CN112840025A - 用于将治疗性核酸递送到组织的材料方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于将治疗性核细胞(和成像剂)递送到组织的材料和方法。

Description

用于将治疗性核酸递送到组织的材料方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月8日提交的美国临时申请第62/668,463号的优先权的权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开提供了用于将治疗性核细胞(和成像剂)递送到组织的材料和方法。
政府支持声明
本发明是在由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所(National Institute ofDiabetes and Digestive and Kidney Diseases)(NIDDK)授予的授权号1UC4DK116241-01下由政府支持进行的。政府在本发明中享有某些权利。
以电子方式提交的材料通过引用并入
本申请含有作为本公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：53048A_Seqlisting.txt；大小：116,998字节，创建于:2019年5月8日)，所述申请通过引用以其整体并入。
背景技术
糖尿病是一组代谢病症，在所述糖尿病中存在由胰腺β细胞所产生的激素胰岛素不足引起的在延长的时间段内的高血糖水平。具体地，1型糖尿病是由β细胞的进行性自身免疫破坏引起的，而在2型糖尿病中，胰岛素所产生的量对于身体需要而言是不充足的。尽管多年来一直在争论β细胞缺失对2型糖尿病的贡献，但在最近十年中，很明显，β细胞的缺失也涉及2型糖尿病的病理生理学(Rojas等人,《糖尿病研究杂志(Journal of DiabetesResearch)》,第2018卷,文章ID 9601801,第19页，2018；Donath等人,《糖尿病(Diabetes)》2005年12月；54增刊2:S108-13)。尽管有此知识，但是迄今为止，尚无用于直接测量体内β细胞(β细胞质量)的数量或用于将治疗剂特异性地递送到这些重要细胞的可用方法。事实上，用于确定糖尿病进展的方法主要依赖于间接测量(即确定血液中的葡萄糖或c肽浓度)，并且无法区分是很多细胞产生了很少的胰岛素还是很少的细胞产生了大量的此激素。因此，这些方法无法测量患有糖尿病的患者的进行性β细胞缺失。对β细胞具有特异性的充分标记物的缺乏也使得不可能将治疗剂特异性地递送到β细胞以停止或逆转β细胞的缺失。
RNA适体已作为siRNA的有效递送媒剂出现在许多人类疾病的治疗中，因为其可通过受体介导的内化或通过网格蛋白介导的内吞作用积极增强治疗性货物的细胞内积聚(35-39，43-74)。使用适体将所关注的治疗性RNA递送到β细胞提供了优于使用病毒载体的优点，例如，所关注的基因的瞬时调节、免疫原性的缺乏和很大的安全性。迄今为止，腺病毒载体已被最多地用于体外将基因和siRNA有效递送到原代胰腺胰岛(79-84)。然而，在体内，除了使用病毒载体的技术难题之外，其固有的免疫原性以及与野生型病毒的可能重组引起了严重的担忧。的确，病毒载体可以诱导强烈的免疫反应以及继发并发症，所述继发并发症可以包含多重器官衰竭以及甚至死亡(85)。慢病毒载体的出现减轻了一些免疫原性担忧，但是慢病毒在转导完整人胰岛方面不如腺病毒有效(86，87)，因此目前的体外方案一直在优化中88。然而，基因组中的慢病毒整合仍引起了安全担忧、插入诱变和与野生型病毒重组的风险。
发明内容
在一方面，本公开提供了一种将一种或多种试剂递送到组织的方法，所述方法包括使所述组织与构建体接触，所述构件体包括对所述组织具有特异性的与所述试剂缀合的适体。在一些实施例中，所述组织来自器官，所述器官选自由胰腺、心脏、肺部、肾脏、胃部、皮肤和脑组成的组。在一些实施例中，所述组织为胰腺胰岛。在一些实施例中，所述试剂为治疗性核酸。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。在一些实施例中，所述试剂为成像剂。示例性成像剂包含但不限于荧光染料、如氟18、氧15、镓68等正电子发射断层扫描示踪剂、如钆、氧化铁、铂铁或锰等磁共振成像造影剂。所述接触步骤可以发生于体外或体内。
在另一方面，本公开提供了一种构建体，所述构建体包括与小活化RNA(saRNA)缀合的适体。在一些实施例中，所述适体对人胰腺胰岛具有特异性。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。
在一些实施例中，所述适体对簇集蛋白(CLU，基因id 1191)具有特异性。在一些实施例中，所述适体对“含跨膜emp24结构域的蛋白质6”(TMED6，基因id 146456)具有特异性。
在一些实施例中，所述组织为肾上腺组织或骨髓，并且所述适体为173-2273、107-901或m6-3239。在一些实施例中，所述组织为乳腺组织、肺部组织或淋巴结组织，并且所述适体为107-901和m6-3239。在一些实施例中，所述组织为脑小脑，并且所述适体为173-2273、107-901、m1-2623或m6-3239。在一些实施例中，所述组织为脑皮层组织、垂体组织、结肠组织、内皮组织、食管组织、心脏组织或肾脏组织，并且所述适体为107-901、m1-2623或m6-3239。在一些实施例中，所述组织为输卵管组织，并且所述适体为m6-3239。在一些实施例中，所述组织为肝脏组织，并且所述适体为166-279、107-901、m1-2623或m6-3239。在一些实施例中，所述组织为卵巢组织，并且所述适体为107-901。在一些实施例中，所述组织为胎盘组织，并且所述适体为166-270、173-2273、107-901、m1-2623或m6-3239。在一些实施例中，所述组织为前列腺组织，并且所述适体为173-2273或107-901。在一些实施例中，所述组织为脊髓组织，并且所述适体为166-279或173-2273。在一些实施例中，所述组织为睾丸组织，并且所述适体为166-279、173-2273、107-901、m1-2623、m6-3239和m12-3773。在一些实施例中，所述组织为胸腺组织，并且所述适体为173-2273、107-901或mf-2623。在一些实施例中，所述组织为甲状腺组织，并且所述适体为m1-2623。在一些实施例中，所述组织为输尿管组织，并且所述适体为107-901。在一些实施例中，所述组织为子宫颈组织，并且所述适体为166-279。在一些实施例中，所述组织为朗格尔汉斯(Langerhans)胰岛或胰腺组织，并且所述适体为166-279、173-2273、107-901、1-717、m1-2623、m6-3239或m12-3773。
在另一方面，本公开提供了一种将一种或多种试剂递送到胰腺胰岛的方法，所述方法包括使所述胰岛与构建体接触，所述构建体包括对胰岛具有特异性的与所述试剂缀合的适体。在一些实施例中，所述试剂为治疗性核酸。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。在一些实施例中，所述试剂为成像剂。示例性成像剂包含但不限于荧光染料、如氟18、氧15、镓68等正电子发射断层扫描示踪剂、如钆、氧化铁、铂铁或锰等磁共振成像造影剂。所述接触步骤可以发生于体外或体内。
在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。在一些实施例中，所述适体对簇集蛋白(CLU，基因id 1191)具有特异性。在一些实施例中，所述适体对“含跨膜emp24结构域的蛋白质6”(TMED6，基因id 146456)具有特异性。
