限，并存在较大的安全隐患。
与上述常用抗菌杀毒材料相比，银离子抗菌剂具有巨大优势。目前研究发现，银离子抗菌抗病毒可能的原理包括：干扰细胞壁的合成、损伤细胞壁、抑制蛋白质合成、干扰核酸合成等。银离子抗菌剂具有杀菌能力强、人体毒性低等优势。与普通银相比，纳米银释放银离子的效率更高，因此，使用纳米银制备的抑菌材料应用日益广泛。但纳米银的使用寿命有限，这使得其使用成本相对较高。这是因为：(1)如果将纳米银应用到口罩等呼吸系统相关的卫生用品上，会接触到人体呼出的水汽，水汽中含有一定的盐分，为含盐溶液。纳米银在水中、尤其是含盐的水溶液中，非常容易发生聚集，导致抗菌能力减弱甚至丧失。同时，银离子聚集后，局部浓度较高，可能对人体带来健康隐患。(2)在使用过程中，纳米银的附着能力逐渐降低，非常容易流失，导致抗菌能力丧失。
因此，提供一种抗菌抗病毒能力强、在盐溶液中稳定、在附着物上不易流失的纳米银材料，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌杀毒材料及应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗菌抗病毒材料，以纳米碳基材料为载体，固定纳米级金属后制成。
优选的，所述纳米碳基材料为等轴晶系材料。
优选的，所述等轴晶系材料为纳米钻石。
优选的，所述纳米级金属为纳米银。
相应的，所述抗菌抗病毒材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)在300～600℃下，将纳米碳基材料置于空气中氧化；
(2)在80～100℃下，将经步骤(1)处理的纳米碳基材料在浓酸中酸洗；
(3)将纳米碳基材料与纳米级金属混合。
优选的，步骤(2)所述浓酸为硫酸与硝酸按体积比为3:1混合而成的混合溶液。
优选的，步骤(3)后，继续进行如下步骤：
(4)所述抗菌抗病毒材料表面包覆牛血清白蛋白。
相应的，一种纳米银材料，将纳米银固定在纳米钻石上制成。
相应的，利用所述抗菌抗病毒材料制备的医疗用品或美容用设备/仪器。
优选的，所述医疗用品为口罩，所述口罩至少包括3层，所述口罩的中间层涂覆所述抗菌抗病毒材料。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的纳米级材料，主要由纳米钻石和纳米银复合而成。该材料克服了普通纳米银在盐水溶液中易聚集、易流失的缺陷，可稳定持久地在盐水溶液中保持悬浮状态，并具有优异的抗菌抗病毒能力。所述纳米级材料可广泛应用于民生用品(例如：口罩、滤网、纱线、抗菌喷剂等)、钢材、皮革制品和家具，还可用于医疗器械、美容领域(例如：辅料、面膜等)。具体的，本发明将该材料应用到口罩上。增加抗菌抗病毒材料后的口罩，除其本身所具有的物理防护外，还增加了纳米材料做防护，可长效抗菌抗病毒，且避免了废弃口罩可能带来的感染风险；从而提供了一种无细胞毒性、具有持久抗菌抗病毒能力的口罩。
附图说明
图1为在不同溶剂中，银钻溶液保持悬浮状态的时间示意图；
图2为达到相同抑菌效果时，银钻溶液与纯纳米银溶液分别所需用量示意图；
图3为使用相同用量时，银钻溶液与纯纳米银溶液在不同时间下的抑菌效果示意图；
图4为不同组分的银钻溶液抑制病毒活性效果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种抗菌杀毒材料(复合物)。所述抗菌杀毒材料以纳米碳基材料为载体，固定1～1000ppm、具有抗菌效果的纳米级金属后制备而成。
所述纳米碳基材料优选为等轴晶系(isometric system)，更优选为纳米钻石(又名纳米金刚石)。