在另一方面，本公开提供了一种测量β细胞质量的方法，所述方法包括以对于测量所述β细胞的质量有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与成像剂缀合的适体。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。在一些实施例中，所述成像剂为荧光染料。在一些实施例中，所述成像剂为PET示踪剂。在一些实施例中，所述成像剂为MRI造影剂。在一些实施例中，所述成像剂可以通过螯合剂与所述适体缀合。
在另一方面，本公开提供了一种调节β细胞的增殖的方法，所述方法包括以对于调节所述β细胞的增殖有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与治疗性核酸缀合的适体。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。所述接触步骤可以发生于体外或体内。
在另一方面，本公开提供了一种用于抑制β细胞凋亡的方法，所述方法包括以对于抑制所述β细胞的凋亡有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与治疗性核酸缀合的适体。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。在一些实施例中，所述治疗性RNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。所述接触步骤可以发生于体外或体内。
在另一方面，本公开提供了一种用于抑制有需要的受试者的组织移植物凋亡的方法，所述方法包括以对于抑制所述组织移植物的凋亡有效的量使所述组织移植物与构建体接触，所述构建体包括与治疗性核酸缀合的适体。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。在一些实施例中，所述治疗性RNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。所述接触步骤可以发生于体外或体内。在一些实施例中，所述组织移植物来自器官，所述器官选自由胰腺、心脏、肺部、肾脏、胃部和皮肤组成的组。在一些实施例中，所述适体为肌肉特异性适体，并且所述组织为心脏组织。
在一些实施例中，所述组织与在适体不存在的情况下上调蛋白质XIAP的治疗性RNA接触。例如，在另一方面，本公开提供了一种用于抑制有需要的受试者的组织移植物凋亡的方法，所述方法包括以对于抑制所述组织移植物的凋亡有效的量使所述组织移植物与治疗性RNA接触，所述治疗性RNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。所述接触步骤可以发生于体外或体内。在一些实施例中，所述组织移植物来自器官，所述器官选自由胰腺、心脏、肺部、肾脏、胃部和皮肤组成的组。
在另一方面，本公开提供了一种用于保护β细胞免受T细胞介导的所述β细胞的细胞毒性的影响的方法，所述方法包括以对于抑制T细胞介导的所述β细胞的细胞毒性有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与治疗性核酸缀合的适体。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。在一些实施例中，所述治疗性核酸能够增加免疫检查点。在一些实施例中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在一些实施例中，所述治疗性RNA选自由siRNA和saRNA组成的组。在一些实施例中，所述治疗性RNA上调蛋白质CD274(程序性死亡配体1，PDL1，基因id 29126)。所述接触步骤可以发生于体外或体内。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括以对于治疗所述受试者糖尿病有效的量向所述受试者施用构建体，所述构建体包括与小活化RNA(saRNA)缀合的适体。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。
在另一方面，对所述β细胞具有特异性的一种或多种适体可以组合使用，以增加所述治疗剂或成像剂的递送。在一些实施例中，所述适体选自由M12-3773和1-717组成的组。
还设想了一种包括SEQ ID NO:264或259中所示的核苷酸序列的适体。在一些实施例中，所述适体与saRNA缀合。在一些实施例中，所述saRNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。在一些实施例中，saRNA上调蛋白质CD274(程序性死亡配体1，PDL1，基因id29126)。
附图说明
图1是流程图，其示出了作为用于使用人胰岛和腺泡组织分离对人胰岛具有特异性的适体的无监督策略的HT簇SELEX。
图2是流程图，其示出了用于分离在小鼠与人之间交叉反应的胰岛特异性适体的HT-切换-簇SELEX。
图3示出了产生于用于分离在小鼠与人之间交叉反应的胰岛特异性适体的HT-切换-簇SELEX的图像。
图4示出了产生于标识识别人胰岛而非人腺泡组织的单克隆适体的HT-切换-簇SELEX的图像。
图5A和5B示出了适体1-717(图5A)和M12-3772(图5B)显示出了对人胰岛的非凡特异性。图5C是表，其示出了用各种所选适体染色的各种组织的结果。
图6示出了适体1-717和M12-3772识别小鼠胰岛和其它小鼠组织。
图7示出了适体1-717和M12-3773优先识别人β细胞。
图8示出了簇集蛋白是适体m12-3773的可能靶标。
图9示出了TMED6是适体1-717的推定靶标。
图10示出了适体1-717和m12-3773的混合物在体内比单独克隆更好地识别人胰岛。
图11示出了适体1-717和M12-3773允许在体内测量人β细胞质量。图11A是在实例2中执行的实验的示意图。图11B和11C示出了EFP区中的荧光信号与植入的胰岛的数量成正比，表明这些适体可以用于体内测量β细胞质量。图11D：向具有免疫能力的Balb/c小鼠皮下(分别在左侧和右侧)移植了同系(Balb/c)或同种异体(C57Bl/6)胰岛。通过静脉内注射AF750缀合的适体并且通过在5小时后执行IVIS来纵向监测排斥。数据显示，同种异体C57Bl6胰岛移植物的排斥可以随时间的推移进行测量，如左侧上的信号的缺失所看到的。相反，同系胰岛移植物的信号(右)随着时间的推移而保持，这表明移植物存活。
图12是用于通过胰岛特异性适体递送治疗性RNA的示意图适体嵌合体。
图13示出了胰岛特异性适体嵌合体允许通过胰岛特异性适体递送治疗性RNA。
图14示出了p57kip2-siRNA胰岛特异性适体嵌合体在体内诱导人β细胞增殖。
图15示出了对人“X连锁凋亡抑制物”(Xiap，基因ID：331)具有特异的小活化RNA(saRNA)的标识。
图16.Xiap-saRNA适体嵌合体保护人β细胞免受细胞因子诱导的凋亡的影响。
图17A示出了Xiap-saRNA/胰岛特异性适体嵌合体保护β细胞免受原发性无功能的影响。图17B是实例5中描述的实验的示意图。图17C：在添加了嵌合体的培养基中培养人胰岛，在移植第48小时、第24小时以及当天，在链脲佐菌素糖尿病NOG小鼠的左肾囊中向每只小鼠移植600IEQ。数据显示，用适体嵌合体预处理人胰岛大大地提高了胰岛移植的功效，到第2天大约80％的小鼠变为血糖正常的。相比之下，仅50％的od小鼠植入有逆转糖尿病并且具有延迟的动力学的胰岛(P＝0.02；n经过嵌合体处理的＝10；n未经处理的＝8)。
图18.对人“PDL1”具有特异性的小活化RNA(saRNA)(CD274，基因ID：29126)的标识。
图19.PDL1-saRNA/胰岛特异性适体嵌合体上调人β细胞上的PDL1。
图20.PDL1-saRNA/适体嵌合体在体内上调PDL1。
具体实施方式
如实例中所描述的，生成了治疗性RNA/适体嵌合体，以在体内调节人β细胞中的基因表达，以诱导其瞬时增殖并提高其对自身/同种免疫的抗性。具体地，已经优化并验证了使用胰岛特异性适体来递送：A)抗p57kip2的siRNA以诱导β细胞增殖，B)促进Xiap表达的saRNA以保护胰岛免于凋亡，以及C)促进PDL1表达的saRNA以保护细胞β细胞免受T细胞细胞毒性的影响。由于不存在自身免疫性T1D的可靠的人源化小鼠模型，因此方法是基于使用在适体治疗前移植有人胰岛的NSG或人源化NSG小鼠。人胰岛的使用取决于p57kip2生物学中物种特异性差异(14)以及PDL1和Xiap saRNA对人类基因的特异性。采用离体技术和创新型体内技术以通过β细胞增殖、凋亡和与免疫系统的相互作用进行成像来量化对体内治疗的反应。设想了将这些适体用作可以同时调节差异基因的单或多峰方法。
RNA适体在体内的使用特别吸引人，因为此类别的分子免疫原性低、深入穿透组织的能力高并且能够以高亲和力和特异性识别同源靶标。适体的氟化主链使其对RNAse降解具有抗性，并且不能够触发TLR信号传导(41，42)。RNA适体已成为siRNA和其它药物到特定细胞亚群或组织，以用于治疗许多人类疾病(60，62-75)的有效递送媒剂。实际上，通过适体与其细胞膜靶标之间的相互作用，适体可积极增强治疗剂的细胞内积聚(37-39，43-61)。某些适体药物已获得FDA批准，并且有30种以上正在临床试验中测试(16-24)。当体内施用时，未发现特异性靶标的适体会通过肾脏迅速消除，在组织或细胞中发现靶标的那些在长达两周的时间内仍可被检测到。其生物利用度、血浆半衰期和药代动力学特性可以借助于通过在合成期间添加聚乙二醇(PEG)或通过与纳米颗粒缀合来增加其大小而被容易地工程化(60，62-74)。适体可以与siRNA、miRNA或saRNA缀合，以在特定靶标中递送期望的治疗效果。与抗体和其它小分子相比，利用高特异性和限定的功能直接工程化适体的能力是优于抗体和其它小分子的明显优势。
实例
实例1–对人胰岛具有特异性的单克隆RNA适体的分离。
从针对小鼠胰岛的多克隆适体文库开始，并且使用胰岛耗尽的人腺泡细胞和来自4个不同尸体供体的手工摘取的人胰岛分别作为阴性选择物和阳性选择物，执行了无监督的切换的SELEX。这允许耗尽非特异性(腺泡组织结合)RNA适体，并丰富了对小鼠和人类胰岛具有特异性的那些适体的文库。
如图1所示，使用了HT-簇SELEX作为用于使用人胰岛和腺泡组织分离对人胰岛具有特异性的适体的无监督策略。通过PCR生成了随机适体文库，并从包括两侧是两个恒定区的40-nt可变区的cDNA随机文库(TCT CGG ATC CTC AGC GAG TCG TC TG(N40)CCG CAT CGTCCT CCC TA(SEQ ID NO:413)中生成了Durascribe T7 RNA转录。使用来自尸体供体的胰岛耗尽的胰腺(阴性选择物)，耗尽结合腺泡组织的适体的5ug(约8.3×1013个适体)此随机文库中。然后将未结合的适体与来自尸体供体的手工摘取的胰岛(100-300IEQ作为阳性选择物)一起孵育。用PBS洗涤胰岛，并通过RNA提取回收胰岛结合的适体，并使用2'-氟-dCTP(2'-F-dCTP)和2'-氟-dUTP(2'-F-dUTP)、ATP和GTP通过RT-PCR和T7-RNA聚合酶对胰岛结合的适体再次扩增，以用于改进RNAse抗性。使用了针对胰岛特异性适体富集的所产生的RNA适体文库(表1)以进行新的选择周期。使用来自4个无关的尸体供体的胰岛和腺泡组织执行了总共8个选择周期。对来自每个周期的文库进行了HT测序，并使其经受了生物信息学分析，以执行频率和簇分析，并且标识在选择过程期间富集的那些单克隆适体和适体家族。选定最频繁的家族中的存在于来自第8周期的文库上的最频繁的单克隆适体以用于经验测试。
表2.通过簇SELEX分离的推定的人胰岛特异性适体(来自图1)
Figure BDA0002889308540000111
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如图2所示，使用了HT-切换-簇SELEX来分离在小鼠与人之间交叉反应的胰岛特异性适体。如图1所示的分别使用作为阴性选择物和阳性选择物的小鼠腺泡组织和小鼠胰岛，执行了8个周期的HT簇SELEX(图2A)。使用了来自第8周期的所产生的多克隆适体，以使用来自小鼠的腺泡组织和胰岛或尸体供体分离的腺泡组织和胰岛进行两个另外的选择周期(图2B)。所产生的多克隆适体文库进行了HT测序和生物信息学分析(图2C)，以确定存在于使用小鼠或人类组织选择的文库中的每种单克隆适体的频率。选定富集在人类文库中的单克隆适体(表3)(针对人胰岛的推定适体，矩形选择)以进行经验测试。表3还提供了针对人胰岛的推定适体。
表3–人胰岛的适体序列
Figure BDA0002889308540000291
Figure BDA0002889308540000301
表4.通过切换-簇SELEX(来自图2)分离的推定人胰岛特异性适体
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接下来，利用图1和图2中所描述的两种高通量簇SELEX策略测试了对已标识的单克隆适体的人胰岛的特异性。简而言之，使用重叠的寡核苷酸作为模板，通过PCR和T7 RNA聚合酶产生了与通过生物信息学分析标识的序列相对应的单克隆适体。所产生的单克隆适体用Cyanin-3标记，并用作来自尸体供体的人胰腺的切片上的荧光探针。克隆号以前缀“m”报告，这指示从HT-切换簇SELEX标识适体。数据显示，虽然一些适体(m166-279、m5-3229、107-901、m7-2537、m9-3076、1-717、173-2273、m12-3772)显示出对胰岛的良好的特异性，但其它适体也标记腺泡组织(12-2617、109-2031、m1-2623、m24-3219)，并且其它适体未显示出任何染色(208-2529、155-1113、64-2437)。
为了进一步评价所选定的单克隆适体的特异性，使用了图4中最佳表现者(166-279、173-2273、107-901、1-717、m1-2623、m5-3239和m12-3773)以对FDA批准的组织微阵列染色。这些阵列中的每个阵列都含有来自30个人类组织的切片(每个组织都是从3个不同供体复制的)，并且通常用于抗体筛选，但尚未用于适体评价。简而言之，用不相关的适体的选定的cy3标记的RNA适体作为对这些组织微阵列照染色。然后通过免疫荧光显微镜术对每个组织进行分析。尽管大多数适体不仅如所期望的在胰腺胰岛中显示出结合，而且在其它组织中也显示出结合(图5C)，但适体1-717(图5A)和适体m12-3773(图5B)显示出对胰腺胰岛的非凡特异性和与所评价的其它组织(肾上腺、骨髓、乳腺、脑、结肠、内皮、食道、输卵管、心脏、肾脏、肝脏、肺部、淋巴结、卵巢、胎盘、前列腺、皮肤、脊髓、脾脏、肌肉、胃部、睾丸、胸腺、甲状腺、输尿管、子宫和睾丸)的不可忽略的接合。
为了评价适体1-717和m12-3772是否可以识别人胰岛以及小鼠对应物，对每个含有来自健康小鼠的11个组织的组织微阵列执行了利用这两种Cy-3标记的单克隆适体的染色。这些实验显示，适体1-717和适体m12-3773两者均可以识别小鼠胰岛。参见图6。然而，与在人类组织上观察到的相反，两种适体可以在不同水平下识别胰腺组织以及脾脏、胃部和空肠。这些数据表明，在两个物种之间可能存在同源靶标分布的差异。