所述纳米级金属对于细菌或病毒具有良好的抑制甚至杀灭作用。例如为：纳米银、纳米铜、纳米锌。优选为纳米银。纳米银指银的纳米级微粒(nanoscale particles)，具有释放出银离子的能力，从而具有抗菌杀毒作用。以纳米银释放的银离子水溶液为例，经多倍稀释后，依然对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、白色念珠菌、头发癣菌等在内的多种致病菌具有99.99％以上的抑制效果。活性银离子的抑菌机理可能为：其可吸引细菌体内的酶蛋白内的硫氢基，并与之结合，使酶蛋白失活，从而导致细菌死亡。同时，活性银离子还可从死亡的细菌中自动游离出来，对其它活菌进行相同的杀菌活动。因此，银离子是一种长效型抗菌剂。
所述纳米级金属通过静电作用或共价键结合以固定到纳米碳基材料上，形成复合物。
所述复合物的尺寸(直径)在100nm～1000nm之间。目的在于：复合物足够大，不会穿透人体细胞膜结构(其厚度通常为10nm～100nm)，无细胞毒性。同时，复合物足够小，可与大肠杆菌等常见致病菌(其直径通常为1μm～2μm)紧密结合以实现杀菌的效果；且大多数病毒的直径为10nm～300nm，部分丝状病毒的直径长达1400nm；同时，复合物可释放银离子；故本发明提供的复合物对大部分病毒也有杀灭效果。
本发明还提供了所述抗菌杀毒材料的制备方法。以纳米钻石和纳米银为例(制备的复合物以下简称“银钻”)；具体包括如下步骤：
(1)将纳米钻石置于高温炉或高温烘箱，温度范围为300℃～600℃，优选400～500℃下，置于空气/氧气中氧化，氧气浓度为10％～100％，进行氧化反应，以去除原有的表面石墨形式结构。
(2)在80～100℃下，将经步骤(1)处理的纳米钻石在浓酸中进行酸洗，以去除纳米钻石表面的金属成分，同时使表面羧基化，以共轭聚L-精氨酸。所述浓酸优选为硫酸与硝酸按质量比或体积比为3:1混合而成的混合溶液，优选为按体积比3:1进行混合。硝酸浓度范围10N～16N，硫酸范围10N～18N。酸洗完成后,利用离心方式将纳米钻石沉降下来,离心转速单位范围为1000g～40000g。去除上层酸性溶液后，再以中性的纯水清洗去除表面残留的酸液。重复离心与中性水清洗的动作，直到pH值为6～8之间。
(3)将纳米钻石放到塑料或玻璃容器中,并加入溶剂,溶剂可为水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、常见的生物培养基DMEM、MEM、RPMI等。以一般生物震荡器、超音波震荡器进行震荡，震荡时间范围为1分钟至2小时，控制温度范围在4℃～50℃间，最后纳米钻石溶液浓度为10ppm～5％，获得纳米钻石悬浮液。将纳米钻石悬浮液与纳米银悬浮液混合，通过静电作用形成银钻。纳米钻石与纳米银质量比范围为1：1～1：1000。
(4)步骤(3)制备的银钻本身已经具有优异的抗菌抗病毒能力。为了进一步提升银钻的抗菌能力，同时进一步提升银钻在水溶液中、尤其是在盐溶液中的悬浮性和稳定性，进一步降低银钻聚集的可能性，更优选的方式是，对银钻进行氧气泡氧化，并在表面包覆牛血清白蛋白，具体方法为：在步骤(3)制备获得的银钻溶液中，加入与银钻相同重量的牛血清白蛋白(BSA)，并将温度控制在4℃～37℃间，轻轻摇晃使银钻与牛血清白蛋白充分混合，混合时间为30分钟至4小时。晃荡的过程会产生氧气泡，同时实现氧气泡氧化和BSA包覆。混合完成后，再离心使银钻沉降,离心转速为5000g～40000g。去除上层多余的牛血清白蛋白溶液后，再以中性纯水浸泡清洗沉降的银钻，去除表面残留的牛血清白蛋白。此时的银钻表面吸附了一层牛血清白蛋白(BSA)，进一步提高银钻在各种溶剂中的分散能力。
(5)如果是用于环境或人体消毒，直接将步骤(3)或步骤(4)获得的银钻(水溶液)喷施到待消毒部位即可。