为了更好地评价胰岛内的适体的特异性，采用了两种不同的技术：共聚焦显微镜术(图7A和图7B)和流式细胞术(图7C和图7D)。对于共聚焦显微镜术，用cy-3标记的适体M12-3773(图7A)或cy3标记的适体1-717(图7B)对人胰腺的切片染色。用抵抗胰岛素和胰高血糖素的抗体以及DAPI对切片复染色，并通过共聚焦显微镜术进行评价。数据显示两种适体与α和β细胞两者均结合，但在β细胞上具有更高的信号。
对于流式细胞术，用Cy3标记的适体M12-3773(图7C)或cy3标记的适体1-717(图7D)对人胰岛的单个细胞悬浮液染色，用活体染料以及对胰岛素和胰高血糖素具有特异性的抗体对其复染，并进行分析。在分别对胰高血糖素阳性或胰岛素阳性的细胞(等值线图)进行门控后，在α细胞(顶部直方图)或β细胞(右侧直方图)上对适体信号(开放直方图)进行量化。使用无关适体(填充的直方图)作为阴性对照。
簇集蛋白是适体m12-3773的可能靶标。用寡核苷酸合成仪合成了3'生物素-适体m12-3773，并使用所述3'生物素-适体来标记来自人胰岛的单个细胞悬液。洗涤细胞，并用tween20/BSA溶液裂解其细胞质。利用磁珠和磁分离回收结合到其配体的适体。在SDS中在95℃下由适体-珠复合物释放捕获配体，并在SDSpage中运行捕获配体。切割带并使带经受质谱和基于mascot的分析(图8A)。簇集蛋白(UniProtKB-P10909)(图9B)是具有最高评分的蛋白质之一(236)，具有与由质谱所标识的肽相比覆盖度升高的序列，具有可与从SDS page切割的带的分子量兼容的分子量并且更重要的，是所测试的蛋白中唯一一种其沉默降低了适体m12-7337而非适体1-717与β细胞结合的能力(图8C)的蛋白。
图9示出了TMED6是适体1-717的推定靶标。图9A示出了用于检测适体1-717的靶标的实验策略。为了标识适体1-717的靶标，使用了蛋白质阵列(HuProtTMv2.0，Arrayit)。这些蛋白质阵列含有19,000种以上人类重组蛋白，通过信息学分析，允许标识抗体、肽或蛋白质的同源蛋白质。此技术已适用于标识适体的配体。简而言之，在室温下将预封闭的阵列与1μg的cy3标记的1-717或m12-3773在封闭缓冲液中杂交，持续30'。洗涤阵列，在Genepix微阵列读取器上一式三份读取阵列，并通过ad hoc产生的软件对阵列进行分析。此软件1)从gpr文件中获取数据；2)添加具有(基因ID、对照、空白、ND)的描述列；2)使用在若干个点中修饰的经过优化的“plotArray”函数(针对特定蛋白质阵列加上呈UTF文件格式的一些问题实施脚本)；3)执行质量控制，所述质量控制包含重建MA图的产生的微阵列图像；4)对数据进行归一化并扣除背景；5)通过p值分布图、火山图以及借助于t测试对显著调制的分析来分析阵列之间的差异表达。此分析提出了TMED6(NM144676.1，蛋白质id Q8WW62)作为适体1-717的最可能的配体。参见图9B。竞争性测定(图9C)证实了此靶标的特异性。如图9C所示，竞争性测定证实了适体1-717对TMED6的特异性。简而言之，在不同浓度的重组TMED6蛋白存在的情况下，用Cy-3标记的适体1-717对人胰腺的系列切片染色(即适体/重组蛋白摩尔比范围＝1/1-1/10)。通过荧光显微镜获取图像，并通过cellprofiler对适体结合量化。数据显示重组TMED6的添加以剂量依赖性方式抑制适体1-717结合，这强烈表面TMED6是此适体的靶标。
实例2–所标识的适体在体内为胰岛特异性的。
为了评价适体1-717和m12-3773是否可以在体内识别人胰岛，采用了在附睾脂肪垫中植入有人胰岛的免疫缺陷型NSG小鼠。另外，使用了适体1-717和适体m12-3773的新调配物，其中每个单克隆适体都被生物素化并与链霉亲和素复合，以形成四聚物纳米颗粒(以下称为四聚体)。此调配物相比于对应单体适体具有优越的药代动力学和更好的亲和力。
将生物素/链霉亲和素Alexafluor(AF750)标记的适体(适体1-717或适体m12-3773或两种适体的等摩尔混合物)静脉注射在免疫缺陷型NSG小鼠体内(在附睾脂肪垫(EFP)中植入有人胰岛)，以评价m12-3773和1-717是否可以在体内识别人胰岛。当使用两种适体的混合物时，在EFP区中观察到累积协同信号，这可能是因为每个适体都靶向不同的胰岛表位(图10A)。4小时之后，通过“体内成像系统(IVIS)”测量附睾脂肪垫区中的荧光信号。图10B中的数据显示，适体1-717和适体m12-3773两者均可以在体内识别胰岛。另外，此实验揭示了，使用两种适体的等摩尔混合物显著提高了信号背景比。
为了确定适体m12-3773和1-717是否可以用于体内测量β细胞质量，在附睾脂肪垫中向免疫缺陷型NSG小鼠移植了不同数量(范围为62.5-500IEQ)的人胰岛。21天之后，向小鼠iv注射由适体1-717和m12-3773的等摩尔混合物与链霉亲和素复合而产生的Alexafluor750四聚体。4小时之后，通过IVIS对信号进行量化。图11A.适体m12-3773和1-717识别小鼠内源胰岛和移植在EFP中的人胰岛(图11B)。重要的是，EFP区域中的荧光信号与植入的胰岛的数量成正比，这表明这些适体可以用于体内测量β细胞质量(图11B和11C)。来自胰岛的信号在注射后持续10天(未示出)。如图11D所示，同种异体C57Bl6胰岛移植物的排斥可以随时间的推移进行测量，如左侧上的信号的缺失所看到的。相反，同系移植物的信号(图11D的右图)随着时间的推移而保持，这表明移植物存活。
总之，所选适体m12-3773和1-717在体外和体内以良好的特异性与小鼠和人β细胞接合，并且因此可以用于在体内将治疗剂靶向人β细胞。
实例3–适体嵌合体可以将治疗性RNA递送到胰岛
如图12所示，胰岛特异性RNA适体1-717和m12-3773可以通过延长其3'末端以及三核苷酸接头区(即GGG)和期望的治疗性RNA的过客链(过客尾)，容易地与治疗性RNA缀合。然后，通过在70℃下将等摩尔量的两种RNA混合，并且允许混合物在室温下缓慢冷却下来，将治疗性RNA引导链简单地退火到经过修饰的适体。
为了评价适体是否可以作为用于转染β细胞的非病毒替代物，进行了原理实验的证明，旨在通过适体递送胰岛素(INS)1和2在未解离的小鼠胰岛中敲低。图13A是实验程序的示意图。如图12所详述的，通过将适体1-717或适体m12-3773与对小鼠胰岛素1/2(INS1/2)或细胞增殖人抑制剂p57kip2(uniprot P49918，别名CDN1c)具有特异性的siRNA缀合，产生了胰岛特异性适体嵌合体。将INS1/2-siRNA/适体嵌合体添加到未解离的小鼠胰岛中，而将p57kip2-siRNA/适体嵌合体添加到来自尸体供体的人胰岛中。使用了扰乱siRNA/适体嵌合体作为阴性对照。72小时之后，通过qRT-PCR分别在经过转染的小鼠胰岛和经过转染的人胰岛上对INS1/2和p57kip2的表达进行量化。如图13B所示，适体嵌合体显著下调靶基因的表达。
如图14所示，p57kip2-siRNA胰岛特异性适体嵌合体在体内诱导人β细胞增殖。图14A示出了实验程序：在眼部的前房中，向经过链脲佐菌素治疗的免疫缺陷型NSG小鼠移植次优量(250IEQ)的人胰岛。通过s.c.植入胰岛素丸剂使小鼠维持血糖正常的。21天之后，当胰岛血管化时，去除胰岛素丸剂以允许高血糖症发展，给小鼠饲喂7天BrdU以评价细胞增殖，并用i)扰乱siRNA/适体嵌合体，或ii)p57kip2-siRNA/适体嵌合体对小鼠进行治疗。治疗之后第九天，对小鼠人道实施安乐死，并在用抵抗胰岛素、胰高血糖素和BrDU(白色)的抗体标记移植物切片之后，通过免疫荧光显微镜术评价了β和α细胞增殖。图14B提供了来自用对照嵌合体或p57kip2-siRNA/适体嵌合体治疗的小鼠的移植物的免疫荧光图片。胰高血糖素和胰岛素染色以深灰色作为伪色描绘，而BrdU染色作为细胞增殖的量度以白色作为伪色描绘。图14C示出了对增殖β和α细胞的量化。这些数据一起指示，p57kip2-siRNA/适体嵌合体可以在模拟T1和T2糖尿病的高血糖环境中诱导体内人β细胞增殖。
β细胞中的P57kip2沉默具有重要的治疗性意义。事实上，p57Kip2的突变与婴儿期的局灶性高胰岛素血症(FHI)相关联，所述局灶性高胰岛素血症是临床综合征，其特征在于β细胞的显着非肿瘤性克隆扩增(14)、胰岛素的过度产生以及严重不可控制的低血糖症(89，90)。FHI的局灶性病变的特征是与p57kip2丧失有关的过度β细胞增殖(91，92)。尽管p57kip2沉默的促增殖活性在FHI和癌症中不是期望的，但临时限定的沉默可能对促进T1D中的成人β细胞增殖是有用的。事实上，一旦将胰岛移植到高血糖、免疫缺陷型小鼠中，腺病毒-shRNA介导的p57kip2在从减少的成人器官供体中获得的人胰岛中的沉默会将β细胞复制增加了3倍以上(14)。新复制的细胞保留了成熟β细胞的特性，如胰岛素、PDX1和NKX6.114的表达。有趣的是，在血糖正常的小鼠中未观察到β细胞增殖，这表明高血糖症可能会提供另外的促增殖信号(93)。这些发现为用于在患有T1D的患者中恢复足够的β细胞质量和/或减少移植期间所需的胰岛的数量的新治疗干预打开了可能。然而，迄今为止，这些发现的可翻译性由于稳定的p57Kip2沉默，受到了病毒载体的使用和肿瘤形成相关联的安全担忧阻碍。事实上，p57Kip2在人类癌症中经常被下调(94)，并已被提出作为肿瘤抑制基因，因为其异位表达足以停止肿瘤细胞增殖(94)。然而，通过适体递送对p57kip2的暂时受控的调节在糖尿病中对以暂时受控的方式增加β细胞增殖可能是重要的。这可能足以增加定时施用期间β细胞的质量，同时避免对β细胞的可能与稳定沉默一起产生的非可控、肿瘤样增殖的安全担忧。
实例4–通过saRNA-适体嵌合体对XIAP的上调抑制β细胞的凋亡。
在所有形式的糖尿病中，凋亡性细胞死亡是胰岛素产生β细胞丧失的标志(99-101)。胰岛内的白细胞浸润和激活以及高血糖会导致凋亡触发因子的局部浓度高，所述凋亡触发因子包含炎症细胞因子、趋化因子和反应性氧物种99。这些凋亡途径中的大多数会汇聚到半胱天冬酶(CASP)3和7活化上，从而导致基因重编程、磷脂酰丝氨酸翻转和凋亡小体形成(102)。
β细胞凋亡可以通过刺激自身抗原呈递和自身反应性T细胞活化进一步馈送自身免疫过程(103)。类似地，在胰岛移植环境中，原发性无功能，即经过移植的胰岛团块的部分但显著的并且有时完全丧失，这是在移植之后早期发生的(104-106)。β细胞凋亡开始于分离程序期间，并且在移植时由缺氧和高血糖以及促凝和促炎级联加剧(107)。原发性非功能占了发生在移植之后的最初48小时期间的功能性胰岛团块丧失的50％以上(106)。
因此，高度期望甚至暂时阻断凋亡的β细胞死亡，以保留1型糖尿病(T1D)和胰岛移植中的β细胞质量，并且减少自身反应性T细胞活化和进一步的免疫损伤。
此蛋白质是凋亡抑制家族中最有效的成员，并且防止CASP 3、7和9的激活(108)；ii)使用病毒载体的Xiap过表达提高了β细胞活力，防止了其细胞因子或低氧诱导的凋亡(109-111)；iii)Xiap转导的人胰岛在移植在糖尿病NOD-SCID小鼠体内时延长正常血糖(11)。然而，由于Xiap在许多癌症中均被上调，因此其稳定的过表达引其了重要的安全担忧。因此，通过与胰岛特异性适体一起递送的saRNA进行的受控的Xiap激活可以可替代地用于减少原发性无功能，防止T1D中的β细胞丧失和自身馈送自身免疫过程。
小激活RNA(saRNA)是在特定启动子区中发挥其作用，并上调mRNA和蛋白质表达高达4周(这取决于细胞复制、mRNA和蛋白质的转换)的寡核苷酸(112-122)。对通过机制的saRNA介导的基因上调尚不完全了解，但其被视为涉及抑制性RNA的表观遗传变化或下调(123-125)。saRNA提供了安全、特异性的且暂时的基因激活而无需插入DNA元素，因为其特异性与CRISP/CAS9系统中的gRNA的特异性相当，不会诱导不可逆的DNA修饰126。尽管正在研究针对癌症治疗的治疗性saRNA，但是据了解，在T1D中尚未执行任何研究(127-130)。
因此，标识了能够特异性上调抗凋亡基因XIAP的saRNA。简而言之，使用先前描述的算法首先检查了人类XIAP启动子(112，131)。此分析，包含用于避免非特异性序列的基因组blast分析，返回了超过156个推定的saRNA靶标区。合成了96个具有最高评分的推定的saRNA，并针对其上调Xiap的能力通过转染人上皮细胞系A549对其进行了测试。使用此细胞系是因为其易于转染，PDL1和Xiap的基础表达低。在转染之后96小时执行了qRT-PCR，并对关于用扰乱的saRNA转染的同一细胞系的结果进行了归一化(图15)。发现十二个saRNA(在表5中提供)上调Xiap表达比扰乱的saRNA多了10倍(范围10.4-74.8)。
表5.用于上调人Xiap的saRNA序列
位置 改变倍数 Xiap saRNA序列 SEQ ID NO:
-234 74.8083 UAGCUGAAGUUCAUCUCUCuu 382
-1134 46.7026 UUUCAGCCUUAAGGAUGGUuu 383
-449 37.1938 UUUAUUCUCCCCUUGGGUGuu 384
-344 18.7146 UACUCCCUCUGCCUAUGUGuu 385
-121 15.4365 UUUACUGUUUUGGCUGGGCuu 386
-682 13.9281 AAAAUGCUGGUCAUACCCUuu 387
-354 13.1961 UUGUUCAAACUACUCCCUCuu 388
-374 12.5789 UUUUCCUGCCUUCCGCUAAuu 389
-593 11.9908 UUACAGGGUAAUGUGGUGAuu 390
-758 11.0947 GAUUGGGAGGUGAAGGGAAuu 391
-680 10.6792 AAUGCUGGUCAUACCCUGGuu 392
-531 10.5239 UACAAGAUAUGAUCCUCCCuu 393
使用从尸体供体分离的人胰岛执行了原理性实验的体外证明，以确定适体递送的Xiap-saRNA是否可以保护β细胞免于凋亡。如图12所示的通过将所标识的Xiap saRNA(-449，表2)与适体m12-3773或适体1-717缀合生成了Xiap-saRNA适体嵌合体。图16A示出了实验程序：通过将Xiap/saRNA适体嵌合体(5ug)添加到培养物中，用Xiap-saRNA转染来自尸体供体的新鲜分离的、未解离的人胰岛(200IEQ)。使用了扰乱saRNA/适体嵌合体作为阴性对照。48小时之后，用炎性细胞因子(IFNg、TNFa和IL1b)激发一半的细胞，以诱导β细胞凋亡。由流式细胞术在细胞因子激发之后24小时，通过测量在对胰岛素和胰高血糖素染色之后的β/α细胞比评价了β细胞的死亡。图16B示出了用扰乱的saRNA嵌合体(对照嵌合体)或XIAP-saRNA/适体嵌合体(Xiap嵌合体)处理，并且之后用细胞因子(CTK)激发或保持未处理(未进行CTK)的胰岛的单个细胞悬浮液的流式细胞术分析。图16C为来自5个独立实验的意大利面条图，每个实验都利用来自不同尸体供体的胰岛，使用利用适体m12-3773或适体1-717生成的嵌合体。报告配对的T测试值。数据显示，Xiap-saRNA适体嵌合体保护β细胞免受细胞因子诱导的凋亡的影响。