如果用于制备卫生用品(医疗用品等)，例如用于隐形眼镜、人工耳蜗、牙植入物、膀胱起搏器、人工关节、伤口辅料、心脏瓣膜、心脏起搏器、呼吸系统用具等的抑菌时，则将步骤(3)或步骤(4)制备获得的银钻(水溶液)喷洒于待抑菌物品上，或将待抑菌物品浸泡于银钻(水溶液)内，随后干燥即可。以银钻水溶液中银钻含量计，使用浓度为0.005ppm～500ppm，优选为0.005ppm～10ppm。
以制备抗菌口罩为例。直接将浓度为10ppm～0.1％的银钻(水溶液)喷施到口罩所需层上，或将所需层浸泡于银钻中，浸泡时间为1分钟至60分钟，随后再以空气干燥即可，空气温度控制在4～60℃间。抗菌口罩优选为4层，以接触空气侧为外侧，从外向内依次为：聚丙烯纤维层、不织布层、熔喷层、聚丙烯纤维层或亲肤纤维层；材料位于靠近空气侧的第二层(不织布层)。其中，聚丙烯纤维层为防水层，可将含有细菌、病毒等的小水珠隔绝在口罩外，起到过滤的作用；该层可阻隔直径≥10μm的物质。第二层上涂覆固定有所述复合物，具有高效、持久的抗菌抗病毒能力。第三层可阻隔直径＜2.5μm的细小悬浮微粒。第四层可选用与第一层相同材质的材料制备而成，也可选用柔软亲肤的纤维材料、经吸水处理后制备而成，以有效吸附人体呼吸吐出的水汽。
实验证明，按本发明方法制备的银钻，在水中、生理盐水中、人体呼出的水汽中，均可保持悬浮状态达11周以上，纳米银的杀菌效果也可维持1周以上。同时，血液相容性实验表明，将本发明制备的银钻静脉注射到小鼠中，未引发炎症或其它毒副反应，也不会引发过敏或产生耐药性。
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。
实施例一：银钻溶液效果保持时间展示
1、制备银钻：将纳米钻石置于高温炉或高温烘箱，温度为400℃～500℃，氧气浓度为20％，进行氧化反应，以去除原有的表面石墨形式结构。
随后，在90℃下，将纳米钻石在浓酸中进行酸洗，所述浓酸为硫酸与硝酸按体积比为3:1混合而成的混合溶液，硝酸浓度为15M，硫酸浓度为18M。酸洗完成后,离心将纳米钻石沉降,离心转速为20000g。去除上层酸性溶液后，再以中性的纯水清洗去除表面残留的酸液。重复离心与中性水清洗的动作，直到pH值为7。
再将纳米钻石放到塑料或玻璃容器中,分别溶于水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和DMEM中，在25℃下震荡半小时，分别获得浓度为50ppm的各纳米钻石悬浮液。将纳米钻石悬浮液与纳米银悬浮液混合，通过静电作用形成银钻。纳米钻石与纳米银质量比为1：10。
接着将上述制备获得的银钻溶液中，加入1/10银钻质量的牛血清白蛋白，在4℃下轻轻摇晃使银钻与牛血清白蛋白充分混合，摇晃混合30分钟。
将各组悬浮液静置，分别在不同时间点时测量悬浮液中银钻的粒径大小及抑菌效果(抑菌效果试验方法参照实施例三)，其测量结果如图1。结果显示即使在不同状况下仍均可保持悬浮状态达可保持悬浮状态达11周以上(图示只展示了4周)，纳米银的杀菌效果也可维持1周以上。同时使用其他条件相同，只是未包覆牛血清白蛋白的三种银钻溶液做对照，悬浮状态只能保持2～3天左右，随后即出现沉淀，纳米银的杀菌效果只能维持1天。
实施例二：银钻溶液的毒副作用
1、使用实施例一制备的银钻水溶液，依照ISO-10993生物兼容性的规范，进行如下试验：
(1)细胞毒性试验。使用HFW、A549与MCF-7细胞进行测试。将上述细胞各10000个分别置于96孔培养盘中，并在细胞培养液中加入银钻溶液，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，去除培养液，并以PBS清洗数次，再利用cell counting kit-8进行细胞活性的量测。结果显示：细胞与银钻共同培养后，仍然具有很好的细胞活性，表示银钻的细胞毒性极小或没有细胞毒性。
(2)皮肤刺激性试验。根据ISO 10993-10规范，选择体重＞2公斤，年龄为2～12月龄，雌性大白兔三只。试验前24小时，先将动物背上的毛去除4块，单块去除面积约10cm×15cm，两块为试验组，两块为对照组。实验组的部分，取2.5cm×2.5cm的无菌纱布吸附0.5mL银钻溶液贴附于区块中，对照组则是以生理盐水湿润纱布进行贴附。随后以透气胶带与弹性绷带进行固定。4小时后，将绷带与纱布移除并以蒸馏水清洗试验位置。试验后第1、24、48、72小时，再针对试验位置进行观察是否有异常皮肤反应，包括红斑、水肿、腐蚀等现象发生。结果显示：实验组和对照组结果相同，未出现明显的红斑、水肿、腐蚀等异常现象。
(3)皮肤过敏性试验血液相容性。根据ISO 10993-10规范，选择体重需介于300～500g，雌性天竺鼠15只(对照组5只，实验组10只)。实验前，将动物背部从颈部到肩胛骨处的毛剔除。有皮肤病等不正常状况的需排除在实验外。剃毛区约8cm2，并将区域分成六区块，左三区右三区，左边为实验组，右边为对应的对照组，从上到下依次形成三组。在测试当日，先准备由对照组溶液和测试物(银钻50ppm)所配制的3组溶液。组1：Freund’s completeadjuvant(弗氏完全佐剂)和0.9％生理盐水以体积1：1混合乳化(50％FCA)，组1的实验组和对照组溶液均为50％FCA。组2：实验组溶液为测试物，对照组溶液为0.9％生理食盐水。组3：实验组溶液为测试物与50％FCA按体积比1:1混合乳化后的溶液；对照组为；0.9％生理食盐水和50％FCA以体积1：1混合乳化后的溶液。
将组1、2、3的三种溶液由上到下分别注射0.1mL到左右对称处。7天后，注射位置以10％sodium dodecyl sulfate(十二烷基硫酸钠)按摩涂抹导入皮肤，作用24小时后，采用吸附各对照组溶液和实验组溶液的约8cm2贴片(纱布)盖住注射位置，包扎固定后作用48小时后移除。14天后，将动物腹侧部的毛剔除。采用含对照组溶液和实验组溶液的贴片(纱布)盖住此剔毛区，此贴片在24小时后移除。再针对试验位置进行观察是否有明显的改变与症状。
实验表明，将本发明制备的银钻静脉注射到小鼠中，未引发炎症或其它毒副反应，也不会引发过敏或产生耐药性。
结果显示，银钻具有良好的生物兼容性。
实施例三：银钻抑菌效果展示
按实施例一的方法，制备银钻水溶液。按质量比，所述银钻组成中，纳米钻石：纳米银＝1:10。并以纯纳米银溶液作为对照组，分别进行抗菌试验。
1、不同纳米材料浓度与细菌数目变化测试：分别将浓度为0(纯水)、50、250、500ppm的纳米银溶液和银钻溶液分别与大肠杆菌共培养18小时，大肠杆菌的活菌数为108CFE/mL。经过18小时培养后，将利用BacTiter-GloTM(Promega)微生物活性检测系统，依据对所存在的ATP的定量结果，确定培养物中细菌的数目。分别测试在不同浓度的银钻溶液和纯纳米银溶液的抑菌效果，每组设置3个重复；结果如图2所示。
如图2所示。同样将大肠杆菌抑制到活菌数约为7×105CFU/mL时，如果使用纯纳米银溶液，则需要浓度达250ppm；而使用本发明制备的银钻溶液，浓度仅需50ppm左右，用量仅为纯纳米银溶液的1/5。使用本发明提供的银钻溶液进行抑菌消毒，不仅可以减小用量、节约成本，而且有效降低了人体吸入银离子、出现不良反应的风险。