有趣的是，不存在细胞因子的未经处理的胰岛在存在对照嵌合体(图16B)和不存在任何嵌合体(数据未显示)的α细胞中显示出更高的比例(β/α细胞比＝0.8)，这表明相比于α细胞，在胰岛分离期间，β细胞活性受到的影响更大。细胞因子的添加进一步降低了β细胞比例(β/α细胞比约0.5)。值得注意的是，利用Xiap-saRNA/嵌合体进行的孵育不仅防止了CTK诱导的β细胞的减少(β/α细胞比约1.6)，还防止了与胰岛分离相关联的β细胞丧失。这些数据表明，saRNA嵌合体可以用于调节人胰岛中的Xiap表达。
实例5-使用Xiap-saRNA/适体嵌合体来防止原发性非功能
如图17A所详述的用Xiap-saRNA适体嵌合体或对照嵌合体转染来自尸体供体的人胰岛。转染之后二十四小时，将胰岛移植在免疫缺陷型NSG小鼠的眼部的前房中。通过体内膜联蛋白V(ANXA5)染色和体内显微镜术纵向评价了胰岛细胞凋亡。数据显示，在移植之前用Xiap-saRNA/适体嵌合体处理显著减少了凋亡(ANXA5)，并且因此减少了移植物的细胞丧失。
图17B中提供了用于移植物保留的Xiap-saRNA/适体嵌合体的示意图。如图17C所示，在添加了嵌合体的培养基中培养人胰岛，在移植第48小时、第24小时以及当天，在链脲佐菌素糖尿病NOG小鼠的左肾囊中向每只小鼠移植600IEQ。数据显示，用适体嵌合体预处理人胰岛大大地提高了胰岛移植的功效，到第2天大约80％的小鼠变为血糖正常的。相比之下，仅50％的od小鼠植入有逆转糖尿病并且具有延迟的动力学的胰岛(P＝0.02；n经过嵌合体处理的＝10；n未经处理的＝8)。
实例6–通过PDL1-saRNA/适体嵌合体保护胰岛免受人源化小鼠的同种免疫和自身 免疫
PDL1-PD1拮抗剂在癌症中的成功凸显了PDL1表达在组织特异性耐性的维持中的临床重要性(135)。PDL1对PD1的接合会下调效应T细胞的增殖和活化，诱导T细胞周期停滞和凋亡并促进IL10产生Treg(136-139)。有趣的是，新兴的抗PD1副作用治疗之一是T1D140。这表明PDL1/PD1在控制T细胞对β细胞的耐性中可能起重要作用。事实上，在NOD小鼠中，PDL1阻断加速了雌性小鼠中的T1D并且诱导了雄性小鼠中的T1D(13)。相反，同系移植的胰岛中的PDL1异位表达保护NOD小鼠免受T1D复发的影响(12，13)。在胰岛素启动子的控制下表达PDL1的NOD转基因小鼠显示出糖尿病的延迟的发病率、降低T1D发病率以及全身性、胰岛特异性T细胞无反应性(141)。在人类中，PDL1多态性与T1D相关联(OR＝1.44)(142)。
鉴于PDL1表达可能在控制T细胞对β细胞的反应性中所发挥的重要性，标识了对PDL1具有特异的saRNA(图18)。简而言之，通过使用可公开获得的算法扫描PDL1启动子，标识了PDL1的小活化RNA的推定候选序列。此分析返回了200个以上的推定靶saRNA靶标区。合成了95个具有较高评分的推定saRNA，并针对其通过转染人上皮细胞系A549上调PDL1的能力对其进行了测试。转染之后96小时执行了qRT-PCR，并对关于用扰乱的saRNA转染的同一细胞系的结果进行了归一化。发现19个saRNA上调Xiap表达的能力比扰乱的saRNA高3倍(范围3.01-63.27)(表6)。
表6：用于上调人PDL1的saRNA序列.
位置 改变倍数 PDL1-saRNA SEQ ID NO:
-261 63.2769 UUUAUCAGAAAGGCGUCCCuu 394
-583 14.1907 UUAAGGCUGCGGAAGCCUAuu 395
-739 13.0165 UUGACCUCAAGUGAUCCGCuu 396
-461 11.5844 GACUUCCUCAAAGUUCCUCuu 397
-584 7.7063 UAAGGCUGCGGAAGCCUAUuu 398
-349 5.8792 UAAAAAGUCAGCAGCAGACuu 399
-353 5.2152 AAGUCAGCAGCAGACCCAUuu 400
-608 5.0249 GUGAGGGUUAAGAAAGCCCuu 401
-881 4.833 CUGCAGUUCAAAAUACUGCuu 402
-637 4.1477 UUUGGGUUAGUGAAUGGGCuu 403
-683 3.9179 UUUACUUAAGUAUUAUCCCuu 404
-594 3.7109 GAAGCCUAUUCUAGGUGAGuu 405
-352 3.6316 AAAGUCAGCAGCAGACCCAuu 406
-351 3.3859 AAAAGUCAGCAGCAGACCCuu 407
-609 3.3669 UGAGGGUUAAGAAAGCCCUuu 408
-713 3.3464 CUAGGUGCUCUCUUUUCUCuu 409
-636 3.28 CUUUGGGUUAGUGAAUGGGuu 410
-460 3.0587 UGACUUCCUCAAAGUUCCUuu 411
-464 3.0192 UUCCUCAAAGUUCCUCGACuu 412
接下来，测试了本文所述的胰岛特异性适体是否可以有效地将PDL1-saRNA递送到人胰岛并上调PDL1表达。通过将适体1-717与PDL1-saRNA-636(表6)缀合生成了适体-PDL1-saRNA嵌合体，如图12所示。如图19A所示，将这些PDL1-saRNA/适体嵌合体添加到来自尸体供体的未解离的人胰岛中。48小时之后，将胰岛解离，用抗胰岛素、抗胰高血糖素和抗PDL1抗体对其进行标记，并通过流式细胞术对其分析(图19B)。通过对胰岛素阳性β细胞或胰高血糖素阳性α细胞进行门控评价了PDL1表达。尽管用对照嵌合体进行的处理不会修饰PDL1表达，但用PDL1-saRNA/适体进行的处理会显著上调此重要免疫调节蛋白在β细胞上的表达(图19B)。有趣的是，在α细胞中未观察到变化，这间接证实了此适体与β细胞的优先结合。这些原理数据的证明指示，适体可以有效地用于将功能性PDL1-saRNA体外递送到人β细胞。
接下来，评估了PDL1-saRNA/适体嵌合体在体内上调PDL1的能力。如图20A所示，在眼部的前房中向免疫缺陷型NSG小鼠移植来自尸体供体的人胰岛。3周后，用生成的PDL1-saRNA(636)/1-717适体嵌合体对小鼠进行治疗，如图12和图19中所述。使用了扰乱saRNA/适体嵌合体作为对照(对照嵌合体)。治疗之后五天，通过利用抗PDL1抗体的体内标记和体内显微镜术对胰岛(深灰色)上的PDL1表达(白色)进行量化(图20B)。在基线处或在用PDL1-saRNA/适体嵌合体或扰乱的saRNA/适体嵌合体治疗之后5天的对植入的胰岛上的PDL1表达的汇总(图20C)。
这些结果指示：i)可能在体内在人胰岛细胞中检测到PDL1，ii)适体嵌合体在体内转染人胰岛，并且iii)可能通过适体嵌合体在体内上调人胰岛中的PDL1。
实例7–评估通过适体介导的Xiap上调保护β细胞免受凋亡的影响。
在第一组实验中，将在ACE中向NSG小鼠植入人胰岛。植入后三周，将用一种或多种Xiap saRNA-适体嵌合体或对照嵌合体对小鼠进行治疗。在不同的时间点处，将通过眼内注射IL1β、TNF-α和IFNγ激发人胰岛移植物，以通过激活半胱天冬酶3和7诱导β细胞的凋亡。将使用CASP3/7绿色检测试剂通过眼内成像系统在体内评价半胱天冬酶3和7的活性。此细胞渗透试剂由与核酸结合染料缀合的四氨基酸肽(DEVD)组成。激活后，半胱天冬酶3和7切割探针，允许染料与DNA结合并发射可以在细胞水平下在ACE28中检测到的亮的荧光信号。另外，将使用利用抗Annexin V抗体进行的体内染色来在体内直接测量胰岛细胞凋亡(图7)。