2、不同抑菌时间与细菌数目变化测试：将浓度为250ppm的纳米银溶液和银钻溶液分别与活菌数为108CFE/mL的大肠杆菌共同培养。同时设置对照组，对照组为不添加任何纳米材料的相同量的大肠杆菌。分别在不同时间点利用BacTiter-GloTM(Promega)微生物活性检测系统，依据对所存在的ATP的定量结果，确定在不同时间点下，存活的活菌数量。而这里所选取的时间点分别为1小时、5小时、3天、7天、14天、28天与60天。分别测试银钻溶液和纯纳米银溶液在相同浓度下，不同抑菌时间时的抑菌效果，每组设置3个重复；结果如图3所示。
如图3所示。加入纯纳米银溶液作用1h后，大肠杆菌活菌量由原本的1×108CFU/mL降低至1.5×106CFU/mL。加入银钻溶液作用1h后，大肠杆菌活菌量降低至1×104CFU/mL。本发明制备的银钻溶液抑菌效果明显，效果比纯纳米银溶液提升了2个数量级。
实施例四：不同组分的银钻抑制病毒活性效果展示
按实施例一的方法，制备3组银钻水溶液，每组设置三个重复。组1～3中，按质量比，纳米钻石与纳米银的比例分别为：1:2.5、1:5、1:10制备银钻水溶液。随后分别以喷施或浸泡的方式，将银钻水溶液分别附着于口罩专用布上(口罩专用布材质参照上述口罩第二层的材料)。银钻抑制病毒活性效果测试前18～24小时，将贴壁型的人肾上皮细胞293T以1×105个/孔铺到24孔板中。待口罩专用布干燥后，将含有慢病毒病毒量为1×106TU的DMEM培养基液体以十分之一的比例稀释于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)中，并均匀涂覆在各组口罩专用布上，分别静置1min或5min。1TU等同1个病毒颗粒，即于病毒量为1×106TU的病毒液中吸取10μL加入磷酸缓冲盐溶液中，总体积为100μL，并均匀涂覆在各组口罩专用布上。病毒液在口罩专用布上静置1min或5min后，将口罩专用布上的含病毒的液体吸起，将吸起的液体接种到含10％血清的DMEM完全培养皿中，培养皿中已预先培养有待感染的细胞(前述293T)，进行病毒培养，标记为“吸起组”。将已吸起病毒液体后的口罩专用布置于另一培养皿中(同样接种有相同的肾上皮细胞293T)，在相同条件下进行病毒培养，标记为“残留组”。将各培养皿分别放回37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养培养24h，检测各组病毒活性。所述病毒活性以受病毒感染的细胞所产生的冷光讯号作为标记进行表示，以未经银钻抑制的病毒液感染的细胞所产生的冷光讯号为100％，因应换算其余组别的冷光讯号为百分比。
结果如图4所示。质量比为1:10的组别，无论是以喷施或浸泡的方式进行，静置1min后，抑菌效果均达到80％以上(即病毒活性由100％降至20％)；静置5min后，抑菌效果高达95％甚至99％以上。

Claims (3)

1.一种抗菌抗病毒材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）在400～500℃下，将纳米钻石置于空气中氧化；
（2）在80～100℃下，将经步骤（1）处理的纳米钻石在浓酸中酸洗，同时使表面羧基化，以共轭聚L-精氨酸；
（3）将纳米钻石的悬浮液与纳米银悬浮液混合，获得银钻溶液；
（4）在步骤（3）制备获得的银钻溶液中，加入与银钻相同重量的牛血清白蛋白，并将温度控制在4℃～37℃间，轻轻摇晃使银钻与牛血清白蛋白充分混合，混合时间为30分钟至4小时。
2.根据权利要求1所述抗菌抗病毒材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述浓酸为硫酸与硝酸按质量比为3:1混合而成的混合溶液。
3.利用权利要求1或2所述抗菌抗病毒材料制备的医疗用品，其特征在于：所述医疗用品为口罩，所述口罩至少包括3层，所述口罩的中间层涂覆所述抗菌抗病毒材料。
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