第二组实验旨在评价Xiap调节对抗胰岛同种免疫的影响。简而言之，将在ACE或EFP中向STZ糖尿病NSG小鼠移植500个IEQ人胰岛。3周后，将用一种或多种Xiap嵌合体或扰乱的对照对小鼠进行治疗。将如Aim2b中所确定的重复治疗。第一次治疗后一周，小鼠将接受对于胰岛的HLA而言不匹配的CFSE标记的人T细胞。不进行任何治疗，同种异体T细胞的过继性转移会导致移植物丧失并在3周内返回到高血糖。因此，将使用以下读数评估Xiap嵌合体治疗对人胰岛同种移植存活的保护作用：i)血糖；ii)人c肽血浆水平；以及在ACE组中，iii)T细胞浸润的纵向评价以及对植入的胰岛的体积分析，如(77，78)中所示出的。
为了确保Xiap嵌合体作用在个体之间的数据再现性，将使用来自6个尸体供体的原代人胰岛进一步验证EndoC-BH3细胞中所标识的嵌合体；这将提供88％的功效，以在一个尾部配对的t测试中检测与对照的1.25SD差异。为了避免伪像，将使用3种不同的读数方法(qPCR、western印迹和酶学测定)，并且将使用来自3个不同尸体供体的人胰岛对每个实验执行至少3次独立重复。在移植研究中，将使用每组总共9只小鼠(每次重复3只)来确保90％的功效(ANOVA，α＝0.05)并检测与对照的1.6SD差异。
实例8–优化用于p57kip2体内沉默的剂量
在第一组实验中，将用不同剂量(6皮摩尔/g、20皮摩尔/g和60皮摩尔/g)的与p57kip2siRNA或扰乱的siRNA(对照嵌合体)缀合的胰岛特异性适体作为阴性对照i.v.或s.c.对在EFP中移植有500个IEQ人胰岛的NSG小鼠进行治疗。将使用编码相同的经过p57kip2 shRNA转染的胰岛的腺病毒作为阳性对照(14)。在预定的时间点(例如，施用之后第1天、第2天、第3天、第4天和第5天)处，将收获移植物，并通过以下对p57kip2表达进行量化：i)对激光捕获的胰岛进行的qRT-PCR，以及ii)定量计算机辅助的免疫荧光分析95。糖尿病研究所(Diabetes Research Institute)(96，97)和PIs95的实验室中都对两种技术进行了优化。为了评价可能的剂量依赖性毒性，将收集所关注的血清和器官(脾脏、肝脏、淋巴结、肺部、肾脏和脑)，并将所述血清和器官送到迈阿密大学的小鼠病理实验室(mousepathology laboratory of University of Miami)，以用于组织病理学评价。
在第二组实验中，将在ACE中对NSG小鼠移植500个IEQ人胰岛。三周之后，将i.v.或通过眼内注射(i.o)用不同剂量(6pm/g、20pm/g、60pm/g)的装载有p57kip2 siRNA或AF647扰乱的siRNA(对照嵌合体)的适体-嵌合体作为阴性对照对小鼠进行治疗。将在注射后2小时、3小时、4小时、8小时和24小时，利用眼内成像系统评价AF647 siRNA的体内转染效率(28)。在所选时间点(例如，治疗后2天、3天、4天和7天)处，将去除移植物并通过对从ACE移出的胰岛进行的qRT-PCR以及通过以下对p57kip2的表达进行量化：i)对激光捕获胰岛的qRT-PCR；以及ii)定量计算机辅助的免疫荧光显微镜术分析(95)。
实例9–优化适体-嵌合体施用的治疗长度和频率
一旦标识了最佳剂量和施用途径并评价了p57kip2沉默的动力学，就将确定诱导β细胞质量中的实质性变化(即，≥100％的增加)所需的p57kip2siRNA-适体嵌合体的施用的数量。由于p57kip2沉默被示出为仅诱导高血糖小鼠中的β细胞增殖14，因此将亚边缘人胰岛团块(250IEQ)移植在NSG小鼠的EFP或ACE中。移植后21天，将通过链脲佐菌素(STZ)处理使小鼠成为高血糖的。STZ会选择地消除小鼠胰岛，因为人β细胞更具有抗性(98)。一旦小鼠变得高血糖的(通常在治疗后5-6天)，小鼠将接受1次、2次、3次或4次胰岛特异性或对照适体嵌合体的施用。适体施用的频率将基于实例5中确立的时间过程确定。将在饮用水中施用BrdU，以用于离体确定增殖。将通过IVIS对EPF组中的β细胞质量进行纵向评价(基线、治疗期间、最后一次治疗后5天和10天)(图2)。在ACE组中，将通过体内成像和胰岛体积的定量分析来评价胰岛质量(28)。最后治疗后十天，将收获移植物并通过免疫染色进行分析，以确定(i)通过BrdU和Ki76染色的β细胞增殖以及(ii)α与β细胞比。
实例10–确定适体介导的沉默是否可以恢复移植有边亚边缘胰岛团块的糖尿病小 鼠的正常血糖
此实例的目的是测试适体介导的p57kip2沉默是否可以恢复移植有次优数量的人胰岛的糖尿病小鼠的正常血糖。
在第一组实验中，将在ACE中向在胰岛素疗法中维持的STZ糖尿病NSG小鼠(sc丸剂移植物以用处持续的胰岛素释放)移植不同数量的人胰岛(50、150、350IEQ)。三周之后，将去除胰岛素丸剂，并用p57kip2siRNA-适体嵌合体或扰乱的对照局部地或全身地对小鼠进行治疗。为了将此治疗与当今用于胰岛转染的黄金标准进行比较，将用对p57kip2shRNA或RFP进行编码的腺病毒载体作为对照对另外两组小鼠局部进行治疗。将在ACE中执行使用RFP编码腺病毒的试点实验，以确定转导至少90％的胰岛所需的最小剂量。转导效率将使用体内成像系统进行量化(28)。在实验组(接受了50、150和350IEQ的实验组)中，除了ACE胰岛移植物的活体内成像和体积分析外，还将使用血糖作为治疗功效的读数。不同组中的不同亚边缘胰岛团块也可以揭示高血糖驱动对人胰岛增殖的程度。
在第二组实验中，将在EFP中向STZ-糖尿病小鼠移植相同的亚边缘人胰岛团块(50、150、350IEQ)，并在植入期间在胰岛素上维持。3周后，将去除胰岛素丸剂，并用p57kip2siRNA-适体嵌合体或扰乱的对照对小鼠进行治疗。将通过IVIS以读数形式纵向监测血糖和β细胞质量。
在两组实验中，将在恢复了正常血糖的小鼠中执行葡萄糖耐性试验(GTT)，以进一步评价应激条件下的胰岛功能。
为了确保结果的再现性，将使用来自3个不同尸体供体的人胰岛对每个实验执行至少3次独立重复。使用每实验组总共9只小鼠(每次重复3只)，可给予90％的功效(单向ANOVA，α＝0.05)，以检测1.6SD对控制的作用大小。将使用每组12只小鼠来解释读数的较高预期变化。为了最小化特定于读数的伪像，将利用至少2种独立方法来测量同一现象。
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Claims (64)

1.一种测量β细胞质量的方法，所述方法包括以对于测量所述β细胞的质量有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与成像剂缀合的适体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述适体为M12-3773或1-717。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述成像剂为荧光染料、PET示踪剂或MRI造影剂。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述适体通过螯合剂与所述成像剂缀合。
5.一种调节β细胞的增殖的方法，所述方法包括以对于调节所述β细胞的增殖有效的量使所述β细胞与构建体接触，所述构建体包括与小活化RNA(saRNA)缀合的适体。
6.一种用于抑制有需要的受试者的组织移植物凋亡的方法，所述方法包括以对于抑制所述组织移植物的凋亡有效的量使所述组织移植物与构建体接触，所述构建体包括与小活化RNA(saRNA)缀合的适体。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述适体为M12-3773或1-717。
8.根据权利要求5或权利要求7所述的方法，所述方法抑制所述β细胞的凋亡。
9.根据权利要求5到8中任一项所述的方法，其中所述saRNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。
10.根据权利要求6、7或9所述的方法，其中所述组织移植物来自器官，所述器官选自胰腺、心脏、肺部、肾脏、胃部或皮肤。
11.根据权利要求6、7、9和10中任一项所述的方法，其中所述适体是肌肉特异性适体，并且所述问题是心脏组织。
12.一种用于保护所述β细胞免受T细胞介导的所述β细胞的细胞毒性影响的方法，其利用构建体以对于抑制T细胞介导的β细胞的毒性有效的量进行，所述构建体包括与saRNA缀合的适体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述适体为M12-3773或1-717。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述saRNA能够增加免疫检查点。
15.根据权利要求12到14中任一项所述的方法，其中所述saRNA上调蛋白质CD274(程序性死亡配体1，PDL1，基因id 29126)。
16.一种用于治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括向所述受试者施用构建体，所述构建体包括与saRNA缀合的适体。
17.一种适体，其包括SEQ ID NO:264中所示的核苷酸序列。
18.一种适体，其包括SEQ ID NO:259中所示的核苷酸序列。
19.一种构建体，其包括与saRNA缀合的根据权利要求17或权利要求18所述的适体。
20.根据权利要求19所述的构建体，其中所述saRNA上调蛋白质XIAP(X连锁凋亡抑制物基因id 331)。
21.根据权利要求19所述的构建体，其中所述saRNA上调蛋白质CD274(程序性死亡配体1，PDL1，基因id 29126)。
22.一种构建体，其包括与小活化RNA(saRNA)缀合的适体。
23.根据权利要求22所述的构建体，其中所述适体对组织具有特异性。
24.根据权利要求23所述的构建体，其中所述组织来自器官。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中所述器官为胰腺、心脏、肺部、肾脏、胃部、皮肤或脑。
26.根据权利要求23到25中任一项所述的构建体，其中所述组织为胰腺胰岛。
27.根据权利要求22到26中任一项所述的构建体，其中所述构建体进一步包括可检测标记。
28.根据权利要求27所述的构建体，其中所述可检测标记是荧光染料、如氟18、氧15、镓68等正电子发射断层扫描示踪剂、如钆、氧化铁、铂铁或锰等磁共振成像造影剂。
29.根据权利要求22到28中任一项所述的构建体，其中所述适体为M12-3773或1-717。
30.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述适体对簇集蛋白(CLU，基因id 1191)具有特异性。
31.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述适体对“含跨膜emp24结构域的蛋白质6”(TMED6，基因id 146456)具有特异性。
32.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为肾上腺组织或骨髓。
33.根据权利要求32所述的构建体，其中所述适体为173-2273、107-901或m6-3239。
34.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为乳腺组织、肺部组织或淋巴结组织。
35.根据权利要求34所述的构建体，其中所述适体为107-901和m6-3239。
36.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为脑小脑。
37.根据权利要求15的构建体，其中所述适体为173-2273、107-901、m1-2623或m6-3239。
38.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为脑皮层组织、垂体组织、结肠组织、内皮组织、食管组织、心脏组织或肾脏组织。
39.根据权利要求38所述的构建体，其中所述适体为107-901、m1-2623或m6-3239。
40.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为输卵管组织。
41.根据权利要求40所述的构建体，其中所述适体为m6-3239。
42.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为肝脏组织。
43.根据权利要求42的构建体，其中所述适体为166-279、107-901、m1-2623或m6-3239。
44.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为卵巢组织。
45.根据权利要求44所述的构建体，其中所述适体为107-901。
46.权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为胎盘组织。
47.根据权利要求46所述的构建体，其中所述适体为166-270、173-2273、107-901、m1-2623或m6-3239。
48.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为前列腺组织。
49.根据权利要求48所述的构建体，其中所述适体为173-2273或107-901。
50.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为脊髓组织。
51.根据权利要求50所述的构建体，其中所述适体为166-279或173-2273。
52.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为睾丸组织。
53.根据权利要求52所述的构建体，其中所述适体为166-279、173-2273、107-901、m1-2623、m6-3239和m12-3773。
54.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为胸腺组织。
55.根据权利要求54所述的构建体，其中所述适体为173-2273、107-901或mf-2623。
56.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为甲状腺组织。
57.根据权利要求56所述的构建体，其中所述适体为m1-2623。
58.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为输尿管组织。
59.根据权利要求58所述的构建体，其中所述适体为107-901。
60.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为子宫颈组织。
61.根据权利要求60所述的构建体，其中所述适体为166-279。
62.根据权利要求22到29中任一项所述的构建体，其中所述组织为朗格尔汉斯(Langerhans)胰岛或胰腺组织。
63.根据权利要求62所述的构建体，其中所述适体为166-279、173-2273、107-901、1-717、m1-2623、m6-3239或m12-3773。
64.一种将小活化RNA(saRNA)递送到组织的方法，所述方法包括使所述组织与根据权利要求22到63中任一项所述的对所述组织具有特异性的构建体接触。
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